Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans: Eine umfassende CUT&amp;RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow

Mohammad N. Qasim; Ashley Valle Arevalo; Akshay D. Paropkari; Craig L. Ennis; Suzanne S. Sindi; Clarissa J. Nobile; Aaron D. Hernday

doi:10.3791/63655

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Methodenartikel

Genomweite Profilierung von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen in Candida albicans: Eine umfassende CUT&RUN-Methode und Datenanalyse-Workflow

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DOI:

10.3791/63655

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1. April 2022

Mohammad N. Qasim^*¹^,² , Ashley Valle Arevalo^*¹^,² , Akshay D. Paropkari^*¹^,² , Craig L. Ennis¹^,²^,⁴ , Suzanne S. Sindi³ , Clarissa J. Nobile¹^,⁴ , Aaron D. Hernday¹^,⁴

¹Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, ²Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, ³Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, ⁴Health Sciences Research Institute, University of California, Merced

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode und einen Datenanalyse-Workflow für die Spaltung unter Targets und die Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) im humanen Pilzpathogen Candida albicans.

Zusammenfassung

Regulatorische Transkriptionsfaktoren steuern viele wichtige biologische Prozesse, einschließlich der zellulären Differenzierung, der Reaktionen auf Umweltstörungen und -belastungen sowie der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Krankheitserreger. Die Bestimmung der genomweiten Bindung von regulatorischen Transkriptionsfaktoren an die DNA ist essentiell, um die Funktion von Transkriptionsfaktoren in diesen oft komplexen biologischen Prozessen zu verstehen. Spaltung unter Targets und Freisetzung mittels Nuklease (CUT&RUN) ist eine moderne Methode zur genomweiten Kartierung von In-vivo-Protein-DNA-Bindungsinteraktionen, die eine attraktive Alternative zur traditionellen und weit verbreiteten Chromatin-Immunpräzipitationsmethode mit anschließender Sequenzierung (ChIP-seq) darstellt. CUT&RUN ist für einen experimentellen Aufbau mit höherem Durchsatz geeignet und hat einen wesentlich höheren Dynamikbereich mit niedrigeren Sequenzierungskosten pro Probe als ChIP-seq. Hier werden ein umfassendes CUT&RUN-Protokoll und ein begleitender Datenanalyse-Workflow beschrieben, der auf die genomweite Analyse von Transkriptionsfaktor-DNA-Bindungsinteraktionen im menschlichen Pilzpathogen Candida albicans zugeschnitten ist. Dieses detaillierte Protokoll umfasst alle notwendigen experimentellen Verfahren, vom Epitop-Tagging von Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen bis zur Bibliotheksvorbereitung für die Sequenzierung; Darüber hinaus enthält es einen angepassten Berechnungsworkflow für die CUT&RUN-Datenanalyse.

Einleitung

Candida albicans ist ein klinisch relevanter, polymorpher humaner Pilzpathogen, der in einer Vielzahl von verschiedenen Wachstumsmodi vorkommt, wie der planktonischen (frei schwebenden) Wachstumsweise und als Gemeinschaften eng haftender Zellen, die durch eine extrazelluläre Matrix geschützt sind, die als Biofilm-Wachstumsmodus ^1,2,3 bekannt ist. Ähnlich wie bei anderen Entwicklungs- und zellulären Prozessen ist die Biofilmentwicklung ein wichtiges Virulenzmerkmal von C. albicans, von dem bekannt ist, dass es auf transkriptioneller Ebene durch regulatorische....