Die Bildung von Actomyosin-Bündeln in vitro und die Messung der Myosin-Ensemble-Krafterzeugung mittels optischer Pinzette wird vorgestellt und diskutiert.
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Methodenartikel
Untersuchung der Myosin-Ensemblemechanik in Aktinfilamentbündeln mit einer optischen Pinzette
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Myosine sind Motorproteine, die ATP hydrolysieren, um entlang der Spuren des Aktinfilaments (AF) zu treten, und sind essentiell für zelluläre Prozesse wie Motilität und Muskelkontraktion. Um ihre krafterzeugenden Mechanismen zu verstehen, wurde Myosin II sowohl auf Einzelmolekülebene (SM) als auch als Motorteams in vitro mit biophysikalischen Methoden wie optischem Trapping untersucht.
Diese Studien zeigten, dass sich das Verhalten der Myosinkrafterzeugung stark unterscheiden kann, wenn man von der Einzelmolekülebene in einer Drei-Perlen-Anordnung zu Gruppen von Motoren übergeht, die auf einer starren Perlen- oder Deckglasoberfläche in einer Gleitanordnung zusammenarbeiten. Diese Assay-Konstruktionen erlauben es jedoch nicht, die Gruppendynamik von Myosin innerhalb der viskoelastischen Strukturhierarchie zu bewerten, wie dies innerhalb einer Zelle der Fall wäre. Wir haben eine Methode mit optischen Pinzetten entwickelt, um die Mechanik der Krafterzeugung durch Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit mehreren Aktinfilamenten interagieren.
Diese Actomyosin-Bündel erleichtern die Untersuchung in einer hierarchischen und konformen Umgebung, die die motorische Kommunikation und die Ensemblekraftabgabe erfasst. Die anpassbare Natur des Assays ermöglicht es, experimentelle Bedingungen zu ändern, um zu verstehen, wie Modifikationen am Myosin-Ensemble, Aktinfilamentbündel oder der Umgebung zu unterschiedlichen Kraftausgängen führen.
Einleitung
Motorproteine sind lebenswichtig und wandeln chemische Energie in mechanische Arbeit um 1,2,3. Myosinmotoren interagieren mit Aktinfilamenten, indem sie Schritte entlang der Filamente ähnlich einer Spur machen, und die Dynamik von Aktin-Myosin-Netzwerken führt unter anderem Muskelkontraktion, Zellmotilität, den kontraktilen Ring während der Zytokinese und die Bewegung der Fracht innerhalb der Zelle durch 3,4,5,6,7,8
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Protokoll
1. Deckgläser ätzen
- 100 g KOH werden in 300 mL 100% Ethanol in einem 1.000 ml Becherglas gelöst. Mit einem Rührbalken umrühren, bis sich der Großteil der KOH aufgelöst hat.
ACHTUNG: Konzentrierte KOH-Lösung kann Verbrennungen und Schäden an der Kleidung verursachen. Tragen Sie Handschuhe, Augenschutz und einen Laborkittel. - Deckgläser einzeln in Deckglas-Reinigungsgestelle legen.
HINWEIS: Die Racks sind mit Schlitzen ausgestattet, die einzelne Deckgläser im Abstand halten, um das Ätzen und Spülen auf jeder Seite des Deckglases zu ermöglichen, Abflusslöcher im Boden und aus Material, das den rauen Ätzbedingungen standhält. Sie ....
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Ergebnisse
Die Durchflusszellen, die die Actomyosin-Bündelsysteme enthalten, haben ein Standarddesign, bestehend aus einem Objektträger und einem geätzten Deckglas, das durch einen Kanal aus doppelseitigem Klebeband getrennt ist (Abbildung 1). Der Assay wird dann vom Deckglas bis zur Verwendung von abgestuften Einführungen, wie im Protokoll beschrieben, erstellt. Der endgültige Assay besteht aus Rhodamin-markierten Aktinfilamenten; die gewünschte Myosinkonzentration (1 μM wurde für die repräsentativen .......
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Diskussion
Eine In-vitro-Studie mit optischen Pinzetten in Kombination mit Fluoreszenzbildgebung wurde durchgeführt, um die Dynamik von Myosin-Ensembles zu untersuchen, die mit Aktinfilamenten interagieren. Aktin-Myosin-Aktin-Bündel wurden unter Verwendung von Muskelmyosin II, Rhodamin-Aktin an der Unterseite des Bündels und auf der Deckglasoberfläche und 488-markierten, biotinylierten Aktinfilamenten auf der Oberseite des Bündels zusammengesetzt. Aktinprotein aus Kaninchenmuskeln wurde unter Verwendung von allgemeinen Akt.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Diese Arbeit wird teilweise vom University of Mississippi Graduate Student Council Research Fellowship (OA), dem University of Mississippi Sally McDonnell-Barksdale Honors College (JCW, JER), dem Mississippi Space Grant Consortium unter der Fördernummer NNX15AH78H (JCW, DNR) und der American Heart Association unter der Fördernummer 848586 (DNR) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Aktinprotein (Biotin): Skelettmuskel | Zytoskelett | AB07-A | Biotinyliertes Aktinprotein |
| Aktinprotein, Kaninchenskelett | Zytoskelett | AKL99-A | Aktinprotein |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Aktinstabilisator und Alexa Fluor 488 Färbung |
| ATP | Fisher scientific | BP413-25 | Erforderlich für Aktin Assemblierung und Motilität des Myosins |
| Beta-D-Glukose | Fisher Scientific | MP218069110 | Teil eines Sauerstoffabscheidesystems zur Reduzierung der Photobleiche während der Fluoreszenzbildgebung |
| Blotting Grade Blocker (Kasein) | Biorad | 1706404 | Wird verwendet, um die Oberfläche vor unspezifischer Bindung |
| von CaCl2 | Fisher | Scientific C79500 | zu schützenCalciumchlorid bietet die notwendige Kontrolle über die Dynamik des Aktin-Myosin-Netzwerks |
| Katalase | Fisher wissenschaftliche | ICN10040280 | Teil eines Sauerstofffängersystems zur Reduzierung der Photobleiche während der Fluoreszenzbildgebung |
| Deckgläser | Fisher scientific | 12544C | Wird zur Herstellung von Durchflusszellen |
| DTT | Fisher scientific | AC327190010 | Wird zur Puffervorbereitung verwendet |
| Ethanol | Fisher scientific | A4094 | Regent zur Reinigung von Deckgläsern |
| Glukoseoxidase | Fisher scientific | 34-538-610KU | Teil des Sauerstofffängersystems zur Reduzierung der Photobleiche während der Fluoreszenzbildgebung |
| KCl | Fisher scientific | P217-500 | Wird zur Puffervorbereitung |
| KOH | Fisher scientific | P250-1 | Wird zum Ätzen und Einstellen von Deckgläsern verwendet Puffer |
| pH MgCl2 | Fisher scientific | M33-500 | Wird zur Puffervorbereitung |
| verwendet Objektträger Objektträger | Fisher scientific | 12-544-2 | Wird zur Herstellung von Flusszellen |
| verwendet Myosin II-Protein: Skelettmuskel von Kaninchen | Zytoskelett | MY02 | Myosin-Motorprotein in voller Länge, isoliert aus dem Skelettmuskel von Kaninchen |
| Nanotracker2 | Bruker/JPK | NT2 | Optisches Falleninstrument |
| Poly-l-Lysin | Sigma-Aldrich | P8920 | Erleichtert die Adhäsion von Aktinfilamenten auf der Glasoberfläche des Deckglases |
| Rhodamin Phalloidin | Zytoskelett | PHDR1 | Aktinstabilisator und Rhodamin Fluoreszenzfärbung |
| Sreptavidin Kügelchen, 1 μ m | Spherotech | SVP-10-5 | Optischer Fanggriff |
| Tris-HCl | Fisher scientific | PR H5121 | Wird für die Puffervorbereitung |
Referenzen
- Goldstein, L. S. Kinesin molecular motors: transport pathways, receptors, and human disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (13), 6999-7003 (2001).
- Lee Sweeney, H., Holzbaur, E. L. F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
