Summary
L’infection de Caenorhabditis elegans par le parasite microsporidien Nematocida parisii permet aux vers de produire une progéniture très résistante au même agent pathogène. C’est un exemple d’immunité héréditaire, un phénomène épigénétique mal compris. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité héréditaire dans un modèle de ver génétiquement traitable.
Abstract
L’immunité héréditaire décrit comment certains animaux peuvent transmettre la « mémoire » d’une infection antérieure à leur progéniture. Cela peut augmenter la résistance aux agents pathogènes dans leur progéniture et favoriser la survie. Bien que l’immunité héréditaire ait été rapportée chez de nombreux invertébrés, les mécanismes sous-jacents à ce phénomène épigénétique sont largement inconnus. L’infection de Caenorhabditis elegans par l’agent pathogène microsporidien naturel Nematocida parisii entraîne la production d’une progéniture robuste aux microsporidies. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité intergénérationnelle dans le modèle d’infection simple et génétiquement traitable de N. parisii -C. elegans . L’article actuel décrit les méthodes permettant d’infecter C. elegans et de générer une progéniture immuno-amorcée. Des méthodes sont également données pour mesurer la résistance à l’infection par microsporidies en colorant les microsporidies et en visualisant l’infection par microscopie. En particulier, l’immunité héréditaire empêche l’invasion des cellules hôtes par les microsporidies, et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) peut être utilisée pour quantifier les événements d’invasion. La quantité relative de spores de microsporidies produites dans la progéniture immuno-amorcée peut être quantifiée en colorant les spores avec un colorant liant la chitine. À ce jour, ces méthodes ont mis en lumière la cinétique et la spécificité pathogène de l’immunité héréditaire, ainsi que les mécanismes moléculaires qui la sous-tendent. Ces techniques, ainsi que les nombreux outils disponibles pour la recherche sur C. elegans , permettront d’importantes découvertes dans le domaine de l’immunité héréditaire.
Introduction
L’immunité héréditaire est un phénomène épigénétique par lequel l’exposition parentale à des agents pathogènes peut permettre la production d’une progéniture résistante aux infections. Ce type de mémoire immunitaire a été démontré chez de nombreux invertébrés qui manquent de système immunitaire adaptatif et peuvent protéger contre les maladies virales, bactériennes etfongiques 1. Bien que l’immunité héréditaire ait des implications importantes pour la compréhension de la santé et de l’évolution, les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette protection sont largement inconnus. Cela s’explique en partie par le fait que bon nombre des animaux chez lesquels l’immunité héréditaire a été décrite ne sont pas des organismes modèles établis pour la recherche. En revanche, les études sur le nématode transparent Caenorhabditis elegans bénéficient d’une vaste boîte à outils génétique et biochimique 2,3, d’un génome hautement annoté 4,5 et d’un court temps de génération. En effet, la recherche sur C. elegans a permis des avancées fondamentales dans les domaines de l’épigénétique et de l’immunité innée 6,7, et c’est maintenant un modèle établi pour l’étude de la mémoire immunitaire 8,9.
Les microsporidies sont des agents pathogènes fongiques qui infectent presque tous les animaux et provoquent des infections mortelles chez les humains immunodéprimés10. L’infection commence lorsqu’une spore de microsporidie injecte ou « déclenche » son contenu cellulaire (sporoplasme) dans une cellule hôte à l’aide d’une structure appelée tube polaire. La réplication intracellulaire du parasite entraîne la formation de méronts, qui se différencient finalement en spores matures qui peuvent sortir de la cellule11,12. Bien que ces parasites nuisent à la fois à la santé humaine et à la sécurité alimentaire, il reste encore beaucoup à apprendre sur la biologie de leur infection12. Nematocida parisii est un microsporidien naturel qui se réplique exclusivement dans les cellules intestinales des vers, entraînant une réduction de la fécondité et, finalement, la mort. Le modèle d’infection à N. parisii -C. elegans a été utilisé pour montrer : (1) le rôle de l’autophagie dans la clairance des agents pathogènes13, (2) comment les microsporidies peuvent sortir des cellules infectées de manière non lytique14, (3) comment les agents pathogènes peuvent se propager de cellule en cellule en formant une syncytie15, (4) les protéines que N. parisii utilise pour interagir avec son hôte16, et (5) la régulation de la réponse interne à l’agent pathogène transcriptionnel (DPI)17, 18.
Les protocoles pour l’infection de C. elegans sont décrits dans les travaux actuels et peuvent être utilisés pour révéler la biologie unique des microsporidies et disséquer la réponse de l’hôte à l’infection. La microscopie de vers fixes colorés avec le colorant liant la chitine Direct Yellow 96 (DY96) montre la propagation de l’infection des spores de microsporidies contenant de la chitine dans tout l’intestin. La coloration DY96 permet également la visualisation d’embryons de vers contenant de la chitine pour l’évaluation simultanée de la gravidité des vers (capacité à produire des embryons) en tant que lecture de l’aptitude de l’hôte.
Des travaux récents ont révélé que C. elegans infecté par N. parisii produit une progéniture robustement résistante à la même infection19. Cette immunité héréditaire dure une seule génération et dépend de la dose, car la progéniture de parents plus fortement infectés est plus résistante aux microsporidies. Fait intéressant, la progéniture amorcée par N. parisii est également plus résistante à l’agent pathogène intestinal bactérien Pseudomonas aeruginosa, bien qu’elle ne soit pas protégée contre l’agent pathogène naturel Orsay virus19. Les présents travaux montrent également que la progéniture immuno-amorcée limite l’invasion des cellules hôtes par les microsporidies. La méthode décrit également la collection de descendants immuno-amorcés et comment FISH peut être utilisé pour détecter l’ARN de N. parisii dans les cellules intestinales afin de tester l’invasion des cellules hôtes et le déclenchement des spores20.
Ensemble, ces protocoles fournissent une base solide pour l’étude des microsporidies et de l’immunité héréditaire chez C. elegans. On espère que les travaux futurs dans ce système modèle permettront d’importantes découvertes dans le domaine naissant de l’immunité héréditaire. Ces techniques sont également susceptibles d’être des points de départ pour étudier l’immunité héréditaire induite par les microsporidies chez d’autres organismes hôtes.
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Protocol
La présente étude utilise la souche N2 bristol de type sauvage C. elegans cultivée à 21 °C.
1. Préparation des supports
- Préparer les médias M9 conformément au rapport précédent21,22.
- Préparer le milieu de croissance des nématodes (NGM) conformément au rapport précédent21,22. Versez 12 mL de NGM par plaque de 6 cm ou 30 mL par plaque de 10 cm.
- Préparer la souche OP50-1 d’Escherichia coli selon un rapport précédent23.
- Préparez les plaques de NGM ensemencées OP50-1 en suivant les étapes ci-dessous.
- Remettre en suspension 10x OP50-1 concentré par vortex.
- Utilisez une pipette à répéteur pour ensemencer les plaques au centre. Pour les plaques de 6 cm et 10 cm, semez un volume de 200 μL ou 500 μL, respectivement.
- Pour les plaques de 10 cm, utilisez un épandeur de verre pour répandre l’OP50-1 et créer une pelouse de bactéries. Ne propagez pas les bactéries jusqu’au bord même de la plaque.
REMARQUE: L’éthanol trempe et enflamme l’épandeur toutes les cinq plaques pour assurer la stérilité. Laissez l’épandeur refroidir pendant quelques secondes avant de se propager pour éviter de tuer les bactéries. - Laissez les assiettes à température ambiante pendant 2 jours pour sécher et assurer la croissance de la pelouse bactérienne.
REMARQUE: Les plaques ensemencées peuvent être conservées à température ambiante pendant 2-3 semaines ou à 4 ° C jusqu’à 1 mois.
2. Entretien de C. elegans
- Maintenir les vers sur une source de nourriture bactérienne constante sur les plaques de NGM op50-1.
REMARQUE: La famine peut entraîner des phénotypes intergénérationnels, ce qui peut affecter les résultats. Une plaque op50-1-seeded de 10 cm supporte 2 500 L1s (le stade larvaire le plus précoce de C. elegans) jusqu’à 72 h. - Si les vers meurent de faim, grandissez pendant trois générations sur OP50-1 avant d’utiliser les vers pour des expériences.
3. Synchronisation des populations de C. elegans à l’aide d’hypochlorite de sodium (blanchiment)
REMARQUE: Cette étape est très sensible au temps, alors assurez-vous que la centrifugeuse est disponible avant de commencer. D’autres protocoles de blanchiment moins rapides sont disponibles dans la littérature et peuvent être utilisés si vous préférez. Pour éviter que l’hypochlorite de sodium à 6 % ne perde de son activité au fil du temps, conservez le réactif dans l’obscurité à 4 °C et conservez-le jusqu’à 1 an.
- Préparer 2 mL de solution d’eau de Javel pour chaque échantillon en mélangeant 400 μL de 1 M NaOH, 250 μL d’hypochlorite de sodium à 6 % (voir tableau des matériaux) et 1350 μL d’eau distillée.
- Lavez les vers adultes (~72 h après l’éclosion) des plaques dans un tube de microcentrifugation à l’aide de 1 mL de milieu M9.
REMARQUE: S’il reste de nombreux vers sur les plaques, abattez les vers par centrifugation à 1 400 x g pendant 30 s à température ambiante, retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et effectuez des lavages de plaque supplémentaires. - Centrifuger à 1 400 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les vers, puis laver 2x avec 1 mL de milieu M9 pour éliminer les bactéries.
- Retirez le surnageant, ajoutez 1 mL de la solution d’eau de Javel préparée (étape 3.1.) et réglez une minuterie pendant 1 min. Inverser les tubes 3-4x.
REMARQUE: Sous un microscope optique, les vers peuvent être vus pour arrêter de battre. - Après 1 min, centrifuger à 3 000 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les vers, puis retirer le surnageant et ajouter 1 mL de solution d’eau de Javel fraîche.
- Surveillez de près le(s) tube(s) au microscope optique pour visualiser les carcasses de vers qui s’ouvrent et libèrent des embryons. Passez immédiatement à l’étape suivante lorsque ~ 50% à 80% des carcasses se sont ouvertes et que de nombreux embryons ont été libérés.
REMARQUE: Selon le nombre d’animaux et la souche de ver, cette étape peut prendre de 15 s à 4 min. Pour des raisons inconnues, les vers infectés par N. parisii mettent souvent plus de temps à blanchir que les animaux non infectés. - Centrifuger à 3 000 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les embryons, puis laver 3x dans 1 mL de milieu M9.
REMARQUE: Les lavages diluent la solution résiduelle d’hypochlorite des tubes et doivent être effectués rapidement pour s’assurer que la solution d’eau de Javel n’endommage pas les embryons. - Ajouter 1 mL de milieu M9 à la pastille finale et transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 4 mL de milieu M9. Suspendre les embryons dans un volume final de 5 mL.
- Faire tourner les tubes sur un rotor mécanique (voir Tableau des matériaux) à 21 °C pendant 18-24 h pour faire éclore les embryons en L1.
REMARQUE: Comme N. parisii infecte l’intestin du ver et n’envahit pas la lignée germinale, les parents infectés ne transmettent pas l’infection à leur progéniture par transmission verticale19. Le blanchiment des adultes infectés synchronise les animaux F1 et détruit les spores de N. parisii , garantissant ainsi que la progéniture F1 n’est pas infectée par les spores transmises par les parents. - Centrifugez les tubes pendant 1 min à 1 800 x g à température ambiante pour granuler les L1, et jetez tout sauf 1 mL du surnageant.
- Pipette 1-5 μL de mélange L1 sur une plaque NGM non ensemencée, et compter immédiatement le nombre de L1 dans la gouttelette en visualisant au microscope optique. Répétez 3x et faites la moyenne des comptes pour déterminer la concentration et le nombre total de L1.
REMARQUE: La majorité des embryons doivent être éclos et les L1 doivent se déplacer rapidement dans la gouttelette liquide. S’il reste une grande proportion d’embryons non éclos et de L1 léthargiques (lents), cela indique un blanchiment trop long.
4. Préparation des spores de N. parisii
- Préparer les spores de N. parisii en suivant les références précédemment publiées19,24.
5. Infection de C. elegans par N. parisii pour donner une progéniture immuno-amorcée
- Un jour avant les infections planifiées, déplacez le nombre requis de plaques NGM non ensemencées de 10 cm de 4 °C à température ambiante.
- Immédiatement avant l’infection, centrifugez environ 2 500 vers L1 synchronisés à 1 400 x g pendant 30 s à température ambiante dans un tube de microcentrifugation pour granuler les vers. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette pour laisser les vers dans environ 50 μL de milieu M9.
- Ajouter 1 mL de 10x OP50-1 aux spores L1s et N. parisii à la concentration souhaitée (généralement ~ 2,5 millions de spores). Comme témoin non infecté, préparer un tube équivalent de L1s et OP50-1 avec un volume de milieu M9 équivalent au volume de préparation de spores utilisé.
REMARQUE: Pour obtenir une progéniture immuno-amorcée, utilisez une dose de spores suffisamment élevée pour que >90% des animaux soient infectés par 72 h (mesurée par la coloration DY96, étape 7), mais suffisamment faible pour que >80% des animaux soient encore gravides. Cela garantit que la plupart des enfants proviennent de parents infectés et que le blanchiment des parents donne suffisamment d’embryons pour les tests F1. Bien que les préparations de spores varient en concentration et en infectiosité, une dose parentale appropriée est généralement comprise entre 5 et 15 μL de préparation de spores (~ 2,5 millions de spores) par plaque de 10 cm. - Vortex brièvement pour mélanger et plaquer les 1 mL de vers ci-dessus sur une plaque NGM non ensemencée de 10 cm. Tourbillonnez pour vous assurer que le liquide se répand sur toute la plaque.
- Sécher les plaques dans une armoire propre avec les couvercles enlevés pendant 10-20 min ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches, avant d’incuber à 21 °C pendant 72 h.
- À 72 h après l’infection (HPI), laver les vers des plaques dans un tube de microcentrifugation à l’aide de 1 mL de milieu M9. S’il reste de nombreux vers sur les plaques, abattez les vers par centrifugation à 1 400 x g pendant 30 s, retirez le surnageant et effectuez des lavages supplémentaires des plaques.
- Centrifuger à 1 400 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les vers, laver 2x avec 1 mL de milieu M9 ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Remettre en suspension dans un volume final de 1 mL de support M9.
- Pipetter de haut en bas pour mélanger, puis transférer 100 μL des vers en suspension dans un tube frais.
REMARQUE: Cet échantillon d’environ 250 adultes peut ensuite être réparé et coloré pour déterminer l’aptitude du ver parental et l’état d’infection, comme décrit à l’étape 7 et au début de l’étape 3. - Pour briser les vers adultes et libérer les embryons F1 pour les tests, blanchissez les 900 μL restants de vers en suspension, comme décrit à l’étape 3.
REMARQUE: Cette étape détruit également toutes les spores de N. parisii avant les tests d’infection ultérieurs.
6. Test de l’immunité héréditaire à N. parisii chez C. elegans
- Effectuez les infections comme décrit aux étapes 5.1.-5.6., avec les modifications mentionnées ci-dessous.
REMARQUE: Les tests d’infection sur les F1 peuvent être réduits et effectués sur des plaques NGM de 6 cm en utilisant ~ 1 000 vers L1 et 400 μL de 10x OP50-1. Une dose « élevée » de spores doit également être utilisée, de sorte que ~ 100% des F1 naïfs (c’est-à-dire des vers de parents non infectés) sont infectés et que seulement ~ 10% des F1 naïfs sont gravides. Bien que les préparations de spores varient en concentration et en infectiosité, une dose appropriée est généralement comprise entre 5 et 15 μL (~ 2,5 millions de spores) par plaque de 6 cm. - À 72 hpi, fixez et colorez pour déterminer l’aptitude du ver et l’état d’infection, comme décrit à l’étape 7.
7. Coloration DY96 de C. elegans pour visualiser les embryons et les spores de microsporidies
REMARQUE: DY96 est un colorant fluorescent vert liant la chitine qui colore les embryons de vers et les parois des spores de microsporidies 19,15,25. Cela permet une surveillance simultanée de l’état d’aptitude et d’infection des vers.
- Laver les vers des plaques dans un tube de microcentrifugation à l’aide de 1 mL de milieu M9 contenant 0,1 % de Tween-20. S’il reste de nombreux vers sur les plaques, abattez les vers par centrifugation à 1 400 x g pendant 30 s à température ambiante, retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et effectuez des lavages de plaque supplémentaires.
- Centrifuger à 1 400 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les vers, et laver 2x avec 1 mL de milieu M9 contenant 0,1% de Tween-20 ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair.
- Retirez le surnageant, ajoutez 700 μL d’acétone et laissez les vers se fixer à température ambiante pendant 10 min.
REMARQUE: À ce stade, les vers peuvent être stockés à -20 ° C pour être traités jusqu’à plusieurs mois plus tard, si vous le souhaitez. - Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les vers fixes, et laver 2x avec 1 mL de PBS contenant 0,1% de Tween-20 (PBST).
- Préparer 50 mL de solution de travail DY96 : PBST, 0,1 % (v/v) de dodécylsulfate de sodium (FDS) et 20 μg/mL DY96 (à partir d’une solution mère de 5 mg/mL dans de l’eau distillée) (voir tableau des matériaux). Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium et rangez-le dans un tiroir pour éviter toute exposition à la lumière.
REMARQUE: Le stock DY96 et les solutions de travail peuvent être stockés pendant >1 an à température ambiante s’ils sont conservés dans l’obscurité. - Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les vers et éliminer le surnageant. Ajouter 500 μL de solution de travail DY96 à la pastille et faire pivoter pendant 30 min à température ambiante.
- Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s à température ambiante pour granuler les vers. Retirez le surnageant et ajoutez 15 μL du support de montage avec/sans DAPI (voir Tableau des matériaux).
- Pipette 10 μL de la solution contenant des vers colorés sur une lame de microscope et placer un couvercle sur le dessus.
REMARQUE: Les lames et les échantillons supplémentaires peuvent être stockés à 4 ° C dans l’obscurité pour un stockage à long terme.
8. Imagerie et analyse des vers tachés DY96 pour évaluer l’aptitude des vers et l’état d’infection
- Pour analyser les vers tachés DY96 (montés sur des lames, comme à l’étape 7.8.), effectuez une imagerie à l’aide du canal GFP d’un microscope à fluorescence.
- Pour déterminer l’aptitude des populations de vers, utilisez un objectif 5x ou 10x pour mesurer la gravidité des vers >100 par condition.
REMARQUE: Les vers porteurs d’embryons ≥1 sont considérés comme gravides. Les compteurs de cellules mécaniques peuvent aider à minimiser les erreurs humaines lors du comptage. Les embryons de vers sont moins colorés (moins fluorescents) que les spores de microsporidies19. Les embryons sont ovoïdes, ~50 μm x ~30 μm, et se trouvent dans le milieu du corps des adultes en bonne santé de C. elegans . Des adultes en bonne santé et non infectés portent 10 à 20 embryons organisés en rangées le long de leur corpssur toute la longueur 26. - Pour révéler des différences plus subtiles dans la condition physique, effectuez des comptages d’embryons. Pour cela, comptez manuellement le nombre d’embryons dans 20 à 30 vers individuels par condition.
- Pour déterminer à quel point les populations de vers sont infectées, utilisez un objectif 5x-40x pour évaluer le statut infectieux de >100 vers par condition. Les vers comprenant un nombre quelconque de spores intestinales intracellulaires sont considérés comme infectés.
REMARQUE: Les spores de microsporidies sont plus brillantes que les embryons de vers. Les spores en forme de haricot de N. parisii sont ~2,2 μm x ~0,8 μm et sont produites dans les cellules intestinales du ver à partir de ~48 hpi15. Les vers chez lesquels les spores sont observées exclusivement dans la lumière intestinale et non le long des parois intestinales ne sont pas considérés comme infectés19. En effet, ces spores représentent probablement des spores nouvellement ingérées qui ne résultent pas d’une infection de l’individu. - À l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir tableau des matériaux), quantifiez la charge parasitaire et la taille des vers en suivant les étapes ci-dessous.
- Image 20-30 vers montés sur des lames de microscope à l’aide d’un stéréoscope vertical fluorescent pour chaque échantillon. Capturez des images dans les canaux Brightfield, DAPI et GFP. Choisissez une exposition appropriée dans le canal GFP de sorte que la fluorescence dans les échantillons les plus infectés ne soit pas saturée.
REMARQUE: L’infection peut toujours être visualisée dans les échantillons les moins infectés. Les images sont généralement prises à l’aide d’un objectif 5x. - Ouvrez les fichiers dans FIJI/ImageJ. Selon le type de fichier, le plug-in Bio-Formats Importer peut être nécessaire pour ouvrir des images dans ImageJ.
- Décrivez 20 à 30 vers individuels dans des images à l’aide d’images en fond clair ou DAPI et l’outil Sélections de polygones dans la barre d’outils. Enregistrez chaque plan avec Analyser > Outils > Gestionnaire de régions d’intérêt (ROI) dans le menu déroulant en cliquant sur Ajouter [t]. Dessinez les animaux qui sont entièrement visibles dans le cadre.
REMARQUE : Les contours de ver peuvent être revisités ultérieurement en enregistrant le fichier avec les contours en tant que Tiff. - Cliquez sur Désélectionner dans le gestionnaire de retour sur investissement pour supprimer tous les contours de l’image et cliquez sur Image > Dupliquer dans le menu déroulant. Tapez le numéro correspondant au canal d’intérêt dans la zone « Canaux » pour dupliquer le canal GFP pour la charge parasitaire (par exemple, 2).
- Seuilr ce canal à l’aide de l’image > Ajuster > Seuil à un niveau auquel la charge parasitaire brillante est capturée, mais pas la fluorescence plus faible des embryons de vers, puis cliquez sur Appliquer. Prenez note des valeurs seuils appliquées et utilisez-les de manière cohérente pour toutes les images d’une même expérience.
REMARQUE: Vérifiez que le seuil est une valeur appropriée pour les échantillons les moins et les plus infectés avant d’analyser toutes les images. - Sélectionnez Analyser > Définir les mesures et cochez la case Fraction de surface. Sélectionnez tour à tour de rôle les contours d’un seul ver dans le gestionnaire de retour sur investissement et cliquez sur la fonction Analyser > Mesurer . Une fenêtre Résultats fournira la mesure pour %Surface (c.-à-d. % de charge parasitaire).
REMARQUE: Si la fluorescence des embryons est si brillante qu’elle franchit le seuil, l’outil Pinceau en noir de la barre d’outils peut être utilisé pour effacer manuellement ces régions avant de mesurer %Area. - Pour déterminer la taille du ver en lecture de l’aptitude, décrivez les vers comme décrit à l’étape 8.3. Sélectionnez Analyser > Définir les mesures et cochez la case Zone. Sélectionnez tour à tour de rôle les contours d’un seul ver dans le gestionnaire de retour sur investissement et cliquez sur la fonction Analyser > Mesurer . Une fenêtre Résultats fournit la mesure pour %Area.
- Image 20-30 vers montés sur des lames de microscope à l’aide d’un stéréoscope vertical fluorescent pour chaque échantillon. Capturez des images dans les canaux Brightfield, DAPI et GFP. Choisissez une exposition appropriée dans le canal GFP de sorte que la fluorescence dans les échantillons les plus infectés ne soit pas saturée.
9. Dosage FISH pour évaluer l’invasion de C. elegans par microsporidies et tirs de spores
REMARQUE: La sonde MicroB FISH reconnaît une région conservée de l’ARNr 18s microsporidien et peut être utilisée pour marquer les sporoplasmes intracellulaires (c.-à-d. les cellules hôtes envahies) et le matériel génétique dans les spores.
- Infecter 6 000 vers L1 synchronisés à l’eau de Javel avec 4 millions de spores de N. parisii et 10 μL de 10x OP50-1 dans un volume final de 400 μL composé de milieux M9.
- Plaquer le mélange sur une plaque NGM non ensemencée de 6 cm, sécher dans une armoire propre pendant 10-20 min et placer à 21 °C.
- Après 30 min, laver les animaux des plaques avec 1 mL de milieu M9 contenant 0,1 % de Tween-20.
- Abattez les vers en les centrifugant à 1 400 x g pendant 1 min à température ambiante.
- Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette, ajoutez 700 μL d’acétone et laissez-le reposer pendant 10 minutes à température ambiante.
REMARQUE: À ce stade, les vers peuvent être stockés à -20 ° C pour un traitement ultérieur. - Effectuer un test FISH de nuit à l’aide de la sonde MicroB à la suite de rapports précédemment publiés27,19.
REMARQUE : Pour évaluer la cuisson des spores, compléter les 500 μL restants du tampon de lavage avec 20 μg/mL de DY96 dans les échantillons et faire pivoter pendant 30 min à 21 °C avant de poursuivre le protocole normalement. - Rangez les diapositives dans une boîte à diapositives à 4 °C. Pour un entreposage à long terme (c.-à-d. plusieurs mois), entreposer des échantillons supplémentaires dans des tubes de microcentrifugation à 4 °C dans l’obscurité.
- Pour évaluer l’invasion chez les vers colorés par FISH, examinez les vers à l’aide du canal rouge d’un microscope à fluorescence. Visualisez les événements d’infection à fort grossissement (objectif 63x) car les animaux L1 sont petits et les sporoplasmes en seront aux premiers stades de la réplication. Pour évaluer la combustion des spores, utilisez un objectif 63x et des canaux de fluorescence rouges et verts.
REMARQUE: Les spores dans lesquelles le signal GFP et mCherry colocalisent sont considérées comme non cuites; les cas vides de spores GFP sont considérés comme cuits. - Pour tester l’invasion ou le déclenchement des spores, comptez manuellement le nombre de sporoplasmes (foyers mCherry dans les cellules intestinales) ou le pourcentage de spores tirées dans 20 à 30 vers par condition. Ajustez la mise au point dans le plan z pour capturer tous les événements d’infection et les spores, qui se trouvent souvent dans différents plans.
REMARQUE: Les sporoplasmes se trouvent exclusivement dans les cellules intestinales. La concentration la plus élevée de sporoplasmes se trouve généralement immédiatement après le pharynx. Si les échantillons sont également colorés avec DY96, recherchez la présence de sporoplasmes qui ne colocalisent pas avec la spore.
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Representative Results
Dans la présente étude, les populations parentales de C. elegans (P0) ont été infectées au stade L1 par une faible dose de spores de N. parisii . Ces conditions d’infection sont généralement utilisées pour obtenir un nombre élevé de descendants F1 résistants aux microsporidies par blanchiment des parents. Les populations parentales infectées et les témoins non infectés ont été fixés à 72 HPI et colorés avec DY96 pour visualiser les embryons de vers et les spores de microsporidies (Figure 1A). Les animaux infectés sont petits, contiennent de nombreuses spores de microsporidies et produisent moins d’embryons que les témoins sains non infectés. L’évaluation de la gravidité des vers a montré qu’environ 95 % des animaux non infectés produisaient une progéniture, contre moins de 80 % des animaux infectés (figure 1B). Les quantifications ont révélé qu’environ 90 % de la population traitée par microsporidies était infectée, déterminée par le nombre de vers contenant des spores colorées par DY96 (Figure 1C). Pour obtenir une progéniture F1 immuno-amorcée, il est important d’utiliser une dose de microsporidies suffisamment élevée pour s’assurer que la plupart des parents sont infectés, mais suffisamment faible pour que la population puisse toujours produire une progéniture. Un tableau des doses de microsporidies utilisées pour obtenir les données de cette étude est fourni (tableau 1).
Les populations parentes non infectées et infectées (figure 1) ont été traitées avec de l’hypochlorite de sodium à 72 hpi pour obtenir des descendants F1 naïfs et immuno-amorcés. Les animaux F1 ont été exposés à une forte dose de spores de N. parisii au stade L1 pour tester l’immunité héréditaire aux microsporidies. À 72 hpi, les animaux F1 ont été fixés et colorés avec DY96 pour évaluer la résistance aux microsporidies (Figure 2A). Les quantifications de ces animaux fixes ont révélé que les vers amorcés contenaient significativement plus d’embryons que leurs homologues naïfs, ce qui indique une plus grande aptitude face à l’infection (figure 2B). FIJI/ImageJ a été utilisé pour déterminer la charge parasitaire des vers naïfs et immunodéprimés individuels (c.-à-d. le pourcentage du corps rempli de spores fluorescentes de N. parisii ) (figure 2C). Les quantifications ont révélé une réduction spectaculaire de la charge parasitaire des vers provenant de parents infectés (Figure 2D). De plus, les calculs de la taille individuelle des vers ont révélé que les vers amorcés avaient un avantage de croissance significatif sur les animaux naïfs face à l’infection à N. parisii (figure 2E). Ces données démontrent que les parents infectés par N. parisii produisent une progéniture avec des niveaux élevés de résistance aux microsporidies.
Des travaux antérieurs ont révélé que l’immunité héréditaire aux microsporidies réduit l’invasion des cellules intestinales par N. parisii19. Pour visualiser les différences dans l’invasion des cellules hôtes, des animaux naïfs et immuno-amorcés (obtenus de parents non infectés ou infectés, comme ci-dessus) ont été exposés à une dose maximale de N. parisii au stade L1. À 30 dpi, les vers ont été fixés et co-colorés, à l’aide d’une sonde FISH pour détecter l’ARN de N. parisii et DY96 pour détecter les parois des spores de N. parisii . L’imagerie a révélé que, bien que les animaux naïfs contiennent généralement plusieurs spores et plusieurs cellules infectées (sporoplasmes), les animaux amorcés avaient beaucoup moins (ou pas) de spores et généralement pas de sporoplasmes (figure 3).
Figure 1 : La coloration jaune direct 96 (DY96) de C. elegans non infecté et infecté par N. parisii révèle la gravité du ver et l’état d’infection. (A-C) N2 C. elegans n’a pas été infecté ou infecté par une faible dose de N. parisii au stade L1. À 72 hpi, les vers ont été fixés, colorés avec DY96 et imagés pour évaluer la gravidité du ver et l’état d’infection. (A) Des images représentatives sont montrées. DY96 permet la visualisation d’embryons de vers et de spores de microsporidies (chitine). Une image en médaillon d’un ver infecté s’affiche sur le côté droit. Les embryons sont étiquetés « E »; L’infection à N. parisii de l’intestin est étiquetée « Np ». Barre d’échelle pour les images de gauche et du milieu = 500 μm. Barre d’échelle pour l’image de droite = 100 μm. (B) Les vers portant un ou plusieurs embryons ont été notés comme gravides et représentés graphiquement. (C) Les vers porteurs d’un nombre quelconque de spores de N. parisii dans les cellules intestinales ont été marqués comme infectés et représentés graphiquement. (B-C) Données regroupées à partir de 5 expériences indépendantes utilisant n = 100 vers par condition et par expérience. La moyenne ± SEM est affichée. Les valeurs de p ont été déterminées par le test t de Student à deux queues non apparié. La signification a été définie comme suit : *p < 0,05; p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Coloration jaune direct 96 (DY96) de C. elegans naïf et immunodéprimé pour déterminer les embryons par ver, la charge de microsporidies et la taille du ver. (A) N2 C. elegans a été infecté ou non par une faible dose de N. parisii au stade L1. À 72 hpi, les vers ont été traités avec de l’hypochlorite de sodium pour libérer des embryons. La progéniture naïve et immuno-amorcée qui en a résulté a été infectée par une forte dose de N. parisii au stade L1. À 72 hpi, les vers ont été fixés, colorés avec DY96 et imagés pour visualiser les embryons de vers et la charge parasitaire. Des images représentatives sont affichées. Barre d’échelle = 200 μm.(B) Le nombre d’embryons par ver a été compté et représenté graphiquement à partir de (A). (C) Une capture d’écran de FIJI/ImageJ montre des vers naïfs du panneau A qui ont été plafonnés pour visualiser la charge parasitaire (en blanc) à l’aide de la fenêtre Seuil en bas à droite. Ici, les vers individuels ont été décrits à l’aide de l’outil « Sélections de polygones » surligné en rouge et défini comme « Région d’intérêts » (ROI) à l’aide de la fenêtre ROI en haut à droite. La fonction Analyser > Mesurer > surface a été utilisée pour quantifier la charge parasitaire de deux exemples de vers, dont la valeur était de 25,02 % et 13,49 %. (D) La charge parasitaire par ver a été déterminée et représentée graphiquement à partir de (A). (E) À partir des images ci-dessus, la taille individuelle des vers a été calculée à partir d’animaux décrits comme dans le panneau C à l’aide de la fonction Analyser > Mesurer > surface. (B, D et E) La moyenne ± SEM est affichée. Les valeurs de p ont été déterminées par le test t de Student à deux queues non apparié. La signification a été définie comme suit : *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) contre l’ARNr N. parisii 18S révèle une invasion parasitaire des cellules intestinales de C. elegans chez des animaux naïfs mais non apprêtés. N2 C. elegans a été infecté ou non par une faible dose de N. parisii au stade L1. À 72 hpi, les vers ont été traités avec de l’hypochlorite de sodium pour libérer des embryons. La progéniture naïve et immuno-amorcée qui en a résulté a été infectée par une dose maximale de N. parisii au stade L1. À 30 mpi, les vers ont été fixés, soumis à FISH pour détecter les sporoplasmes, colorés avec DY96 pour détecter les parois des spores de microsporidies et imagés. Des images représentatives sont affichées. Les images en médaillon du ver naïf montrent des sporoplasmes (rouges, astérisques), des spores enflammées (vertes, pointes de flèches) et une spore non cuite (jaune, flèche). Le ver infecté naïf montré présente 4 sporoplasmes. Barre d’échelle = 20μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Dose de N. parisii | Concentration sur plaque (spores/cm2) | Des millions de spores par plaque de 6 cm | Des millions de spores par plaque de 10 cm |
| Bas | 35,400 | - | 2.7 |
| Haut | 88,400 | 2.5 | - |
| Maximal | 2,12,000 | 6 | - |
Tableau 1 : Doses de N. parisii utilisées dans l’étude.
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Discussion
Le présent protocole décrit l’étude des microsporidies et de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à N. parisii-C. elegans simple et génétiquement traitable.
La préparation des spores est un protocole intensif qui produit généralement suffisamment de spores pour 6 mois d’expériences, en fonction de la productivité24. Il est important de noter que l’infectiosité doit être déterminée pour chaque nouveau « lot » de spores avant de l’utiliser pour les expériences. En raison de la variabilité de l’infectiosité entre les préparations de spores, un seul lot doit être utilisé de manière cohérente pour toutes les répétitions d’une expérience. Les aliquotes individuelles ne doivent pas être décongelées et recongelées, car la décongélation peut provoquer le feu des spores et réduire l’infectiosité. Ainsi, les spores ne doivent être retirées du congélateur à -80 °C que immédiatement avant l’infection et maintenues sur la glace sur le banc.
Aux étapes 5 à 6, les tests d’infection ont été décrits. Il est important lors des tests d’infection d’éviter la contamination ou la famine des animaux, car cela peut entraîner des effets intergénérationnels supplémentaires qui confondent l’immunité chez les F1. Une limitation importante du test d’immunité héréditaire est que plus de parents infectés produisent moins de progéniture F1. Par conséquent, il est important de trouver un équilibre prudent entre la génération parentale suffisamment infectée pour transmettre l’immunité tout en étant en assez bonne santé pour produire une progéniture à tester. Bien que le protocole actuel décrive des tests d’infection pour les animaux L1, le protocole peut être modifié pour tester l’impact de l’infection par microsporidies sur les parents de stade différent et la persistance de l’immunité chez les enfants plus âgés. Les méthodes peuvent également être modifiées pour tester les effets de contraintes multiples ou distinctes (p. ex. stress osmotique, stress de métaux lourds, co-infection avec un autre agent pathogène) sur l’immunité héréditaire. Bien que l’immunité héréditaire à N. parisii chez C. elegans soit intergénérationnelle (c.-à-d. dure une seule génération)19, le protocole peut être adapté pour étudier d’autres générations afin de tester les effets transgénérationnels. Bien que les protocoles fournis soient spécifiques à l’infection à N. parisii, il existe de nombreuses autres espèces de microsporidies infectant les nématodes28. Les protocoles peuvent être adaptés pour étudier l’immunité héréditaire à d’autres microsporidies infectieuses de l’intestin (p. ex., Nematocida ausubeli) et épidermiques et musculaires (p. ex., Nematocida displodere)29,30. C. elegans est également infecté par de nombreux autres agents pathogènes naturels et humains (bactériens, fongiques et viraux). Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour tester l’immunité héréditaire à d’autres agents pathogènes chez C. elegans et la spécificité pathogène de la réponse immunitaire héréditaire à N. parisii. C. elegans est un organisme modèle bien établi. Cependant, d’autres membres du genre Caenorhabditis, y compris les espèces hermaphrodites C. tropicalis et C. briggsae et l’espèce mâle-femelle C. kamaaina sont également infectés à des degrés divers par N. parisii31. En apportant de petites modifications aux protocoles fournis, l’immunité héréditaire peut également être testée chez ces animaux.
À l’étape 8, des méthodes simples et rapides ont été données pour déterminer les différences de sensibilité aux microsporidies chez les vers tachés DY96 (c’est-à-dire % d’animaux infectés, % d’animaux gravides). Cependant, parfois, ces méthodes ne sont pas assez sensibles pour détecter de petits changements dans l’immunité et la forme physique. En effet, un ver avec un embryon et de nombreuses cellules infectées serait traité de la même manière qu’un ver avec 10 embryons et une cellule infectée. En tant que telles, des méthodes avec une résolution plus fine ont également été fournies pour déterminer les résultats de l’infection chez ces animaux (c.-à-d. % de charge parasitaire, nombre d’embryons, taille du ver). Bien que les deux méthodes puissent être utilisées, les différences phénotypiques sont généralement plus prononcées avec cette dernière, ce qui facilite la détection des différences significatives. Les adaptations futures à cette méthode pourraient inclure l’utilisation de l’apprentissage automatique pour automatiser l’analyse.
À l’étape 9, des techniques ont été fournies pour tester l’invasion des cellules hôtes par microsporidies et le tir de spores à l’aide de FISH. Alors que DY96 marque les microsporidies avec un fort signal vert fluorescent, d’autres colorants, y compris la coloration lipophile Nile Red et le Calcofluor White liant la chitine, peuvent également être utilisés pour tacher N. parisii 30,32,33. Le présent protocole décrit la fixation à l’aide d’acétone et fonctionne bien pour détecter les microsporidies avec coloration DY96 et FISH. Cependant, la fixation avec 4% de paraformaldéhyde peut aider à préserver la morphologie des tissus et à améliorer le signal dans certains protocoles d’imagerie.
Microsporidia est un agent pathogène peu étudié, et une grande partie de la biologie cellulaire de l’infection reste inconnue. C. elegans est un organisme modèle simple, et ces protocoles peuvent servir de plate-forme pour comprendre les processus clés impliqués dans l’infection et la défense de l’hôte contre ce parasite. L’immunité héréditaire est un domaine émergent, et de nombreuses questions restent en suspens1. Comment les parents infectés transmettent-ils l’immunité à la progéniture (approvisionnement maternel ou modification de la régulation transcriptionnelle chez la progéniture)? Qu’est-ce qui médie l’immunité chez la progéniture (peptides antimicrobiens ou autres protéines immunitaires)? Dans quelle mesure les réponses immunitaires héréditaires sont-elles spécifiques aux agents pathogènes et dans quelle mesure l’immunité héréditaire entre les espèces est-elle conservée? Compte tenu des nombreux outils disponibles avec C. elegans, les études s’appuyant sur le protocole décrit ici sont bien placées pour répondre à ces questions fondamentales de l’immunité héréditaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Winnie Zhao et Yin Chen Wan d’avoir fourni des commentaires utiles sur le manuscrit. Ces travaux ont été appuyés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no 522691522691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
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