Summary
La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.
Abstract
La inmunidad hereditaria describe cómo algunos animales pueden transmitir el "recuerdo" de una infección previa a su descendencia. Esto puede aumentar la resistencia de los patógenos en su progenie y promover la supervivencia. Si bien se ha reportado inmunidad hereditaria en muchos invertebrados, los mecanismos subyacentes a este fenómeno epigenético son en gran parte desconocidos. La infección de Caenorhabditis elegans por el patógeno microsporidio natural Nematocida parisii da como resultado que los gusanos produzcan descendencia que es robustamente resistente a los microsporidios. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad intergeneracional en el modelo de infección simple y genéticamente tratable de N. parisii -C. elegans . El artículo actual describe métodos para infectar a C. elegans y generar descendencia inmuno-preparada. También se proporcionan métodos para evaluar la resistencia a la infección por microsporidios mediante la tinción de microsporidios y la visualización de la infección por microscopía. En particular, la inmunidad hereditaria previene la invasión de células huésped por microsporidios, y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se puede utilizar para cuantificar los eventos de invasión. La cantidad relativa de esporas de microsporidios producidas en la descendencia inmunoprimida se puede cuantificar tiñendo las esporas con un tinte de unión a la quitina. Hasta la fecha, estos métodos han arrojado luz sobre la cinética y la especificidad del patógeno de la inmunidad hereditaria, así como los mecanismos moleculares subyacentes a ella. Estas técnicas, junto con las amplias herramientas disponibles para la investigación de C. elegans, permitirán importantes descubrimientos en el campo de la inmunidad hereditaria.
Introduction
La inmunidad hereditaria es un fenómeno epigenético por el cual la exposición de los padres a patógenos puede permitir la producción de descendencia resistente a las infecciones. Este tipo de memoria inmune se ha demostrado en muchos invertebrados que carecen de sistemas inmunes adaptativos y pueden proteger contra enfermedades virales, bacterianas yfúngicas 1. Si bien la inmunidad hereditaria tiene implicaciones importantes para comprender tanto la salud como la evolución, los mecanismos moleculares subyacentes a esta protección son en gran parte desconocidos. Esto se debe en parte a que muchos de los animales en los que se ha descrito la inmunidad heredada no son organismos modelo establecidos para la investigación. Por el contrario, los estudios en el nematodo transparente Caenorhabditis elegans se benefician de un extenso conjunto de herramientas genéticas y bioquímicas 2,3, un genoma altamente anotado 4,5 y un corto tiempo de generación. De hecho, la investigación en C. elegans ha permitido avances fundamentales en los campos de la epigenética y la inmunidad innata 6,7, y ahora es un modelo establecido para estudiar la memoria inmune 8,9.
Los microsporidios son patógenos fúngicos que infectan a casi todos los animales y causan infecciones letales en humanos inmunocomprometidos10. La infección comienza cuando una espora de microsporidios inyecta o "dispara" su contenido celular (esporoplasma) en una célula huésped utilizando una estructura llamada tubo polar. La replicación intracelular del parásito da como resultado la formación de merontes, que finalmente se diferencian en esporas maduras que pueden salir de la célula11,12. Si bien estos parásitos son perjudiciales tanto para la salud humana como para la seguridad alimentaria, aún queda mucho por aprender sobre su biología de la infección12. Nematocida parisii es un parásito microsporidio natural que se replica exclusivamente en las células intestinales de los gusanos, lo que resulta en una fecundidad reducida y, en última instancia, la muerte. El modelo de infección por N. parisii -C. elegans se ha utilizado para mostrar: (1) el papel de la autofagia en la eliminación de patógenos13, (2) cómo los microsporidios pueden salir de las células infectadas de forma no lítica14, (3) cómo los patógenos pueden propagarse de célula a célula mediante la formación de sincitia15, (4) las proteínas que N. parisii utiliza para interactuar con su huésped16, y (5) la regulación de la respuesta intracelular transcripcional del patógeno (IPR)17, 18.
Los protocolos para la infección de C. elegans se describen en el trabajo actual y se pueden utilizar para revelar la biología única de los microsporidios y diseccionar la respuesta del huésped a la infección. La microscopía de gusanos fijos teñidos con el tinte de unión a quitina Direct Yellow 96 (DY96) muestra la propagación de la infección de esporas de microsporidios que contienen quitina por todo el intestino. La tinción DY96 también permite la visualización de embriones de gusanos que contienen quitina para la evaluación simultánea de la gravedad del gusano (capacidad de producir embriones) como una lectura de la aptitud del huésped.
Trabajos recientes han revelado que C. elegans infectados con N. parisii producen descendencia que es robustamente resistente a la misma infección19. Esta inmunidad hereditaria dura una sola generación y depende de la dosis, ya que los hijos de padres más infectados son más resistentes a los microsporidios. Curiosamente, las crías preparadas con N. parisii también son más resistentes al patógeno intestinal bacteriano Pseudomonas aeruginosa, aunque no están protegidas contra el patógeno natural Virus Orsay19. El presente trabajo también muestra que la descendencia inmunoprimida limita la invasión de células huésped por microsporidios. El método también describe la colección de descendientes inmuno-cebados y cómo FISH se puede utilizar para detectar el ARN de N. parisii en las células intestinales para evaluar la invasión de la célula huésped y la activación de esporas20.
Juntos, estos protocolos proporcionan una base sólida para estudiar los microsporidios y la inmunidad hereditaria en C. elegans. Se espera que el trabajo futuro en este sistema modelo permita descubrimientos importantes en el campo naciente de la inmunidad heredada. También es probable que estas técnicas sean puntos de partida para investigar la inmunidad hereditaria inducida por microsporidios en otros organismos huéspedes.
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Protocol
El presente estudio utiliza la cepa N2 de C. elegans Bristol de tipo silvestre cultivada a 21 °C.
1. Preparación de los medios de comunicación
- Preparar los medios M9 según el informe anterior21,22.
- Preparar el medio de crecimiento de nematodos (NGM) según el informe anterior21,22. Vierta 12 ml de NGM por placa de 6 cm o 30 ml por placa de 10 cm.
- Prepare la cepa OP50-1 de Escherichia coli según un informe anterior23.
- Prepare placas NGM con semillas OP50-1 siguiendo los pasos a continuación.
- Resuspendir 10x CONCENTRADO OP50-1 por vórtice.
- Use una pipeta repetidora para sembrar las placas en el centro. Para placas de 6 cm y 10 cm, semilla con un volumen de 200 μL o 500 μL, respectivamente.
- Para placas de 10 cm, use un esparcidor de vidrio para extender el OP50-1 y crear un césped de bacterias. No propague las bacterias hasta el borde mismo de la placa.
NOTA: El etanol sumerge y enciende el esparcidor cada cinco placas para garantizar la esterilidad. Deje que el esparcidor se enfríe durante unos segundos antes de propagarse para evitar matar las bacterias. - Deje las placas a temperatura ambiente durante 2 días para que se sequen y aseguren el crecimiento del césped bacteriano.
NOTA: Las placas sembradas se pueden almacenar a temperatura ambiente durante 2-3 semanas o a 4 ° C durante un máximo de 1 mes.
2. Mantenimiento de C. elegans
- Mantenga los gusanos en una fuente de alimento bacteriana constante en las placas NGM con semillas OP50-1.
NOTA: La inanición puede resultar en fenotipos intergeneracionales, que pueden afectar los resultados. Una placa op50-1-sembrada de 10 cm soporta 2.500 L1s (la etapa larvaria más temprana de C. elegans) durante un máximo de 72 h. - Si los gusanos mueren de hambre, crezca durante tres generaciones en OP50-1 antes de usar los gusanos para experimentos.
3. Sincronización de poblaciones de C. elegans utilizando hipoclorito de sodio (blanqueamiento)
NOTA: Este paso es muy sensible al tiempo, así que asegúrese de que la centrífuga esté disponible antes de comenzar. Los protocolos alternativos de blanqueamiento menos rápido están disponibles en la literatura y se pueden usar si se prefiere. Para evitar que el hipoclorito de sodio al 6% pierda actividad con el tiempo, guarde el reactivo en la oscuridad a 4 ° C y manténgalo hasta por 1 año.
- Preparar 2 ml de solución de lejía para cada muestra mezclando 400 μL de 1 M de NaOH, 250 μL de hipoclorito de sodio al 6% (ver Tabla de materiales) y 1350 μL de agua destilada.
- Lave los gusanos adultos (~ 72 h después de la escotilla) de las placas en un tubo de microcentrífuga utilizando 1 ml de medios M9.
NOTA: Si quedan muchos gusanos en las placas, peletice los gusanos por centrifugación a 1.400 x g durante 30 s a temperatura ambiente, retire el sobrenadante con una punta de pipeta de 1 ml y realice lavados de placa adicionales. - Centrifugar a 1.400 x g durante 30 s a temperatura ambiente para granular los gusanos, luego lavar 2x con 1 ml de medios M9 para eliminar las bacterias.
- Retire el sobrenadante, agregue 1 ml de la solución de lejía preparada (paso 3.1.) y configure un temporizador durante 1 minuto. Invierta los tubos 3-4x.
NOTA: Bajo un microscopio de luz, se puede ver que los gusanos dejan de golpear. - Después de 1 min, centrifugar a 3.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente para granular los gusanos, luego retirar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución de lejía fresca.
- Monitoree los tubos de cerca bajo un microscopio de luz para visualizar los cadáveres de gusanos que se abren y liberan embriones. Avance inmediatamente al siguiente paso cuando ~ 50% -80% de los cadáveres se hayan abierto y se hayan liberado muchos embriones.
NOTA: Dependiendo del número de animales y la cepa del gusano, este paso puede tomar de 15 s a 4 min. Por razones desconocidas, los gusanos infectados con N. parisii a menudo tardan más en blanquearse que los animales no infectados. - Centrifugar a 3.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente para granular los embriones, luego lavar 3x en 1 mL de medios M9.
NOTA: Los lavados diluyen la solución de hipoclorito residual de los tubos y deben realizarse rápidamente para garantizar que la solución de blanqueador no dañe los embriones. - Agregue 1 ml de medio M9 al pellet final y transfiéralo a un tubo cónico de 15 ml que contenga 4 ml de medio M9. Suspender los embriones en un volumen final de 5 mL.
- Girar los tubos en un rotor mecánico (ver Tabla de Materiales) a 21 °C durante 18-24 h para eclosionar los embriones en L1s.
NOTA: Como N. parisii infecta el intestino del gusano y no invade la línea germinal, los padres infectados no transmiten la infección a su progenie por transmisión vertical19. El blanqueamiento de adultos infectados sincroniza los animales F1 y destruye las esporas de N. parisii , asegurando que la progenie F1 no esté infectada por esporas transmitidas por los padres. - Centrifugar los tubos durante 1 min a 1.800 x g a temperatura ambiente para granular los L1, y desechar todos menos 1 ml del sobrenadante.
- Pipetear 1-5 μL de mezcla L1 en una placa NGM sin sembrar, e inmediatamente contar el número de L1 en la gota visualizando bajo un microscopio de luz. Repita 3x y promedie los recuentos para determinar la concentración y el número total de L1.
NOTA: La mayoría de los embriones deben eclosionar, y los L1 deben moverse rápidamente en la gota líquida. Si una gran proporción de embriones no eclosionados y L1 letárgicos (de movimiento lento) permanecen, esto indica blanqueamiento durante demasiado tiempo.
4. Preparación de esporas de N. parisii
- Preparar esporas de N. parisii siguiendo las referencias publicadas previamente19,24.
5. Infección de C. elegans con N. parisii para producir descendencia inmunoprimida
- Un día antes de las infecciones planificadas, mueva el número requerido de placas NGM sin sembrar de 10 cm de 4 ° C a temperatura ambiente.
- Inmediatamente antes de la infección, centrífuga ~ 2,500 gusanos L1 sincronizados a 1,400 x g durante 30 s a temperatura ambiente en un tubo de microcentrífuga para granular los gusanos. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta para dejar gusanos en ~ 50 μL de medios M9.
- Agregue 1 ml de 10x OP50-1 a las esporas L1 y N. parisii a la concentración deseada (típicamente ~ 2.5 millones de esporas). Como control no infectado, prepare un tubo equivalente de L1 y OP50-1 con un volumen de medios M9 equivalente al volumen de preparación de esporas utilizado.
NOTA: Para obtener descendencia inmuno-cebada, use una dosis de esporas lo suficientemente alta como para que >90% de los animales estén infectados por 72 h (según lo medido por la tinción DY96, Paso 7) pero lo suficientemente baja como para que >80% de los animales todavía estén grávidos. Esto asegura que la mayoría de los descendientes provengan de padres infectados y que el blanqueamiento de los padres produzca suficientes embriones para las pruebas de F1. Aunque las preparaciones de esporas varían en concentración e infectividad, una dosis parental adecuada es típicamente entre 5-15 μL de preparación de esporas (~ 2.5 millones de esporas) por placa de 10 cm. - Vórtice brevemente para mezclar y colocar el 1 ml de gusanos por encima de 10 cm en una placa NGM sin sembrar de 10 cm. Gire para asegurar que el líquido se extienda por toda la placa.
- Seque las placas en un gabinete limpio con las tapas apagadas durante 10-20 min o hasta que estén completamente secas, antes de incubar a 21 ° C durante 72 h.
- A las 72 h después de la infección (hpi), lave los gusanos de las placas en un tubo de microcentrífuga con 1 ml de medios M9. Si quedan muchos gusanos en las placas, peletizar los gusanos por centrifugación a 1.400 x g durante 30 s, retire el sobrenadante y realice lavados de placas adicionales.
- Centrifugar a 1.400 x g durante 30 s a temperatura ambiente para peletizar gusanos, lavar 2x con 1 mL de medios M9 o hasta que el sobrenadante esté despejado. Resuspend en un volumen final de 1 mL de medios M9.
- Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar, luego transfiera 100 μL de los gusanos suspendidos a un tubo fresco.
NOTA: Esta muestra de ~ 250 adultos se puede arreglar y teñir más tarde para determinar la aptitud del gusano parental y el estado de infección, como se describe en el Paso 7 y el comienzo del Paso 3. - Para abrir los gusanos adultos y liberar embriones F1 para su análisis, blanquee los 900 μL restantes de gusanos suspendidos, como se describe en el Paso 3.
NOTA: Este paso también destruye cualquier espora de N. parisii antes de los ensayos de infección posteriores.
6. Prueba de inmunidad hereditaria a N. parisii en C. elegans
- Realice infecciones como se describe en los pasos 5.1.-5.6., con las modificaciones que se mencionan a continuación.
NOTA: Los ensayos de infección en F1 se pueden reducir y realizar en placas NGM de 6 cm utilizando ~ 1,000 gusanos L1 y 400 μL de 10x OP50-1. También se debe usar una dosis "alta" de esporas, de modo que ~ 100% de los F1 ingenuos (es decir, gusanos de padres no infectados) estén infectados, y solo ~ 10% de los F1 ingenuos sean grávidos. Aunque las preparaciones de esporas varían en concentración e infectividad, una dosis adecuada suele estar entre 5-15 μL (~ 2.5 millones de esporas) por placa de 6 cm. - A 72 hpi, fije y manche para determinar la aptitud del gusano y el estado de infección, como se describe en el Paso 7.
7. Tinción DY96 de C. elegans para visualizar embriones y esporas de microsporidia
NOTA: DY96 es un colorante verde fluorescente de unión a quitina que tiñe embriones de gusanos y paredes de esporas de microsporidios 19,15,25. Esto permite el monitoreo simultáneo de la aptitud y el estado de infección de los gusanos.
- Lave los gusanos de las placas en un tubo de microcentrífuga utilizando 1 ml de medios M9 que contengan 0.1% tween-20. Si quedan muchos gusanos en las placas, peletizar los gusanos por centrifugación a 1.400 x g durante 30 s a temperatura ambiente, retire el sobrenadante con una punta de pipeta y realice lavados de placa adicionales.
- Centrifugar a 1.400 x g durante 30 s a temperatura ambiente para granular los gusanos, y lavar 2x con 1 mL de medios M9 que contengan 0,1% tween-20 o hasta que el sobrenadante esté claro.
- Retire el sobrenadante, agregue 700 μL de acetona y deje que los gusanos se fijen a temperatura ambiente durante 10 min.
NOTA: En este punto, los gusanos se pueden almacenar a -20 ° C para su procesamiento hasta varios meses después, si se desea. - Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente para granular los gusanos fijos, y lavar 2x con 1 ml de PBS que contenga 0,1% de Tween-20 (PBST).
- Preparar 50 ml de solución de trabajo DY96: PBST, dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% (v/v) y 20 μg/ml DY96 (a partir de una solución madre de 5 mg/ml en agua destilada) (ver Tabla de materiales). Envuelva el tubo en papel de aluminio y guárdelo en un cajón para evitar la exposición a la luz.
NOTA: El stock y las soluciones de trabajo de DY96 se pueden almacenar durante >1 año a temperatura ambiente si se mantienen en la oscuridad. - Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente para peletizar los gusanos y eliminar el sobrenadante. Añadir 500 μL de solución de trabajo DY96 al pellet y girar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a temperatura ambiente para peletizar los gusanos. Retire el sobrenadante y agregue 15 μL del medio de montaje con/sin DAPI (consulte la Tabla de materiales).
- Pipete 10 μL de la solución que contiene gusanos teñidos en un portaobjetos de microscopio y coloque una funda sobre la parte superior.
NOTA: Las diapositivas y muestras adicionales se pueden almacenar a 4 °C en la oscuridad para su almacenamiento a largo plazo.
8. Imágenes y análisis de gusanos teñidos con DY96 para evaluar la aptitud del gusano y el estado de infección
- Para analizar los gusanos teñidos con DY96 (montados en diapositivas, como en el Paso 7.8.), realice imágenes utilizando el canal GFP de un microscopio de fluorescencia.
- Para determinar la aptitud de las poblaciones de gusanos, use un objetivo de 5x o 10x para evaluar la gravedad de >100 gusanos por condición.
NOTA: Los gusanos portadores de ≥1 embrión se consideran grávidos. Los contadores de células mecánicas pueden ayudar a minimizar el error humano al contar. Los embriones de gusano están menos teñidos (menos fluorescentes) que las esporas de microsporidios19. Los embriones son ovoides, ~ 50 μm x ~ 30 μm, y se encuentran en el cuerpo medio de los adultos sanos de C. elegans . Los adultos sanos y no infectados llevan de 10 a 20 embriones organizados en filas a lo largo de su cuerpo de longitud26. - Para revelar diferencias más sutiles en la aptitud, realice recuentos de embriones. Para esto, cuente manualmente el número de embriones en 20-30 gusanos individuales por condición.
- Para determinar qué tan infectadas están las poblaciones de gusanos, use un objetivo de 5x-40x para evaluar el estado de infección de > 100 gusanos por condición. Los gusanos que comprenden cualquier número de esporas intestinales intracelulares se consideran infectados.
NOTA: Las esporas de Microsporidia son más brillantes que los embriones de gusano. Las esporas en forma de frijol de N. parisii son ~ 2.2 μm x ~ 0.8 μm y se producen en las células intestinales del gusano a partir de ~ 48 hpi15. Los gusanos en los que las esporas se ven exclusivamente en la luz intestinal y no a lo largo de las paredes intestinales no se consideran infectados19. Esto se debe a que estas esporas probablemente representan esporas recién ingeridas que no resultan de la infección del individuo. - Utilizando un software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales), cuantifique la carga del parásito y el tamaño del gusano siguiendo los pasos a continuación.
- Imagen 20-30 gusanos montados en portaobjetos de microscopio utilizando un estereoscopio vertical fluorescente para cada muestra. Capture imágenes en canales Brightfield, DAPI y GFP. Elija una exposición adecuada en el canal GFP de modo que la fluorescencia en las muestras más infectadas no esté saturada.
NOTA: La infección aún se puede visualizar en las muestras menos infectadas. Las imágenes generalmente se toman usando un objetivo 5x. - Abra archivos en FIJI/ImageJ. Dependiendo del tipo de archivo, el complemento Bio-Formats Importer puede ser necesario para abrir imágenes en ImageJ.
- Deslinee 20-30 gusanos individuales en imágenes utilizando imágenes de campo brillante o DAPI y la herramienta Selecciones de polígonos en la barra de herramientas. Guarde cada esquema con Analyze > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager en el menú desplegable haciendo clic en Agregar [t]. Delinea los animales que son completamente visibles en el marco.
NOTA: Los contornos de gusano se pueden volver a visitar más adelante guardando el archivo con contornos como Tiff. - Haga clic en Anular selección en el administrador de ROI para eliminar todos los contornos de la imagen y haga clic en Imagen > Duplicar en el menú desplegable. Escriba el número correspondiente al canal de interés en el cuadro "Canales" para duplicar el canal GFP para la carga de parásitos (por ejemplo, 2).
- Umbral de este canal usando image > Ajustar > Umbral a un nivel en el que se captura la carga de parásitos brillantes, pero la fluorescencia más tenue de los embriones de gusano no lo es, y luego haga clic en Aplicar. Tome nota de los valores umbral aplicados y utilícelos de manera coherente para todas las imágenes del mismo experimento.
NOTA: Compruebe que el umbral es un valor apropiado tanto para las muestras menos infectadas como para las más infectadas antes de analizar todas las imágenes. - Seleccione Analizar > Establecer medidas y marque la casilla Fracción de área. Seleccione los contornos de un solo gusano a su vez desde el administrador de ROI y haga clic en la función Analizar > medir . Una ventana de resultados proporcionará la medición de %Área (es decir, % carga de parásitos).
NOTA: Si la fluorescencia de los embriones es tan brillante que cruza el umbral, la herramienta Pincel en negro en la barra de herramientas se puede utilizar para borrar manualmente estas regiones antes de medir %Área. - Para determinar el tamaño del gusano como una lectura de la aptitud, describa los gusanos como se describe en el paso 8.3. Seleccione Analizar > Establecer medidas y marque la casilla Área. Seleccione los contornos de un solo gusano a su vez desde el administrador de ROI y haga clic en la función Analizar > medir . Una ventana resultados proporcionará la medición de %Area.
- Imagen 20-30 gusanos montados en portaobjetos de microscopio utilizando un estereoscopio vertical fluorescente para cada muestra. Capture imágenes en canales Brightfield, DAPI y GFP. Elija una exposición adecuada en el canal GFP de modo que la fluorescencia en las muestras más infectadas no esté saturada.
9. Ensayo FISH para evaluar la invasión de C. elegans por microsporidios y disparo de esporas
NOTA: La sonda MicroB FISH reconoce una región conservada de ARNr microsporidio 18s y se puede utilizar para etiquetar esporoplasmas intracelulares (es decir, células huésped invadidas) y el material genético dentro de las esporas.
- Infectar 6.000 gusanos L1 sincronizados con lejía con 4 millones de esporas de N. parisii y 10 μL de 10x OP50-1 en un volumen final de 400 μL que se compone con medios M9.
- Coloque la mezcla en una placa NGM sin sembrar de 6 cm, seque en un gabinete limpio durante 10-20 min y colóquela a 21 ° C.
- Después de 30 min, lave a los animales de las placas con 1 ml de medios M9 que contengan 0.1% Tween-20.
- Pellet los gusanos centrifugando a 1.400 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante con una punta de pipeta, agregue 700 μL de acetona y déjelo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: En este punto, los gusanos se pueden almacenar a -20 °C para su procesamiento en un momento posterior. - Realizar un ensayo FISH durante la noche utilizando la sonda MicroB siguiendo los informes publicados previamente27,19.
NOTA: Para evaluar la cocción de esporas, complemente los 500 μL finales de tampón de lavado con 20 μg/mL de DY96 a las muestras y gire durante 30 min a 21 °C antes de continuar con el protocolo normal. - Guarde las diapositivas en un cuadro de diapositivas a 4 °C. Para el almacenamiento a largo plazo (es decir, varios meses), almacene muestras adicionales en tubos de microcentrífuga a 4 °C en la oscuridad.
- Para evaluar la invasión en gusanos teñidos con FISH, observe los gusanos usando el canal rojo de un microscopio de fluorescencia. Visualice los eventos de infección a gran aumento (objetivo 63x) ya que los animales L1 son pequeños y los esporoplasmas estarán en las primeras etapas de replicación. Para evaluar la activación de esporas, utilice un objetivo 63x y canales de fluorescencia rojos y verdes.
NOTA: Las esporas en las que la señalización GFP y mCherry se colocalizan se consideran no activadas; los casos vacíos de esporas GFP se consideran disparados. - Para evaluar la invasión o el disparo de esporas, cuente manualmente el número de esporoplasmas (focos mCherry en las células intestinales) o el porcentaje de esporas disparadas en 20-30 gusanos por condición. Ajuste el enfoque en el plano z para capturar todos los eventos de infección y esporas, que a menudo se encuentran en diferentes planos.
NOTA: Los esporoplasmas se encuentran exclusivamente dentro de las células intestinales. La mayor concentración de esporoplasmas se encuentra típicamente inmediatamente después de la faringe. Si las muestras también se tiñen con DY96, busque la presencia de esporoplasmas que no se coloquen con la espora.
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Representative Results
En el presente estudio, las poblaciones parentales de C. elegans (P0) se infectaron en la etapa L1 con una dosis baja de esporas de N. parisii . Estas condiciones de infección se utilizan típicamente para obtener un alto número de progenie F1 resistente a microsporidios a través del blanqueamiento de los padres. Las poblaciones parentales infectadas y los controles no infectados se fijaron en 72 hpi y se tiñeron con DY96 para visualizar los embriones de gusano y las esporas de microsporidios (Figura 1A). Los animales infectados son pequeños, contienen muchas esporas de microsporidios y producen menos embriones que los controles sanos no infectados. La evaluación de la gravedad del gusano mostró que ~ 95% de los animales no infectados produjeron descendencia, en comparación con menos del 80% de los animales infectados (Figura 1B). Las cuantificaciones revelaron que ~ 90% de la población tratada con microsporidios estaba infectada, según lo determinado por el número de gusanos que contenían esporas teñidas con DY96 (Figura 1C). Para obtener progenie F1 inmunoinmunológica, es importante usar una dosis de microsporidios que sea lo suficientemente alta como para garantizar que la mayoría de los padres estén infectados, pero lo suficientemente baja como para garantizar que la población aún pueda producir progenie. Se proporciona una tabla de las dosis de microsporidios utilizadas para obtener los datos de este estudio (Tabla 1).
Las poblaciones parentales no infectadas e infectadas (Figura 1) fueron tratadas con hipoclorito de sodio a 72 hpi para obtener progenies F1 ingenuas e inmunoprimidas. Los animales F1 fueron expuestos a una dosis alta de esporas de N. parisii en la etapa L1 para probar la inmunidad hereditaria a los microsporidios. A 72 hpi, los animales F1 fueron fijados y teñidos con DY96 para evaluar la resistencia a los microsporidios (Figura 2A). Las cuantificaciones de estos animales fijos revelaron que los gusanos cebados contenían significativamente más embriones que sus contrapartes ingenuas, lo que indica una mayor aptitud frente a la infección (Figura 2B). FIJI/ImageJ se utilizó para determinar la carga parasitaria de gusanos individuales ingenuos e inmunoprimidos (es decir, el porcentaje del cuerpo lleno de esporas fluorescentes de N. parisii ) (Figura 2C). Las cuantificaciones revelaron una reducción dramática en la carga parasitaria de gusanos que provenían de padres infectados (Figura 2D). Además, los cálculos del tamaño individual del gusano revelaron que los gusanos cebados tenían una ventaja de crecimiento significativa sobre los animales ingenuos frente a la infección por N. parisii (Figura 2E). Estos datos demuestran que los padres infectados con N. parisii producen descendencia con altos niveles de resistencia a los microsporidios.
Trabajos previos han revelado que la inmunidad hereditaria a los microsporidios reduce la invasión de células intestinales por N. parisii19. Para visualizar las diferencias en la invasión de células huésped, los animales ingenuos e inmunodeprimidos (obtenidos de padres no infectados o infectados, como se mencionó anteriormente) fueron expuestos a una dosis máxima de N. parisii en la etapa L1. A 30 dpi, los gusanos fueron fijados y co-teñidos, utilizando una sonda FISH para detectar el ARN de N. parisii y DY96 para detectar las paredes de esporas de N. parisii . Las imágenes revelaron que, mientras que los animales ingenuos generalmente contenían múltiples esporas y varias células infectadas (esporoplasmas), los animales preparados tenían muchas menos (o ninguna) esporas y típicamente no tenían esporoplasmas (Figura 3).
Figura 1: La tinción directa de Amarillo 96 (DY96) de C. elegans no infectado e infectado por N. parisii revela la gravedad del gusano y el estado de infección. (A-C) N2 C. elegans no se infectó ni se infectó con una dosis baja de N. parisii en la etapa L1. A 72 hpi, los gusanos fueron fijados, teñidos con DY96 y fotografiados para evaluar la gravedad del gusano y el estado de infección. (A) Se muestran imágenes representativas. DY96 permite la visualización de embriones de gusanos y esporas de microsporidios (quitina). Una imagen insertada de un gusano infectado se muestra en el lado derecho. Los embriones están etiquetados como «E»; La infección por N. parisii del intestino está etiquetada como 'Np'. Barra de escala para imágenes izquierdas y centrales = 500 μm. Barra de escala para la imagen correcta = 100 μm. (B) Los gusanos portadores de uno o más embriones se calificaron como grávidos y se graficaron. (C) Los gusanos portadores de cualquier número de esporas de N. parisii en las células intestinales se calificaron como infectados y se graficaron. (B-C) Datos agrupados de 5 experimentos independientes utilizando n = 100 gusanos por condición por experimento. Se muestra el SEM de ± media. Los valores de p fueron determinados por la prueba t de Student de dos colas no apareadas. La significación se definió como: *p < 0,05; p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Tinción directa de Amarillo 96 (DY96) de C. elegans naïve e inmuno-cebado para determinar embriones por gusano, carga de microsporidios y tamaño de gusano. (A) N2 C. elegans se infectó o no con una dosis baja de N. parisii en la etapa L1. A 72 hpi, los gusanos fueron tratados con hipoclorito de sodio para liberar embriones. La descendencia ingenua e inmunoprimida resultante fue infectada con una dosis alta de N. parisii en la etapa L1. A 72 hpi, los gusanos fueron arreglados, teñidos con DY96 y fotografiados para visualizar embriones de gusanos y carga de parásitos. Se muestran imágenes representativas. Barra de escala = 200 μm.(B) El número de embriones por gusano se contó y graficó a partir de (A). (C) Una captura de pantalla de FIJI/ImageJ muestra gusanos ingenuos del panel A que han sido umbrales para visualizar la carga del parásito (que se muestra en blanco) utilizando la ventana Umbral en la parte inferior derecha. Aquí, los gusanos individuales se delinearon utilizando la herramienta "Selecciones de polígonos" resaltada en rojo y definida como "Región de intereses" (ROI) utilizando la ventana de ROI en la parte superior derecha. La función Analizar > Medir > Área se utilizó para cuantificar la carga parasitaria de dos gusanos de ejemplo, que se demostró que era de 25.02% y 13.49%. (D) La carga de parásitos por gusano se determinó y graficó a partir de (A). (E) A partir de las imágenes anteriores, el tamaño individual del gusano se calculó a partir de animales descritos como en el panel C utilizando la función Analizar > Medir > Área . (B, D y E) Se muestra el SEM de ± media. Los valores de p se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas no apareadas. La significación se definió como: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La hibridación fluorescente in situ (FISH) contra el ARNr de N. parisii 18S revela la invasión parasitaria de las células intestinales de C. elegans en animales ingenuos pero no preparados . N2 C. elegans se infectó o no con una dosis baja de N. parisii en la etapa L1. A 72 hpi, los gusanos fueron tratados con hipoclorito de sodio para liberar embriones. La descendencia ingenua e inmunoprimida resultante fue infectada con una dosis máxima de N. parisii en la etapa L1. A 30 mpi, los gusanos fueron fijados, sometidos a FISH para detectar esporoplasmas, teñidos con DY96 para detectar paredes de esporas de microsporidios, y fotografiados. Se muestran imágenes representativas. Las imágenes insertadas para el gusano ingenuo muestran esporoplasmas (rojo, asteriscos), esporas disparadas (verde, puntas de flecha) y una espora sin cocer (amarillo, flecha). El ingenuo gusano infectado que se muestra muestra 4 esporoplasmas. Barra de escala = 20μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Dosis de N. parisii | Concentración de placas (esporas/cm2) | Millones de esporas por placa de 6 cm | Millones de esporas por placa de 10 cm |
| Bajo | 35,400 | - | 2.7 |
| Alto | 88,400 | 2.5 | - |
| Máximo | 2,12,000 | 6 | - |
Tabla 1: Dosis de N. parisii empleadas en el estudio.
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Discussion
El presente protocolo describe el estudio de los microsporidios y la inmunidad hereditaria en un modelo de infección por N. parisii -C. elegans simple y genéticamente tratable.
La preparación de esporas es un protocolo intensivo que generalmente produce suficientes esporas para 6 meses de experimentos, dependiendo de la productividad24. Es importante destacar que se debe determinar la infectividad para cada nuevo "lote" de esporas antes de usarlo para los experimentos. Debido a la variabilidad en la infectividad entre las preparaciones de esporas, se debe usar un solo lote de manera consistente para todas las repeticiones de un experimento. Las alícuotas individuales no deben descongelarse ni volver a congelarse, ya que la descongelación puede hacer que las esporas se disparen y reduzcan la infectividad. Como tal, las esporas solo deben eliminarse del congelador de -80 ° C inmediatamente antes de la infección y mantenerse en hielo mientras están en el banco.
En los pasos 5-6, se esbozaron los ensayos de infección. Es importante durante los ensayos de infección evitar la contaminación o la inanición de los animales, ya que esto puede resultar en efectos intergeneracionales adicionales que confunden la inmunidad en los F1. Una limitación importante del ensayo de inmunidad hereditaria es que más padres infectados producen menos descendencia F1. Por lo tanto, es importante lograr un equilibrio cuidadoso entre que la generación parental esté lo suficientemente infectada como para transmitir inmunidad y que esté lo suficientemente sana como para producir descendencia para la prueba. Aunque el protocolo actual describe ensayos de infección para animales L1, el protocolo puede modificarse para probar el impacto de la infección por microsporidios en padres en etapas diferentes y la persistencia de la inmunidad en la descendencia mayor. Los métodos también se pueden modificar para probar los efectos de tensiones múltiples o distintas (por ejemplo, tensión osmótica, tensión de metales pesados, coinfección con otro patógeno) en la inmunidad hereditaria. Si bien la inmunidad hereditaria a N. parisii en C. elegans es intergeneracional (es decir, dura una sola generación)19, el protocolo puede adaptarse para estudiar generaciones posteriores para probar los efectos transgeneracionales. Si bien los protocolos proporcionados son específicos para la infección por N. parisii, existen muchas otras especies de microsporidios que infectan nematodos28. Los protocolos se pueden adaptar para estudiar la inmunidad hereditaria a otros microsporidios infecciosos intestinales (por ejemplo, Nematocida ausubeli) e infecciosos epidérmicos y musculares (por ejemplo, Nematocida displodere)29,30. C. elegans también está infectado por muchos otros patógenos naturales y humanos (bacterianos, fúngicos y virales). Los métodos descritos aquí se pueden utilizar para probar la inmunidad hereditaria a otros patógenos en C. elegans y la especificidad del patógeno de la respuesta inmune hereditaria a N. parisii. C. elegans es un organismo modelo bien establecido. Sin embargo, otros miembros del género Caenorhabditis, incluidas las especies hermafroditas C. tropicalis y C. briggsae y la especie macho-hembra C. kamaaina también están infectados en diversos grados con N. parisii31. Al hacer pequeñas modificaciones a los protocolos proporcionados, la inmunidad hereditaria también se puede probar en estos animales.
En la etapa 8, se proporcionaron métodos rápidos y sencillos para determinar las diferencias en la susceptibilidad a los microsporidios en gusanos teñidos con DY96 (es decir, % de animales infectados, % de animales grávidos). Sin embargo, a veces estos métodos no son lo suficientemente sensibles como para detectar pequeños cambios en la inmunidad y la aptitud física. Esto se debe a que un gusano con un embrión y muchas células infectadas sería tratado de la misma manera que un gusano con 10 embriones y una célula infectada. Como tal, también se han proporcionado métodos con una resolución más fina para determinar los resultados de la infección en estos animales (es decir, % de carga de parásitos, número de embriones, tamaño del gusano). Si bien se pueden usar ambos métodos, las diferencias fenotípicas suelen ser más pronunciadas con este último, lo que facilita la detección de diferencias significativas. Las adaptaciones futuras a este método pueden incluir el uso de aprendizaje automático para automatizar el análisis.
En el Paso 9, se proporcionaron técnicas para evaluar la invasión de células huésped por microsporidios y el disparo de esporas utilizando FISH. Mientras que DY96 marca microsporidios con una fuerte señal verde fluorescente, otros colorantes, incluyendo la mancha lipofílica Nile Red y la unión a la quitina Calcofluor White, también se pueden usar para teñir N. parisii 30,32,33. El presente protocolo describe la fijación utilizando acetona y funciona bien para detectar microsporidios con tinción DY96 y FISH. Sin embargo, la fijación con paraformaldehído al 4% puede ayudar a preservar la morfología del tejido y mejorar la señal en algunos protocolos de imagen.
Los microsporidios son un patógeno poco estudiado, y gran parte de la biología celular de la infección sigue siendo desconocida. C. elegans es un organismo modelo simple, y estos protocolos pueden servir como una plataforma para comprender los procesos clave involucrados en la infección y la defensa del huésped contra este parásito. La inmunidad hereditaria es un campo emergente, y muchas preguntas siguen pendientes1. ¿Cómo transmiten los padres infectados la inmunidad a la descendencia (aprovisionamiento materno o regulación transcripcional alterada en la progenie)? ¿Qué media la inmunidad en la descendencia (péptidos antimicrobianos u otras proteínas inmunes)? ¿Cómo se heredan las respuestas inmunes heredadas específicas de patógenos y cómo se conserva la inmunidad hereditaria entre especies? Dadas las amplias herramientas disponibles con C. elegans, los estudios basados en el protocolo descrito aquí están bien preparados para responder a estas preguntas fundamentales de la inmunidad heredada.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos agradecidos a Winnie Zhao y Yin Chen Wan por proporcionar comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (Subvención # 522691522691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
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