Summary
Deze studie biedt een systematisch geoptimaliseerde procedure van CRISPR/Cas9 ribonuclease-gebaseerde constructie van homozygote sprinkhanenmutanten en een gedetailleerde methode voor cryopreservatie en reanimatie van de sprinkhaneneieren.
Abstract
De treksprinkhaan, Locusta migratoria, is niet alleen een van de wereldwijde pestsprinkhanen die enorme economische verliezen voor de mens veroorzaakten, maar ook een belangrijk onderzoeksmodel voor insectenmetamorfose. Het CRISPR/Cas9-systeem kan nauwkeurig lokaliseren op een specifieke DNA-locus en splitsen binnen de doellocatie, waarbij efficiënt dubbelstrengsbreuken worden geïntroduceerd om doelgen knock-out te induceren of nieuwe genfragmenten in de specifieke locus te integreren. CRISPR/Cas9-gemedieerde genoombewerking is een krachtig hulpmiddel voor het aanpakken van vragen in sprinkhanenonderzoek en een veelbelovende technologie voor sprinkhanenbestrijding. Deze studie biedt een systematisch protocol voor CRISPR / Cas9-gemedieerde gen knock-out met het complex van Cas9-eiwit en single guide RNA's (sgRNA's) in migrerende sprinkhanen. De selectie van doellocaties en het ontwerp van sgRNA worden in detail beschreven, gevolgd door in vitro synthese en verificatie van de sgRNA's. Daaropvolgende procedures omvatten het verzamelen van eiervlotten en scheiding van gelooide eieren om succesvolle micro-injectie met een laag sterftecijfer te bereiken, eikweek, voorlopige schatting van de mutatiesnelheid, sprinkhanenteelt en detectie, behoud en passage van de mutanten om de populatiestabiliteit van de bewerkte sprinkhanen te waarborgen. Deze methode kan worden gebruikt als referentie voor CRISPR/Cas9-gebaseerde genbewerkingstoepassingen bij migrerende sprinkhanen en bij andere insecten.
Introduction
Genbewerkingstechnologieën kunnen worden gebruikt om inserties of deleties in een specifieke genoomlocus te introduceren om het doelgen met doel1 kunstmatig te wijzigen. In de afgelopen jaren heeft de CRISPR/Cas9-technologie zich snel ontwikkeld en heeft een groeiend toepassingsgebied in verschillende gebieden van life sciences 2,3,4,5,6. Het CRISPR/Cas9-systeem werd in 1987 ontdekt7 en wordt op grote schaal aangetroffen in bacteriën en archaea. Verder onderzoek wees uit dat het een prokaryote adaptieve immuunsysteem was dat afhankelijk is van het RNA-geleide nuclease Cas9 om fagen8 te bestrijden. Het kunstmatig gemodificeerde CRISPR/Cas9-systeem bestaat voornamelijk uit twee componenten, een enkel gids-RNA (sgRNA) en het Cas9-eiwit. Het sgRNA bestaat uit een CRISPR-RNA (crRNA) complementair aan de doelsequentie en een aanvullend trans-activerend crRNA (tracrRNA), dat relatief geconserveerd is. Wanneer het CRISPR/Cas9-systeem wordt geactiveerd, vormt het sgRNA een ribonucleoproteïne (RNP) met het Cas9-eiwit en leidt Cas9 naar zijn doellocatie via de baseparing van RNA-DNA-interacties. Vervolgens kan het dubbelstrengs-DNA worden gesplitst door het Cas9-eiwit en als gevolg daarvan ontstaat de dubbelstrengsbreuk (DSB) in de buurt van het protospacer-aangrenzende motief (PAM) van de doellocatie 9,10,11,12. Om de schade veroorzaakt door de DSB's te beperken, zouden cellen uitgebreide DNA-schadereacties activeren om de genomische schade efficiënt te detecteren en de reparatieprocedure te starten. Er zijn twee verschillende reparatiemechanismen in de cel: niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologiegerichte reparatie (HDR). NHEJ is de meest voorkomende reparatieroute die DNA-dubbelstrengsbreuken snel kan repareren en celapoptose kan voorkomen. Het is echter foutgevoelig vanwege het achterlaten van kleine fragmenten van inserties en deleties (indels) in de buurt van de DSB's, wat meestal resulteert in een open leesframeverschuiving en dus kan leiden tot gen knock-out. Homologe reparatie is daarentegen een vrij zeldzame gebeurtenis. Op voorwaarde dat er een reparatiesjabloon is met sequenties die homoloog zijn aan de context van de DSB, zouden cellen af en toe de genomische breuk repareren volgens het nabijgelegen sjabloon. Het resultaat van HDR is dat de DSB nauwkeurig wordt gerepareerd. Vooral als er een extra sequentie is tussen de homologe sequenties in de sjabloon, zouden ze via HDR in het genoom worden geïntegreerd en op deze manier kunnen de specifieke geninvoegingen worden gerealiseerd13.
Met de optimalisatie en ontwikkeling van de sgRNA-structuren en Cas9-eiwitvarianten is het op CRISPR/Cas9 gebaseerde genetische bewerkingssysteem ook met succes toegepast in onderzoek naar insecten, waaronder maar niet beperkt tot Drosophila melanogaster, Aedes aegypti, Bombyx mori, Helicoverpa Armigera, Plutella xylostella en Locusta migratoria 14,15,16,17,18 ,19. Voor zover de auteurs weten, hoewel RNP's bestaande uit het Cas9-eiwit en in vitro getranscribeerd sgRNA zijn gebruikt voor sprinkhanengenoombewerking20,21,22, ontbreekt nog steeds een systematisch en gedetailleerd protocol voor CRISPR / Cas9 ribonuclease gemedieerde constructie van homozygote mutanten van de migrerende sprinkhaan.
De migrerende sprinkhaan is een belangrijke landbouwplaag die een wereldwijde verspreiding heeft en een aanzienlijke bedreiging vormt voor de voedselproductie, vooral schadelijk voor gramineachtige planten, zoals tarwe, maïs, rijst en gierst23. Genfunctieanalyse op basis van genoombewerkingstechnologieën kan nieuwe doelen en nieuwe strategieën bieden voor de bestrijding van migrerende sprinkhanen. Deze studie stelt een gedetailleerde methode voor voor het uitschakelen van migrerende sprinkhanengenen via het CRISPR/Cas9-systeem, inclusief de selectie van doellocaties en het ontwerp van sgRNA's, in vitro synthese en verificatie van de sgRNA's, micro-injectie en kweek van eieren, schatting van de mutatiesnelheid in het embryonale stadium, detectie van mutanten en passage en behoud van de mutanten. Dit protocol kan worden gebruikt als een basale referentie voor manipulatie van de overgrote meerderheid van sprinkhanengenen en kan waardevolle referenties bieden voor genoombewerking van andere insecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Selectie van doellocaties en sgRNA-ontwerp
- Verzamel zoveel mogelijk sequentie-informatie voor het gen van belang door middel van literatuuronderzoek en/of het zoeken naar de mRNA of coderende DNA-sequentie (CDS) van het gen bij NCBI en sprinkhanendatabase24.
- Vergelijk de sequentie van het geïnteresseerde gen met zijn genomische DNA-sequentie om de exon- en intronregio's te onderscheiden.
- Selecteer een kandidaatregio voor het ontwerp van de doelsite op basis van het onderzoeksdoel. Ontwerp primerparen om het fragment van het kandidaat-gebied te versterken en de wild-type sequentie te verifiëren door sequencinganalyse van het PCR-product.
OPMERKING: Er zijn verschillende strategieën voor de selectie van de kandidaat-doelregio. Gebruik bijvoorbeeld in het meeste gen/ eiwitfunctieonderzoek het exonfragment dicht bij het begincodon als het kandidaat-gebied om ervoor te zorgen dat de hele eiwit / RNA-functie verloren gaat na de genoombewerking (d.w.z. gen knock-out). Terwijl voor de functieanalyse van een specifiek domein, selecteert u de kandidaatregio aan het begin (of beide uiteinden) van het domein. - Gebruik online bronnen zoals de E-CRISPDesign 25 om te zoeken naar potentiële doelsites in de doelregio van de kandidaat.
- Selecteer "Drosophila melanogaster BDGP6" (of een ander insect) in de vervolgkeuzelijst met referentiegenomen en kies "Input is FASTA-sequentie" gevolgd door het plakken van de sequentie van het doelgebied in het tekstvak (in FASTA-indeling).
- Start de applicatie door op "Start sgRNA search" te drukken met "medium" en "single design" om de mogelijke doelsites te krijgen. Selecteer 1-3 potentiële doelen uit de resultaten op basis van hun voorspelde scores en ontwerp de bijbehorende sgRNA's dienovereenkomstig.
OPMERKING: Er zijn veel meer online platforms voor CRISPR-ontwerp, zoals CRISPOR, CHOPCHOP, CRISPRdirect, ZiFiT, enzovoort (zie materiaaltabel). Sommigen van hen hebben de functie van specificiteitscontrole voor de soorten waarvan de genomische sequentiegegevens zich in hun databases bevinden. De genomische sequentie van sprinkhanen is echter op geen enkele online website gevonden. Het is beter om meer dan één online tool te gebruiken voor het CRISPR-ontwerp bij sprinkhanen. Overweeg uitgebreid de resultaten van verschillende websites en selecteer het sgRNA uit de resultaten op basis van het principe van de hoogste specificiteit, de hoogste efficiëntie en de minste mismatch-snelheid (figuur 1A, B).
2. Synthese en verificatie van het sgRNA in vitro
- Synthetiseer het sgRNA met behulp van sgRNA-synthesekits volgens de handleiding van de fabrikant (Tabel met materialen). Deze procedure omvat meestal drie stappen: DNA-sjabloonamplificatie, in vitro transcriptie en sgRNA-zuivering21. Verdun het gesynthetiseerde sgRNA met nucleasevrij water tot een opslagconcentratie van 300 ng/μL voor verder gebruik.
- Amplify en zuiver het doelgenfragment om te dienen als substraat van de in vitro splitsingstest van het CRISPR/Cas9-systeem. Voer deze stappen uit volgens de instructies van de fabrikant.
- Verdun het gekochte Cas9-eiwit tot 300 ng / μL met nucleasevrij water. Incubeer 1 μl sgRNA (300 ng/μl) en 1 μl Cas9-eiwit (300 ng/μl) met 200 ng gezuiverd doelfragment in de splitsingsbuffer bij 37 °C gedurende 1 uur (10 μl totaal volume; zie tabel 1). Schat de efficiëntie van sgRNA geïnduceerde Cas9-splitsing door agarosegel-elektroforese (figuur 1C). Selecteer de sgRNA's met hoge activiteit voor de volgende micro-injectie.
OPMERKING: De resultaten van agarosegel-elektroforese kunnen worden omgezet in grijswaardenafbeeldingen met beeldverwerkingssoftware en de splitsingsefficiëntie wordt geschat op basis van de grijswaarden van de banden van gespeculeerde groottes.
3. Micro-injectie en kweek van de eieren
- Bereid de injectienaalden voor door glazen haarvaten te trekken met een micropipettrekker (Table of Materials). Stel de parameters als volgt in: Warmte op 588, Trek op 90, Snelheid op 60 en Tijd op 40. Maal de punt van de injectienaald met een micromolen (Table of Materials).
OPMERKING: Ideale naaldpunten zijn open en scherp (figuur 2A). Het wordt ten zeerste aanbevolen om extra naalden voor de experimenten voor te bereiden, omdat naalden soms worden geblokkeerd of per ongeluk worden gebroken tijdens injecties. - Meng 1 μL Cas9-eiwit (300 ng/μL) met 1 μL van het geverifieerde sgRNA (300 ng/μL) samen om de RNP's voor injectie te verkrijgen. Voeg 8 μL RNase-vrij steriel water toe om het uiteindelijke volume van het mengsel te maken tot 10 μL. Meng de oplossing grondig en houd deze op ijs.
OPMERKING: De uiteindelijke concentraties van het Cas9-eiwit en sgRNA's kunnen worden geoptimaliseerd op basis van de bewerkingsresultaten. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien van de bereide RNP-oplossing en onmiddellijk gebruik wordt aanbevolen. - Kweek de mannelijke en vrouwelijke volwassen sprinkhanen samen bij 30 °C met een 16 (licht):8 (donkere) fotoperiode en geef ze voldoende verse tarwezaailingen als voedsel. Observeer deze sprinkhanen dagelijks en zet een ovipositiepot (een plastic bloempot of beker gevuld met nat steriel zand) in de opfokkooi voor ovipositie zodra de sprinkhanen paren.
OPMERKING: Gewoonlijk zijn 100 paar volwassen sprinkhanen die in een opfokkooi worden grootgebracht (40 cm x 40 cm x 40 cm) voldoende om eieren te genereren voor het uitschakelen van een enkel gen. Kweek extra sprinkhanenparen als er meer eieren nodig zijn. - Verzamel de vers gelegde eidozen uit de ovipositiepot en wacht ongeveer 30 minuten voor het looien van de eieren. Isoleer de eieren voorzichtig van de eidozen in water met een fijne borstel en was ze drie keer met steriel water. Bewaar de eieren in een petrischaaltje en voeg steriel water toe om ze vochtig te houden.
OPMERKING: Het looien van de nieuw gelegde eieren kan de mutantenefficiëntie aanzienlijk verbeteren21. - Vul een injectienaald met de bereide RNP-oplossing en laad deze in de micromanipulator (Tabel met materialen).
- Stel de microinjectieparameters als volgt in: 300 hPa van de injectiedruk (pi), 0,5 s van de injectietijd (ti) en 25 hPa van de compensatiedruk (pc).
- Druk op het pedaal om het volume van de geïnjecteerde oplossing te evalueren. Pas de injectiedruk en injectietijd aan om ervoor te zorgen dat het injectievolume ongeveer 50-100 nL is.
OPMERKING: Zuig de resterende lucht in de naald af om de injectieoplossing zoveel mogelijk continu en controleerbaar te maken. De verbinding van de naald en de micromanipulator moet strak zijn.
- Schik de steriele eieren regelmatig op het injectiekussen (figuur 2B,C) en plaats het kussen op de objecttafel van de microscoop (figuur 3A). Pas de vergroting van de microscoop aan totdat de eieren worden waargenomen. Stel de micro-injectienaald onder de microscoop in totdat de injectiepunt zichtbaar is en plaats deze in de buurt van het te injecteren ei.
- Start de injectie op een geschikte hoogte en een hoek van 30-45 graden. Steek de punt voorzichtig in het ei in de buurt van de micropyles van het ei (figuur 3B) en druk op het pedaal om de injectie te voltooien. Trek de naald snel in en beweeg het injectiekussen voor injectie van het volgende ei.
OPMERKING: Een lichte uitzetting van het ei tijdens de micro-injectie moet worden waargenomen. Een kleine hoeveelheid cytoplasmatische lekkage bij het gaatje is acceptabel. Vervang de injectienaald door een nieuwe of pas de injectiehoek aan als de uitstroom van vloeistof te veel is. - Breng de geïnjecteerde eieren over in een kweekschaal (een petrischaaltje met een stuk vochtig filtreerpapier) en plaats ze in een broedmachine bij 30 °C.
OPMERKING: Het duurt ongeveer 13-14 dagen voordat nimfen uit deze geïnjecteerde eieren komen (op voorwaarde dat mutatie van het doelgen de ontwikkeling van de embryo's niet beïnvloedt) (figuur 3C). Injecteer ten minste 100 eieren om ervoor te zorgen dat er voldoende broed- en eclosiehoeveelheden zijn om een specifiek gen uit te schakelen.
4. Schatting van de mutatiesnelheid en screening van mutanten
- Controleer de ontwikkeling van de geïnjecteerde eieren elke dag na de injectie. Breng geïnjecteerde eieren over naar een nieuwe kweekschaal om de 24 uur in de eerste 5 dagen.
- Op de 6edag ( of later) na injectie, willekeurig 10 eieren plukken en overbrengen in een buis en de eieren adequaat malen met twee stalen ballen op 60 Hz gedurende 6 minuten met behulp van een molen (zie tabel met materialen). Resuspendeer het puin met 1 ml PBS. Breng 5 μL van het mengsel over in 45 μL van 50 mM NaOH en lyseer gedurende 5 minuten bij 95 °C. Voeg 5 μL 1 M Tris-HCl (pH=8,0) toe aan het lysissysteem om de alkalische lysisreactie te beëindigen.
OPMERKING: Eieren kunnen op elke dag na de laatste overdracht worden uitgezocht voor alkalische lyse en meerdere eieren kunnen als één monster worden gebruikt, afhankelijk van hun ontwikkelingssituatie (bijvoorbeeld vijf embryo's van 6 dagen oud kunnen als één monster worden gebruikt en twee embryo's van 10 dagen oud kunnen als één monster worden gebruikt). Soms is het niet haalbaar om het genomische DNA van eieren te krijgen met behulp van de alkalische lysismethode. Commerciële genomische DNA-extractiekits kunnen worden gebruikt als een alternatieve methode voor het isoleren van het genomische DNA uit de eieren. - Neem 1 μL van het lysisproduct als PCR-sjabloon om het doelgenfragment te versterken (tabel 2 en tabel 3) en stuur de PCR-producten voor sequencing. Vergelijk de sequencingresultaten met de wild-type sequentie om voorlopig te evalueren of het CRISPR/Cas9-systeem het doelgen in vivo heeft gesplitst (figuur 4A). Laat de rest van de eieren voor verdere ontwikkeling op voorwaarde dat indels worden gedetecteerd in het embryonale stadium.
OPMERKING: Op deze manier kan de mutatiesnelheid voorlopig worden geschat in het embryostadium. Als er bij deze stap geen indels worden gevonden, bereidt u enkele nieuwe sgRNA's voor het doelgen voor en herhaalt u het knock-outprotocol uit stap 2.1. - Breng de uitgekomen nimfen over naar een opfokkooi en kweek ze zoals beschreven in stap 3.3. Wanneer de nimfen zich ontwikkelden tot het vijfde instarstadium, scheid ze dan met plastic kweekbekers (1 nimf / beker).
OPMERKING: Het duurt meestal ongeveer 25-35 dagen voordat de nimfen zich ontwikkelen tot hun vijfde instar en het meest voor de hand liggende fenotype is dat de vleugelknoppen zich uitstrekken tot de vierde of vijfde buiksegmenten. Bovendien wordt aanbevolen om de fenotypen van dode nimfen vast te leggen om de relatie tussen het doelgen en fenotypen in verder onderzoek te voorspellen. - Knip ongeveer 2 mm lengte van de antennes af met een ontleedschaar en lyseer deze met behulp van de alkalische lysismethode (stap 4.2). Analyseer de doelgenfragmentsequentie van deze nimfen zoals hierboven beschreven (stap 4.3) om de G0-mutanten te identificeren (figuur 4B).
OPMERKING: De antennes die voor lysis worden gesneden, kunnen iets langer zijn en het slijpen of hakken van de antennes is nuttig voor lysis, hoewel de antennes direct kunnen worden verteerd. Individuen met meerdere pieken in de buurt van de doellocatie in het sequencingresultaat worden geïdentificeerd als positieve mutanten en toegestaan voor latere ontwikkeling en paring.
5. Vestiging en doorgifte van mutantenlijnen
- Voer kruisingen uit met behulp van de G 0-mutanten en wild-type sprinkhanen (figuur 4B). Verzamel de oöcysten en incuber deze afzonderlijk bij 30 °C. Gebruik 3-6 ontwikkelde eieren in elke oöcyst om mutaties te detecteren zoals beschreven in stap 4.2 en 4.3. Bewaar mutatie-positieve oöcysten voor de volgende ontwikkeling en verlaat de mutatie-negatieve oöcysten.
OPMERKING: Schatting van de mutatiesnelheid in het embryonale stadium kan de screening vanG-1-mutanten aanzienlijk versnellen. Meestal kunnen 3-6 ontwikkelde eieren worden gemengd als één monster voor PCR-gemedieerde genotypering zoals hierboven beschreven. - Achter de G1 nimfen zoals beschreven in stap 4.4. Snijd ongeveer 2 mm lengte van de antennes af om PCR-gebaseerde genotypering uit te voeren zoals beschreven in stap 4.5 voor het detecteren van G 1-heterozygoten. Voer TA-klonen uit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) om hun mutaties te identificeren. Voer in-cross uit met G 1-heterozygoten met dezelfde mutaties om G2-nimfen te verkrijgen.
OPMERKING: Sanger-sequencing van de PCR-producten kan alleen informatie opleveren voor het achterhalen van de heterozygoten, maar niet genoeg informatie voor het identificeren van de exacte mutaties. Ta-klonen met behulp van de PCR-producten is dus vereist om de mutaties duidelijk te identificeren en kan de oprichting van stabiele mutantlijnen bevorderen. - Fok de G2 nimfen tot hun vijfde instar. Gebruik de PCR-gebaseerde genotypering beschreven in stap 5.2 om de homozygoten en/of heterozygoten te identificeren die geschikt zijn voor verder onderzoek en stabiele passaging (figuur 4B).
OPMERKING: Let op het vermijden van vermenging van homozygoten en heterozygoten. Het wordt aanbevolen om pcr-gebaseerde genotypering uit te voeren in elke generatie om de homozygositeit en / of heterozygositeit van elke populatie te bevestigen. Het aantal sprinkhanen dat voor deze controle wordt gebruikt, is afhankelijk van de populatiegrootte. Bovendien kan de populatie sprinkhanen worden uitgebreid door de in-cross-strategie.
6. Cryopreservatie en reanimatie van eieren
- Was de te cryopreserveren eieren met steriel water en incubeer ze in een kweekschaal zoals hierboven beschreven (stap 3.8) gedurende 5-6 dagen. Verzamel deze eieren samen in de kweekschaal en bedek ze met fragmenten van filterpapier. Wikkel het hele kweekgerecht in met een paraffinefilm.
- Houd de schaal 2 dagen op 25 °C, gevolgd door nog eens 2 dagen op een relatief lagere temperatuur (13-16 °C). Zet de schaal vervolgens over in een koelkast van 6 °C. Voeg er elke 2 weken water aan toe om de eieren een vochtige omgeving te bieden (figuur 5A).
OPMERKING: Er wordt gespeculeerd dat de embryo's zich in het katatrepsisstadium bevinden nadat ze gedurende 5-6 dagen zijn ontwikkeld bij 30 °C26. Gradiëntkoeling is nuttig voor cryopreservatie van eieren (tabel 5). - Voor het reanimeren van de gecryopreserveerde eieren haal je de petrischaal uit de koelkast en bewaar je hem 2 dagen op 25 °C. Leg deze eieren in een broedmachine van 30 °C totdat de nimfen uitkomen (figuur 5B).
OPMERKING: Het is noodzakelijk om de gecryopreserveerde eieren bij 25 °C te plaatsen voordat ze naar een broedmachine van 30 °C worden overgebracht. De embryo's kunnen gedurende ten minste vijf maanden worden gecryopreserveerd, hoewel de uitkomstsnelheid en eclosiesnelheid kunnen afnemen vanwege de cryopreservatie (tabel 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol bevat de gedetailleerde stappen voor het genereren van homozygote mutanten van de migrerende sprinkhanen met de RNP bestaande uit Cas9-eiwit en in vitro gesynthetiseerd sgRNA. Hieronder volgen enkele representatieve resultaten van CRISPR/Cas9-gemedieerde doelgen knock-out bij sprinkhanen, waaronder doelselectie, sgRNA-synthese en -verificatie (figuur 1A), eicelverzameling en -injectie, mutantscreening en -passaging, cryopreservatie en reanimatie van de homozygote eieren.
In deze studie wordt de doellocatie voor het CRISPR/Cas9-systeem geselecteerd op basis van de resultaten van drie online programma's (de E-CRISP, CRISPOR en ZiFit) en in het eerste exon (figuur 1B). Volgens de Cas9-splitsingstest in vitro (tabel 1) kon de CRISPR/Cas9 RNP het PCR-fragment (met de doellocatie) verteren met een splitsingssnelheid van ongeveer 55% (figuur 1C). Vervolgens werd deze RNP gemicro-injecteerd in 120 bevruchte eieren in hun eencellige stadium met behulp van het standaard micro-injectiesysteem (figuur 2 en figuur 3). De sequencingresultaten voor de schatting van de mutatiesnelheid in het embryonale stadium suggereerden efficiënte genoombewerking op de doellocatie (figuur 4A). Verder resulteerde deze studie in een broedpercentage van 52,73% nimf en 66,7% van de G0-volwassenen waren mozaïekmutanten (tabel 4).
Verder werden de G 0-chimaera's gekruist met wild-type sprinkhanen om heterozygote G 1-individuen te verkrijgen en de G 1-heterozygoten met dezelfde mutaties (gescreend door TA-klonen) werden gekruist om de G2-dieren te genereren. PCR-gebaseerde fenotypering werd gebruikt voor het detecteren van mutanten en de verkregen homozygoten werden gekruist om stabiele mutantlijnen vast te stellen (figuur 4B).
Ondertussen werden de overtollige homozygote eieren gecryopreserveerd om de bezettingsgraad van de homozygoten te verbeteren. Hoewel de broedsnelheid van de gecryopreserveerde eieren werd verminderd met de verlenging van de cryopreservatietijd (tabel 5), waren de corrigerende maatregelen, waaronder het aanbrengen van filterpapierfragmenten voor het nat houden van eieren en het herstellen van deze geconserveerde eieren met een gradiënt van stijgende temperatuur, beide nuttig voor de reanimatie (figuur 5 en tabel 5). Ten slotte werd de homozygote populatie van mutanten met succes bewaard voor later onderzoek.
Figuur 1: Ontwerp van het doelwit en in vitro verificatie van het sgRNA. (A) Het stroomdiagram voor doelselectie, sgRNA-synthese en bioactiviteitsverificatie in vitro (inclusief maar niet beperkt tot sprinkhanen). (B) Schematisch diagram van de genstructuur en de doellocatie. De exonen van dit doelgen worden weergegeven als blauwe domeinen en de doellocatie werd stroomafwaarts van het startcodon in exon 1 geselecteerd. De doelvolgorde is rood gemarkeerd. (C) De agarosegel elektroforese resultaat van in vitro Cas9 splitsingstest. Een DNA-fragment met de doelsequentie (ongeveer 400 bp lang) werd versterkt en gebruikt als substraat voor Cas9-vertering. De verwachte kleine banden (ongeveer 100 bp en 300 bp hier; gemarkeerd met rode driehoeken) suggereerden dat het gesynthetiseerde sgRNA effectieve Cas9-splitsing zou kunnen induceren. Het splitsingspercentage was ongeveer 55% volgens de grijswaardenanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Naaldpreparatie en het micro-injectiekussen voor sprinkhaneneieren. (A) Punt van een voorbereide naald voor micro-injectie van sprinkhaneneieren. Schaalbalk: 1 mm. (B) Afbeelding van een micro-injectiepad met eieren (aangegeven met een rode driehoek) erop geplaatst. De schaalbalk vertegenwoordigt 1 cm. (C) De grootte van de micro-injectiepad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Micro-injecties van eieren. (A) Een representatief micro-injectiesysteem gelabeld met rode vakjes die een microscoop (midden) en een micromanipulator (rechts) aangeven die zijn aangesloten op een micro-injector (links). De computer wordt gebruikt voor gegevensopslag en voor het leveren van hulpobservatie. B) Injectie van het sprinkhanenei. De injectieplaats is gemarkeerd met een rode driehoek. (C) Een uitgekomen nimf onder de microscoop. De schaalbalken vertegenwoordigen 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De sequencingresultaten van G 0-dieren en de passaging-strategie van de mutantlijnen. (A) De typische sequencingresultaten in de G0-screening. Meerdere pieken in de buurt van de doellocatie (gemarkeerd met een rode rechthoek in de wild-type sequentie) gaven aan dat het geteste ei / sprinkhaan met succes werd bewerkt door het CRISPR / Cas9-systeem (zoals weergegeven in G 0-1 en G0-2), terwijl het individu zonder enige verandering in het sequencingresultaat werd beschouwd als niet bewerkt en verlaten (bijv. G0-3). (B) De passaging-strategie van de mutantenlijnen. De G0-dieren werden eerst gescreend door PCR-gemedieerde genotypering en degenen met meerdere pieken in hun sequencingresultaten werden gekruist met wildachtige sprinkhanen om de G1-dieren te genereren. PCR-gemedieerde genotypering en TA-klonen werden gebruikt om de G 1-heterozygoten te identificeren. Vervolgens werden heterozygoten met dezelfde mutaties gekruist om de G2-dieren (homozygoten en heterozygoten) te genereren voor verder onderzoek en passaging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Cryopreservatie en reanimatie van eieren. (A) De procedure van cryopreservatie: Isoleer de eieren uit eidozen en incuber ze bij 30 °C gedurende 5-6 dagen na het wassen met steriel water. Verzamel vervolgens de ontwikkelde eieren samen in de petrischaal en bedek ze met kleine stukjes vochtig filterpapier. Wikkel de hele petrischaal in met een paraffinefilm en bewaar deze 2 dagen op 25 °C, gevolgd door nog eens 2 dagen op een relatief lagere temperatuur (bijv. 13-16 °C). Zet het ten slotte in de koelkast bij 6 °C. (B) De procedure van reanimatie: Haal de petrischaaltjes met gecryopreserveerde eieren uit de koelkast en bewaar ze op 25 °C gedurende 2 dagen na het verwijderen van de resten van het filterpapier. Vervolgens kunnen de eieren worden gekweekt voor verdere ontwikkeling bij 30 °C totdat de nimfen uitkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Volume (μL) |
| Cas9 eiwit (300 ng/μL) | 1 |
| sgRNA (300 ng/μL) | 1 |
| PCR-product (200 ng/μL) | 1 |
| 10×NEBuffer r3.1 | 1 |
| Nuclease-vrij water | 6 |
Tabel 1: In vitro vergistingssysteem. 200 ng gezuiverd doelfragment (PCR-product) werd gemengd met het CRISPR/Cas9-systeem (300 ng van elke component) voor het testen van de bio-activiteit van de gesynthetiseerde sgRNA's. Er werd een commerciële buffer gebruikt en nucleasevrij water werd toegevoegd om het totale volume tot 10 μL te maken.
| Reagens | Volume (μL) |
| 2xEs Taq MasterMix | 12.5 |
| Voorwaartse primer | 0.5 |
| Omgekeerde primer | 0.5 |
| Sjabloon (lysisproduct) | 1 |
| Nuclease-vrij water | 10.5 |
Tabel 2: PCR-systeem voor doelgenfragmentamplificatie. Om het genomische fragment van het doelgen te versterken, werd een commerciële Taq-mix gebruikt en werden primers toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. 1 μL van het lysisproduct werd gebruikt als sjabloon en nucleasevrij water werd gebruikt om het totale volume op 25 μL te brengen.
| Temperatuur (°C) | Tijd | Cycli |
| 95 | 5 min | 1 |
| 95 | 30 s | 35 |
| 55 | 30 s | |
| 72 | 40 s | |
| 72 | 10 min | 1 |
Tabel 3: PCR-programma voor doelgenamplificatie. Het PCR-programma voor doelgenamplificatie was: 95 °C gedurende 5 minuten; 35 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 40 s; 72 °C gedurende 10 min.
| Items | Gegevens |
| Aantal geïnjecteerde eieren | 120 |
| Geteste embryo's | 10 |
| Aantal uitgekomen nimfen | 58 |
| Broedsnelheid | 52.73% |
| Aantal G0 volwassenen | 12 |
| Aantal G0 mutanten | 8 |
| Mutatie-efficiëntie bij G0 volwassenen | 66.67% |
Tabel 4: Samenvatting van de bewerkingsefficiëntie. 120 eieren werden geïnjecteerd om het doelgen uit te schakelen en 10 eieren werden genomen voor testen tijdens het embryostadium. 58 nimfen kwamen uit de rest embryo's (het broedpercentage was 52,73%). Ten slotte ontwikkelden 12 G 0-sprinkhanen zich tot het volwassen stadium en 8 van hen werden met succes bewerkt op de doellocatie. Het mutatiepercentage bij G0-volwassenen was 66,67%.
| Controlegroep | Groep 1 | Groep 2 | Groep 3 | Groep 4 | |
| Aantal eieren | 120 | 120 | 120 | 120 | 120 |
| Temperatuurbehandeling voor opslag | 30 °C | 30°C (5-6 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C | 30°C (5-6 d)→25°C (2 d)→13-16°C (2 d)→6 °C |
| Bewaartijd | 14 dagen | 14 dagen | 1 maand | 3 maanden | 5 maanden |
| Temperatuurbehandeling voor reanimatie | 30 °C | 6°C→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C | 6°C→25°C (2 d)→30 °C |
| Aantal uitgekomen sprinkhanen | 108 | 0 | 96 | 86 | 78 |
| Broedsnelheid | 90.00% | 0 | 80.00% | 71.67% | 65.00% |
| Aantal volwassen sprinkhanen | 81 | 0 | 60 | 46 | 31 |
| Eclosiepercentage | 75.00% | 0 | 62.50% | 53.49% | 39.74% |
Tabel 5: Samenvatting van de cryopreservatie en reanimatie van eieren. 600 eieren werden verdeeld in vijf groepen voor cryopreservatie en reanimatieonderzoek. De eerste groep (controle) van 120 eieren werd altijd bij 30 °C bebroed en 14 dagen bewaard. De tweede groep (groep 1) van 120 eieren werd na incubatie bij 30 °C gedurende 5-6 dagen overgebracht naar een koelkast en gedurende 14 dagen bij 6 °C bewaard. Vervolgens werden deze eieren overgebracht naar 30 °C voor reanimatie. De andere groepen (groep 2, groep 3 en groep 4, elke groep bevatte 120 eieren) ondervonden een gradiëntkoeling en herstellende temperatuurbehandeling zoals beschreven in het protocol (stappen 6.1-6.3) met een andere bewaartijd (1 maand voor groep 2, 3 maanden voor groep 3 en 5 maanden voor groep 4). Uiteindelijk kwamen 108 nimfen uit de controlegroep (met een broedsnelheid van 90%) en 81 van hen ontwikkelden zich tot het volwassen stadium (75% van de eclosiesnelheid). In de tweede groep (Groep 1) zijn geen sprinkhanen uitgekomen. De broedsnelheid en eclosiesnelheid van de andere groepen waren lager in vergelijking met de controlegroep en namen af met de opslagtijd. 96 nimfen kwamen uit in groep 2 en 60 van hen ontwikkelden zich tot het volwassen stadium. 86 nimfen kwamen uit in groep 3 en 46 van hen ontwikkelden zich tot het volwassen stadium. In groep 4 kwamen 78 nimfen uit en 31 van hen ontwikkelden zich tot het volwassen stadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sprinkhanen behoren tot de meest verwoestende plagen voor de landbouw sinds de beschaving van de mens23. CRISPR/Cas9-gebaseerde genoombewerkingstechnologie is een krachtig hulpmiddel voor een betere kennis van de biologische mechanismen bij sprinkhanen en een veelbelovende ongediertebestrijdingsstrategie. Het is dus van groot voordeel om een efficiënte en eenvoudig te gebruiken methode van CRISPR / Cas9-gemedieerde constructie van homozygote sprinkhanenmutanten te ontwikkelen. Hoewel er enkele geweldige werken zijn gemeld en een basisworkflow voor genoombewerking bij sprinkhanen 18,20,21,22 hebben geboden, ontbreekt het nog steeds aan een systematische optimalisatie van de hele procedure. Over het algemeen kan de homozygote sprinkhanenmutant die wordt gegenereerd door embryonale injectie van het CRISPR / Cas9-systeem worden onderverdeeld in drie belangrijke stappen: a) sgRNA-ontwerp, synthese en screening in vitro, b) eicelverzameling, -bereiding en -injectie; en c) mutantenscreening en homozygootbehoud. Dit protocol biedt een geoptimaliseerde workflow en de stappen van doellocatieselectie, in vitro sgRNA-screening, micro-injectie van de eieren en het detecteren van mutanten zijn vooral van cruciaal belang voor het effectief genereren van homozygote mutante sprinkhanen met het CRISPR / Cas9-systeem.
Ten eerste zijn de doellocatie, de vorm van corresponderend sgRNA en de concentratie van sgRNA gesuggereerd als de kritische factoren voor genoombewerkingsefficiëntie bij insecten18,27,28. Om dit probleem op te lossen, wordt aanbevolen om eerst de genstructuur te analyseren en meer dan één doelsite op exon 1 of in de buurt van het startcodon te ontwerpen met behulp van de online bronnen. Synthetiseer vervolgens sgRNA in vitro en meng het met Cas9-eiwit in verschillende concentraties om de snij-efficiëntie van RNP te optimaliseren. Deze procedure zal helpen om een sgRNA met hoge bioactiviteit te identificeren en de samenstelling van het RNP-complex voor het kandidaat-doelgen te optimaliseren.
Ten tweede zijn het verzamelen van zoveel mogelijk verse eieren in een beperkte tijd en het verbeteren van de broedsnelheid en mutatiesnelheid ook grote uitdagingen voor genoombewerkingsoperaties. De volwassen sprinkhanen die worden grootgebracht met de conditie van 16 (licht): 8 (donkere) fotoperiode worden gebruikt voor het verzamelen van voldoende eieren in een korte periode van 9:00-11:00 uur. Het is belangrijk om voorzichtig neerwaartse druk uit te oefenen tussen de eieren met behulp van een penseel of pincet om de eieren voorzichtig van de peul te isoleren. Met voldoende oefening kunnen meerdere gebruikers op betrouwbare wijze individuele eieren van de peul scheiden. Nadat elk ei is geïsoleerd en gewassen met steriel water, worden de eieren uitgelijnd op de ontworpen injectiepads (figuur 2B, C) om de eieren tijdens micro-injectie te stabiliseren. Het ei wordt geïnjecteerd met de geoptimaliseerde RNP in de buurt van de micropyles. Om de mechanische schade te beperken en de vervuiling van eieren te minimaliseren, mogen verse eieren ongeveer 30 minuten in de peulen blijven om ervoor te zorgen dat het looien van de eierschaal ideaal is voor micro-injectie21, vanwege de gecondenseerde structuur en het hoge verdedigingsvermogen bij invasie na voldoende bruining 29,30. Ondertussen gaf een gepubliceerd rapport aan dat de syncytiele deling31 van sprinkhaneneieren op een bepaald moment tussen 0 h en 4 h na het leggen plaatsvindt. Met het huidige standaard micro-injectieprotocol kan injectie van ongeveer 100 eieren binnen 40 minuten worden bereikt. Alles bij elkaar genomen kan de procedure van looien en micro-injectie van 100 bevruchte eieren binnen 2 uur worden voltooid. Er is dus nog minstens 2 uur over voor CRISRP/Cas9-gemedieerde splitsing en het herstel van doelgenen om een efficiënte mutatie in de geïnjecteerde eieren en toekomstige volwassen sprinkhanen te bereiken.
Ten slotte zijn effectieve strategieën voor passaging en mutantidentificatie belangrijk voor het genereren van homozygoten bij de meeste gemuteerde dieren. Bij sprinkhanen, voor genen die na bewerking niet-dodelijk zijn, is de hier voorgestelde kruisstrategie dat G 0-mutanten kruisen met breed-type sprinkhanen en verdere in-kruisingen kunnen worden uitgevoerd met behulp van de G1-heterozygoten met dezelfde mutaties om homozygote mutanten te genereren in de volgende generatie. Om de mutatie in elke sprinkhaan tijdens het mutante overervingsproces te verifiëren, wordt aanbevolen om de alkalische lysismethode te gebruiken om een kort segment antennes te verteren als sjabloon voor PCR-gebaseerde genotypering. Gebruik ten slotte de verkregen homozygote volwassenen voor verdere in-cross om de populatie uit te breiden. Beperkt door de populatiegrootte en de verschillen in ontwikkelingsstadium tussen homozygote sprinkhanen, worden de overtollige eieren aanbevolen voor cryopreservatie bij 6 °C en reanimatie door gradiënttemperatuurstijging (figuur 5), die is gebaseerd op het principe van diapause bij lage temperatuur en diapause-afgifte bij hoge temperatuur van migrerende sprinkhaneneieren32,33.
Kortom, het CRISPR/Cas9-systeem heeft bewezen een betrouwbaar hulpmiddel te zijn voor het vergemakkelijken van de studie van functionele genomica van migrerende sprinkhanen. Dit gedetailleerde protocol kan worden gebruikt als referentie voor CRISPR/Cas9-gebaseerde genbewerkingstoepassingen bij migrerende sprinkhanen en bij andere insecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32070502, 31601697, 32072419 en de China Postdoctoral Science Foundation (2020M672205).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×NEBuffer r3.1 | New England Biolabs | B7030S | The buffer of in vitro Cas9 cleavage assays |
| 2xEs Taq MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0690 | For gene amplification |
| 2xPfu MasterMix (Dye) | Cwbio | CW0686 | For gene amplification |
| CHOPCHOP | Online website for designing sgRNAs, http://chopchop.cbu.uib.no/. | ||
| CRISPOR | Online website for designing sgRNAs, http://crispor.org. | ||
| CRISPRdirect | Online website for designing sgRNAs, http://crispr.dbcls.jp/. | ||
| Electrophoresis power supply | LIUYI BIOLOGY | DYY-6D | Separation of nucleic acid molecules of different sizes |
| Eppendorf Tube | Eppendorf | 30125177 | For sample collection, etc. |
| Fine brushes | Annigoni | 1235 | For cleaning and isolating eggs. Purchased online. |
| Flaming/brown micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | For making the microinjection needles |
| Gel Extraction Kit | Cwbio | CW2302 | DNA recovery and purification |
| Gel Imaging Analysis System | OLYMPUS | Gel Doc XR | Observe the electrophoresis results |
| GeneTouch Plus | Bioer | B-48DA | For gene amplification |
| Glass electrode capillary | Gairdner | GD-102 | For making injection needles with a micropipette Puller |
| Incubator | MEMMERT | INplus55 | For migratory locust embryo culture |
| Metal bath | TIANGEN | AJ-800 | For heating the sample |
| Micro autoinjector | Eppendorf | 5253000068 | Microinjection of embryos early in development |
| Micro centrifuge | Allsheng | MTV-1 | Used for mixing reagents |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | To ground the tip of injection needle |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | For loading solutions into the injection needles. |
| Micromanipulation system | Eppendorf | TransferMan 4r | An altinative manipulation system for microinjection |
| Microscope | cnoptec | SZ780 | For microinjection |
| Motor-drive Manipulator | NARISHIGE | MM-94 | For controling the position of the micropipette during the microinjection precedure |
| Multi-Sample Tissue Grinder | jingxin | Tissuelyser-64 | Grind and homogenize the eggs |
| ovipisition pot | ChangShengYuanYi | CS-11 | Filled with wet sterile sand for locust ovipositing in it. The oocysts are collected from this container. Purchased online. |
| Parafilm | ParafilmM | PM996 | For wrapping the petri dishes. |
| pEASY-T3 Cloning Kit | TransGen Biotech | CT301-01 | For TA cloning |
| Petri dish | NEST | 752001 | For culture and preservation of the eggs. |
| Pipettor | Eppendorf | Research plus | For sample loading |
| plastic culture cup | For rearing locusts seperately and any plastic cup big enough (not less than 1000 mL in volume) will do. Purchased online. | ||
| Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Primer Premier | PREMIER Biosoft | Primer Premier 5.00 | For primer design |
| SnapGene | Insightful Science | SnapGene®4.2.4 | For analyzing sequences |
| Steel balls | HuaXinGangQiu | HXGQ60 | For sample grinding.Purchased online. |
| Tips | bioleaf | D781349 | For sample loading |
| Trans DNA Marker II | TransGen Biotech | BM411-01 | Used to determine gene size |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo | A36496 | Cas9 protein |
| UniversalGen DNA Kit | Cwbio | CWY004 | For genomic DNA extraction |
| VANNAS Scissors | Electron Microscopy Sciences | 72932-01 | For cutting off the antennae |
| Wheat | To generate wheat seedlings as the food for locusts. Bought from local farmers. | ||
| ZiFiT | Online website for designing sgRNAs, http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx. |
References
- Doudna, J. A. The promise and challenge of therapeutic genome editing. Nature. 578 (7794), 229-236 (2020).
- van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O. J., Murthy, N., Schaffer, D. V. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology. 38 (7), 845-855 (2020).
- McCarty, N. S., Graham, A. E., Studena, L., Ledesma-Amaro, R. Multiplexed CRISPR technologies for gene editing and transcriptional regulation. Nature Communications. 11 (1), 1281 (2020).
- Manghwar, H., et al. CRISPR/Cas systems in genome editing: Methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects. Advanced Science. 7 (6), 1902312 (2020).
- Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology. 38 (7), 824-844 (2020).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., Nakata, A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 169 (12), 5429-5433 (1987).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa Armigera (Hubner). Journal of Visualized Experiments: JoVE1. (173), e62068 (2021).
- Huang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of the abdominal-A homeotic gene in the global pest, diamondback moth (Plutella xylostella). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 75, 98-106 (2016).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Xu, X., et al. BmHpo mutation induces smaller body size and late stage larval lethality in the silkworm, Bombyx mori. Insect Science. 25 (6), 1006-1016 (2018).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 60 (2018).
- Zhang, T., et al. Egg tanning improves the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated mutant locust production by enhancing defense ability after microinjection. Journal of Integrative Agriculture. 20 (10), 2716-2726 (2021).
- Guo, X., et al. 4-Vinylanisole is an aggregation pheromone in locusts. Nature. 584 (7822), 584-588 (2020).
- Zhang, L., Lecoq, M., Latchininsky, A., Hunter, D.
- Yang, P., Hou, L., Wang, X., Kang, L. Core transcriptional signatures of phase change in the migratory locust. , Available from: http://www.locustmine.org:8080/locustmine (2019).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. , Available from: http://www.e-crisp.org/E-CRISP/ (2014).
- Pétavy, G. Origin and development of the vitellophags during embryogenesis of the migratory locust, Locusta migratoria L. (Orthoptera : Acrididae). International Journal of Insect Morphology and Embryology. 14 (6), 361-379 (1985).
- Barry, S. K., et al.
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome editing in the cricket, Gryllus bimaculatus. Methods in Molecular Biology. 1630, 219-233 (2017).
- Du, M. H., et al. Suppression of Laccase 2 severely impairs cuticle tanning and pathogen resistance during the pupal metamorphosis of Anopheles sinensis (Diptera: Culicidae). Parasites & Vectors. 10 (1), 171 (2017).
- Eisner, T., Shepherd, J., Happ, G. M. Tanning of grasshopper eggs by an exocrine secretion. Science. 152 (3718), 95-97 (1966).
- Ho, K., Dunin-Borkowski, O. M., Akam, M. Cellularization in locust embryos occurs before blastoderm formation. Development. 124 (14), 2761-2768 (1997).
- Wang, X., et al. Interactive effect of photoperiod and temperature on the induction and termination of embryonic diapause in the migratory locust. Pest Managment Science. 77 (6), 2854-2862 (2021).
- Jarwar, A. R., et al. Comparative transcriptomic analysis reveals molecular profiles of central nervous system in maternal diapause induction of Locusta migratoria. G3-Genes Genomes Genetics. 9 (10), 3287-3296 (2019).
