Summary
يسمح الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وتطهير الدماغ باستخدام طريقة CLARITY بالتحقيق في عدد كبير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وقت واحد.
Abstract
إن الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وإزالة الأنسجة باستخدام طريقة CLARITY يجعل من الممكن التحقيق في وقت واحد في عدة أنواع من خلايا الدماغ وتفاعلاتها. يتيح نقل النواقل الفيروسية وضع علامات على أنواع الخلايا المتنوعة بألوان فلورية مختلفة داخل نفس الأنسجة. يمكن تحديد الخلايا وراثيا عن طريق النشاط أو الإسقاط. باستخدام بروتوكول CLARITY المعدل ، نما حجم العينة المحتملة للخلايا النجمية والخلايا العصبية بمقدار 2-3 أوامر من الحجم. يسمح استخدام CLARITY بتصوير الخلايا النجمية الكاملة ، والتي هي أكبر من أن تتناسب بالكامل مع شرائح ، وفحص somata بجميع عملياتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة للتحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية وأنواع الخلايا العصبية المختلفة ، أي عدد الخلايا العصبية الهرمية في كل مجال من مجالات الخلايا النجمية أو القرب بين الخلايا النجمية ومجموعات الخلايا العصبية المثبطة المحددة. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيفية تطبيق هذه الأساليب.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، زادت معرفة وظيفة الخلايا النجمية وكيفية تفاعلها مع الدوائر العصبية بشكل كبير. يمكن للخلايا النجمية التأثير على اللدونة1,2 ، والمساعدة في استعادة الخلايا العصبية بعد الإصابة3,4 ، وحتى تحفيز التقوية العصبية الجديدة ، حيث أظهرت الدراسات الحديثة أهمية الخلايا النجمية في اكتساب الذاكرة ومكافأتها ، والتي كانت تعتبر سابقا وظائف عصبية بحتة 5,6,7 . ميزة ذات أهمية خاصة في أبحاث الخلايا النجمية هي الترتيب المكاني للخلايا ، والتي تحافظ على منظمات مكانية فريدة من نوعها في الحصين وهياكل الدماغ الأخرى8،9،10. على عكس التشعبات العصبية التي تتشابك بين سوماتا الخلية ، تعيش الخلايا النجمية الحصين في مناطق يمكن تمييزها بصريا مع تداخل طفيف بين عملياتها ، مما يخلق مجالات متميزة8،11،12،13. الأدلة التي تدعم مشاركة الخلايا النجمية في الدوائر العصبية لا تدعم عدم وجود وصف تشريحي مفصل لمثل هذه المجموعات والخلايا العصبية في مجالاتها14.
تم تعميم إجراءات نقل النواقل الفيروسية ، إلى جانب الحيوانات المعدلة وراثيا (TG) ، كمجموعة أدوات للتحقيق في هياكل الدماغ ووظائفه وتفاعلات الخلايا15,16. يسمح استخدام المروجين المختلفين باستهداف خلايا معينة وفقا لخصائصها الجينية أو مستويات التنشيط17,18 أو أهداف الإسقاط. يمكن للفيروسات المختلفة التعبير عن الفلوروفورات الملونة المختلفة في مجموعات سكانية مختلفة. يمكن الجمع بين الفيروس والتعبير الداخلي للفلوروفورات في TG ، أو يمكن استخدام TG دون الحاجة إلى الفيروسات. تستخدم هذه التقنيات على نطاق واسع لوضع العلامات العصبية ، وبدأت بعض المختبرات في استخدامها مع تعديلات متخصصة لاستهداف أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا النجمية5،9،19.
تمكن تقنية CLARITY ، التي تم وصفها لأول مرة في عام2013 20,21 ، من دراسة شرائح الدماغ السميكة عن طريق جعل الدماغ بأكمله شفافا مع ترك الهياكل المجهرية سليمة. من خلال الجمع بين الطريقتين - نقل النواقل الفيروسية وتطهير الأنسجة - يتوفر الآن خيار فحص التفاعلات المكانية بين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا. تم إجراء معظم دراسات التفاعل بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية على شرائح رقيقة من الدماغ ، مما أدى إلى صور للخلايا النجمية غير المكتملة بسبب مجالاتها الكبيرة ، مما أدى إلى تقييد عدد الخلايا التي تم تحليلها بشكل جذري. يسمح استخدام تقنية CLARITY بتوصيف دقة الخلية الواحدة لمجموعات الخلايا بكميات كبيرة في وقت واحد. لا يوفر تصوير مجموعات الخلايا الموسومة بالفلورسنت في أدمغة واضحة دقة متشابكة ولكنه يسمح بتوصيف شامل للتفاعلات المكانية بين الخلايا النجمية ومجموعة متنوعة من أنواع الخلايا العصبية.
لهذا السبب، قمنا بتسخير هذه التقنيات الحديثة للتحقيق في خصائص الخلايا النجمية في جميع أنحاء CA1 الظهرية، وتصوير جميع الصفيحات (Stratum Radiatum، الطبقة الهرمية، و Stratum Oriens). قمنا بقياس عشرات الآلاف من الخلايا النجمية (مع اختراق فيروسي بنسبة >96٪ 5) ، وبالتالي تحليل معلومات جميع سكان الخلايا النجمية حول CA1. مع الاختراق الفعال للعلامات العصبية ، يمكننا تسجيل التفاعلات بين جميع سكان الخلايا النجمية CA1 والأنواع الأربعة من الخلايا العصبية - بارفالبومين (PV) ، السوماتوستاتين (SST) ، الخلايا العصبية المثبطة VIP ، والخلايا الهرمية المثيرة9.
تم إجراء العديد من التجارب باستخدام مزيج من التألق من TG وناقلات فيروسية مختلفة الألوان (جميع الخلايا المثبطة) ، في حين استخدمت تجارب أخرى (مثيرة) ناقلين فيروسيين يعبران عن فلوروفورات مختلفة تحت مروجين مختلفين9. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا ، بما في ذلك وضع علامات على الخلايا المرغوبة في الدماغ ، مما يجعل الدماغ شفافا باستخدام إجراء CLARITY المعدل ، بالإضافة إلى تصوير وتحليل هياكل الدماغ الكاملة ، باستخدام العديد من الإجراءات والبرمجيات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في الجامعة العبرية وتلبية المبادئ التوجيهية للدليل الوطني للصحة لرعاية واستخدام المختبر.
1. نقل النواقل الفيروسية
ملاحظة: يستخدم نقل النواقل الفيروسية للتعبير عن الفلوروفورات في الدماغ.
- استخدم أطلسا (على سبيل المثال، أطلس ألين الدماغي) لتحديد موقع التنسيق ذي الصلة للمنطقة المستهدفة.
ملاحظة: يمكن العثور على أطالس 3D عبر الإنترنت (على سبيل المثال ، http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - باستخدام الجراحة التجسيمية ، حقن النواقل الفيروسية في بنية الدماغ ذات الصلة. انظر9 للحصول على بروتوكول مفصل.
- انتظر لمدة 3-6 أسابيع للتعبير عن الفلوروفور.
ملاحظة: فترة زمنية قصيرة كافية إذا كانت هناك حاجة فقط إلى وضع علامة على أجسام الخلايا. ستكون هناك حاجة إلى فترة طويلة من الزمن إذا كانت الإسقاطات المحورية ذات صلة بالسؤال ، حيث يستغرق الأمر وقتا أطول حتى تعبر الفلوروفورات في محاور عصبية ، والتي يمكن أن يكون طولها عدة ملليمترات. - التحقق من خصوصية واختراق التعبير الفلوروفوري (سواء من التعبير الفيروسي أو TG) مسبقا (الشكل 1A). قبل الشروع في إجراء CLARITY ، قم بتعيين دماغ واحد على الأقل للشرائح الرقيقة وتأكد من أن تعبير الفلوروفور قوي ومحدد لميزة الخلية المستهدفة.
2. الوضوح
ملاحظة: هذه الطريقة تجعل الدماغ شفافا في غضون 2-6 أسابيع.
- إجراء التروية عبر الجمجمة على الحيوانات باستخدام المياه المالحة الباردة العازلة بالفوسفات (PBS) تليها 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS. قم بإزالة الدماغ واحتفظ به في PFA بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في أنبوب 50 مل أو حاوية مماثلة.
ملاحظة: قبل إجراء التروية عبر الجمجمة ، يجب تخدير الحيوان بعمق. في الأمثلة المقدمة في هذا البروتوكول ، تم تخدير جميع الحيوانات باستخدام الكيتامين والزيلازين (90٪ و 10٪ على التوالي). - استبدل PFA بمحلول هيدروجيل (HS؛ انظر الجدول 1) لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: لا تسمح للمواد بأن تصبح أكثر دفئا من درجة حرارة التبريد (4-8 درجة مئوية) في هذه المرحلة ، أو أن الهيدروجيل سوف يتبلمر. يحتوي النظام المنسق المستخدم في هذا البروتوكول على 2٪ من الأكريلاميد ، على عكس البروتوكولات السابقة التي تشير إلى 4٪ 22 أو 1٪ 17. يتم تفصيل فائدة 2٪ في قسم المناقشة. عند تحضير النظام المنسق ، اعمل على سطح بارد مثلج. تخزينها في -20 درجة مئوية. - تفريغ الغاز
ملاحظة: الغرض من هذه المرحلة هو إزالة جميع الأكسجين الحر من الأنسجة لأن O2 يتداخل مع عملية البلمرة. يمكن استخدام أي غاز غير O 2 (على سبيل المثال ، N 2 ، CO2) ؛ يوصى باستخدام N2.- انقل N2 من الخزان عبر أنبوب مرن 5 مم (داخلي) ، متصل بإبرة 19 G في نهايتها (الشكل 1B).
- اصنع ثقبين صغيرين (بعرض الإبرة) في غطاء الأنبوب: أحدهما لإدخال الغاز والآخر للسماح للهواء بمغادرة الأنبوب (الشكل 1C).
- قم بتوصيل الأنبوب من غاز N2 بالأنبوب واستبدل الغازات لمدة 30 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بإزالة الأنبوب وقم بإغلاق الثقوب على الفور باستخدام طين النمذجة على كل أنبوب (الشكل 1D).
- انقل الأنابيب المختومة المنزوعة الغاز إلى حمام 37 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة لبلمرة HS ، والتي ستصبح هلام. احرص على عدم هز الأنابيب (الشكل 1E).
- استخرج الدماغ من الأنبوب وقم بإزالة الجل المبلمر بلطف من حوله باستخدام مناديل المختبر. تأكد من عدم بقاء أي هلام متبقي ملتصقا بسطح الأنسجة، لأنه قد يتفاعل مع المحلول في الخطوات التالية، مما يثبط عملية إزالة الأنسجة (الشكل 1F).
ملاحظة: نظرا لأن الجل يحتوي على PFA ، يجب أن يتم الاستخراج تحت غطاء الدخان. - قم بتقطيع الدماغ إلى شرائح إذا كان السؤال المطروح لا يتطلب سوى جزء منه. قسمها إلى نصفين أو إلى شرائح سميكة جدا تحتوي على جميع مجالات الاهتمام (الشكل 1G).
- ضع الشرائح في محلول المقاصة الأول (CS1، انظر الجدول 2) في حاوية جديدة ورجها بسرعة 70 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- اتبع الخطوات الموضحة أدناه لنقل الدماغ من CS1 إلى حل المقاصة الثاني (CS2، انظر الجدول 2).
- قم بإعداد أنبوب مثقب للدماغ مقدما (الشكل 1H).
- سخني CS2 إلى 40-45 درجة مئوية في كوب كبير بما يكفي لاحتواء الأنبوب. افعل ذلك على صفيحة مع مقلب. تأكد من أن درجة الحرارة لا تصل إلى 55 درجة مئوية لمنع تبييض البروتينات المعبر عنها.
- ضع الكأس المملوء ب CS2 والأنبوب المثقب على جهاز تحريك (كوب سعة 2 لتر في الشكل 1I). اضبط معدل تحريك معتدل يتسبب في تدفق السائل دون تشويه الأنسجة.
ملاحظة: في غضون 2-6 أسابيع ، ستصبح الأنسجة شفافة (تبدأ العملية في المحيط وتتحرك إلى الداخل نحو هياكل الدماغ المركزية). القرار بشأن متى تكون الأنسجة "واضحة بما فيه الكفاية" متروك للحكم الشخصي. يجب أن يكون الدماغ شفافا بما فيه الكفاية للتصوير تحت المجهر دون تدخل (الشكل 1J غير واضح بما فيه الكفاية; الشكل 1K واضح بما فيه الكفاية). تجاوز النقطة التي تكون فيها الأنسجة واضحة بما فيه الكفاية قد يسبب فقدان صلابة الأنسجة.
- نقل من CS2 إلى PBST (0.5٪ Triton X-100 في PBS ، انظر الجدول 2) في حاوية جديدة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف (70 دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: في PBST ، ستصبح الأنسجة بيضاء (الشكل 1L). سيعود الوضوح (ويتحسن) عند تضمينه في حل مطابقة معامل الانكسار (RIMS، راجع الخطوة 2.14). - يستعاض عن PBST ب PBST جديد. يحفظ تحت نفس الظروف (37 درجة مئوية مع اهتزاز خفيف) لمدة 24 ساعة أخرى.
- استبدل PBST مرة أخرى ب PBST جديد واحتفظ به في RT لمدة 24 ساعة.
- نقل إلى PBS في RT لمدة 24 ساعة.
- استبدل PBS واتركه في RT لمدة 24 ساعة إضافية.
- قم بإزالة الدماغ من PBS وانقله إلى RIMS عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: في البداية، قد تحيط التموجات في RIMS بالدماغ. وقد صمم هذا البروتوكول وتحقق من صحته باستخدام حافتين تجاريتين محددتين (انظر الجدول 3). ومع ذلك ، يجب ألا يختلف البروتوكول عند استخدام RIMS أخرى (تجارية أو ذاتية الصنع). - احتفظ بالأنسجة في RT لمدة 24 ساعة أخرى أو حتى يصل المحلول إلى التوازن الكامل ، أي عندما يصبح النسيج شفافا ، ولم يعد المحلول يحتوي على أي تموجات مرئية (الشكل 1M).
- إذا كان النسيج شفافا ، فانتقل إلى إعداد الغرفة. إذا أصبح النسيج في هذه المرحلة أبيض بدلا من شفاف (بسبب تجمعات جزيئات SDS المتبقية) ، فقم بتنظيف العينة مرة أخرى عن طريق تكرار الخطوتين 2.9 و 2.10 ، ونقل الأنسجة إلى CS2 (الخطوة 2.8) لبضعة أيام ، تليها جميع الخطوات حتى الخطوة 2.15.
3. إعداد الغرفة
ملاحظة: تتطلب كل عينة شريحة بها غرفة تصوير يتم وضع العينة فيها.
- ضع العينة في منتصف الشريحة.
- باستخدام مسدس الغراء الساخن ، قم بإنشاء جدران على حواف الشريحة ، تقريبا مثل الأنسجة. تأكد من ترك فجوة صغيرة (حوالي 5 مم) في أحد الزوايا (الشكل 2A ، B).
- ضع 1-2 قطرات من RIMS على العينة للحفاظ على السطح العلوي رطبا ومنع تشكل الفقاعات بين الغطاء والأنسجة.
- مباشرة بعد تطبيق قطرات RIMS ، أضف الطبقة الأخيرة من الغراء الساخن إلى الجدران (بحيث تصل إلى ارتفاع الدماغ / الشريحة) وتقدم على الفور (بينما لا يزال الغراء الساخن سائلا) إلى الخطوة 3.5.
- أغلق الجزء العلوي بغطاء ، وضعه بالتساوي قدر الإمكان على الجزء العلوي من طبقة الغراء الساخن التي لا تزال دافئة (الشكل 2C).
- املأ الغرفة بالحافات من خلال الفجوة المتبقية في جدران الغراء الساخن (الشكل 2D ، E).
- أغلق الفجوة بالغراء الساخن. لا تترك أي هواء في الداخل (الشكل 2F).
- إذا امتدت جدران الغراء الساخن خارج حدود الشريحة ، فقم بقطع الحواف الممتدة (الشكل 2G).
- إذا كان الهدف المستخدم للتصوير مغمورا ، فأضف 2-3 مم أخرى من الغراء إلى الجدران فوق الغطاء بحيث يستمر محلول الغمر لفترة أطول (الشكل 2H).
4. التصوير (متحد البؤرة أو ثنائي الفوتون)
- تحقق مما إذا كانت المرحلة يمكن أن تحمل الغرفة ، حيث يمكن أن يصل سمك الغرفة إلى عدة ملليمترات.
ملاحظة: على سبيل المثال، تم تجهيز المجهر البؤري (انظر جدول المواد) المستخدم في هذا البروتوكول بعدة مراحل (على سبيل المثال، دائري، مستطيل). أيا كانت المرحلة التي يتم اختيارها لعقد الغرفة لا أهمية لها طالما أن معلماتها تناسب أحجام الغرفة. - اعمل بهدف بمسافة عمل كافية، أي مسافة عمل دنيا ≥3 مم، حيث قد تكون منطقة الدماغ ذات الأهمية بضعة ملليمترات في العمق، وقد لا يكون الغطاء مستقيما تماما كما تم وضعه يدويا.
ملاحظة: كعرض توضيحي، تم الحصول على النتائج المعروضة في الشكل 1 والفيديو 1 والفيديو 2 تحت مجهر ثنائي الفوتون باستخدام هدف غمر مائي 16x مع مسافة عمل 3 مم وتكبير 2.4 للحصول على مجال رؤية 652 × 483 ميكرومتر ومكدس z مع فترات زمنية 0.937 ميكرومتر بين الطائرات. - قم بإجراء تصوير متعدد المناطق ، والذي قد يستغرق بضع ساعات أو حتى أيام. تأكد من وجود مساحة تخزين مجانية وافرة في الكمبيوتر حيث يمكن أن يصل حجم كل صورة إلى عشرات جيجابت.
ملاحظة: قد يؤدي التصوير الواضح إلى عمق مقاطع صور أكثر بكثير. لذلك ، يجب أن تكون الكثافات المستخدمة لالتقاط التعبير منخفضة نسبيا لمنع الإفراط في التعبير أثناء جمع الصورة. - بالنسبة لأهداف الغمر ، تحقق من السائل بشكل روتيني أثناء التصوير واستكمله بسائل إضافي إذا لزم الأمر.
ملاحظة: أثناء تصوير البيانات المعروضة في الفيديو 3 ، تمت إضافة الماء إلى سطح الغرفة كل 6-8 ساعات لمكافحة التبخر. - بعد الحصول على الصورة، قم بعرضها وتحليلها باستخدام العديد من حزم البرامج المختلفة.
ملاحظة: تتضمن البرامج الموصى بها Imaris و SyGlass لكل من التصور والتحليل. تم وصف خط الأنابيب الدقيق لإعادة بناء الخلايا النجمية المثلى باستخدام برنامج Imaris سابقا9. باختصار ، كانت ميزات Imaris المستخدمة في هذه الدراسة عبارة عن خيوط لإعادة بناء هياكل الخلايا بالكامل والبقع لاستخراج الموقع في مساحة جميع somata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يؤدي التطهير الناجح لشرائح أنسجة المخ السميكة إلى مجموعة جديدة من الأسئلة التي يمكن طرحها فيما يتعلق بخصائص مجموعات الخلايا الكبيرة بدلا من خصائص الخلايا المفردة أو المجموعات المجاورة من الخلايا. لتحقيق نتائج ناجحة ، يجب على المرء الالتزام الصارم ببروتوكول CLARITY ، حيث توجد مجموعة واسعة من المعلمات التي يجب مراعاتها لتقليل التباين بين العينات (على سبيل المثال ، النسبة المئوية للوضوح ، ومعلومات التألق ، ومعلمات التورم).
يصف الشكل 1 عملية المقاصة بأكملها من التحقق من صحة تعبير البروتين الفلوري من خلال جميع مراحل طريقة المقاصة. يصف الشكل 2 كيفية إعداد غرفة للأنسجة المصفاة ، مثالية للتصوير تحت مجهر ثنائي الفوتون أو متحد البؤرة. المواد المطلوبة في هذا البروتوكول غير مكلفة للغاية مقارنة بالبروتوكولات الأخرى لإعداد الغرفة.
يعرض الشكل 3 المكعب الموصوف في الفيديو 1 ، حيث يتم عرض أكثر من 300 خلية نجمية في قسم واضح من جزء CA1 من الحصين الفأر. يعرض الشكل 4 المكعب الموصوف في الفيديو 2 ، حيث تظهر كل من الخلايا النجمية والسوماتا العصبية المثيرة في أنسجة شفافة سميكة. يعرض الشكل 5 نصف الكرة الأرضية بأكمله، كما هو موضح في الفيديو 3. يتم عرض الإسقاطات العصبية على مستوى الدماغ من CA1 الظهري (الأخضر ، GFP) و CA1 البطني (الأحمر ، TdTomato).
يعرض الفيديو 1 صورة سميكة للخلايا النجمية الحصين (>300) التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر ثنائي الفوتون بعد إجراء CLARITY. تم توفير التألق عن طريق نقل النواقل الفيروسية الخاصة بالخلايا النجمية. يعرض الفيديو 2 القرب المكاني بين الخلايا النجمية ونوى الخلايا الهرمية الحصينية. يتتبع الفيديو 3 الحزم المحورية عبر نصف الكرة الأرضية بأكمله. المحاور العصبية من القشرة الحركية الأولية ويتم تتبعها مرة أخرى من الحبل الشوكي. يتم تتبع حزمة أخرى من الحصين الظهري نحو أجسام فوق الثدييات. وأخيرا ، فإنه يتتبع حزمة حمراء من المحاور العصبية من أجسام الثدييات نحو أصلها في الحصين البطني. جميع الخلايا المميزة مثيرة بشكل حصري.
الشكل 1: وصف مفصل لعملية المقاصة. (أ) التحقق من صحة التعبير عن الفلوروفور. في هذا المثال، تعبر جميع الخلايا النجمية في جزء CA1 من الحصين الفأر عن بروتين أحمر (TdTomato، مصور باللون الأرجواني)، وتعبر جميع الخلايا العصبية المثيرة عن بروتين أخضر في نواتها (H2B-GFP). تم الحصول على هذه الصورة باستخدام مجهر 2-فوتون. تم التقاط الصورة باستخدام هدف غمر الماء 16x (0.8 NA) مع تكبير 2.4 للحصول على مجال رؤية 652 × 483 ميكرومتر ، عند 15.5 إطارا / ثانية ومكدس z مع فترات 0.937 ميكرومتر بين الطائرات. تم التحقق من الخصوصية والاختراق بواسطة الكيمياء النسيجية المناعية9. (ب) يتطلب نقل غاز N2 من الخزان إلى الأنبوب الذي يحمل الدماغ أنبوبا به إبرة في نهايته. (ج) يتم استبدال الهواء داخل الأنبوب ب N 2 عن طريق إنشاء ثقبين ، أحدهما (السهم العلوي) لتدفق N2عبر الإبرة المتصلة بالأنابيب من خزان الغاز والآخر (السهم السفلي) للتدفق الخارجي. (د) تغطية الثقوب بطين النمذجة مباشرة بعد إزالة الغاز يمنع N2 من الخروج من الأنبوب. (ه) تسخين المحلول المنزوع الغاز لمدة 3.5 ساعة في حمام دافئ. (و) تؤدي البلمرة الناجحة إلى دماغ مضمن في النظام المنسق الهلامي. قد تكون فقاعات الغاز محاصرة في البوليمر. (ز) مباشرة بعد الاستخراج من الجل هو أفضل نقطة للدماغ ليتم قطعها إلى السماكة المطلوبة. (ح) تسمح الأنابيب المثقوبة بتدفق المحلول على التحريك للوصول إلى العينة. (I) يتم الاحتفاظ بالأدمغة داخل الأنابيب المثقوبة عموديا بواسطة حامل عصامي الصنع بحجم مصنوع ليناسب دورقا سعة 2 لتر ، ويقف على موقد تحريك. (ي) مثال على دماغ غير واضح بما فيه الكفاية. يجب تحريك العينة في CS2 لمدة أسبوع آخر تقريبا. (ك) مثال على دماغ واضح بما فيه الكفاية. (L) عند إدخال الدماغ الصافي في PBST ، يصبح النسيج أكثر بياضا من ذي قبل. يرجع هذا التغيير في اللون إلى Triton وسيختفي عند نقله من هذا الحل إلى الحل التالي. (M) بعد >24 ساعة في RIMS ، سيصبح الدماغ شفافا تماما مرة أخرى. الاختصارات: GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. NA = فتحة عددية; HS = محلول هيدروجيل. CS2 = حل المقاصة 2; PBST = محلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على 0.5٪ Triton X-100 ؛ RIMS = حل مطابقة معامل الانكسار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد الغرفة. (أ) تغطي الطبقة الأولى من جدران الغراء الساخن حواف الشريحة وتترك مساحة واسعة بما يكفي لاحتواء الدماغ دون لمس الجدران. يتم ترك ثقب واحد في الزاوية العلوية اليسرى من الشريحة. (ب) إضافة طبقة بعد طبقة للوصول إلى ارتفاع الأنسجة. (ج) غطاء مستقيم (سهم أبيض) يغلق الغرفة. (د) غرفة مملوءة بالجنوط من خلال الفتحة الموجودة في جدران الغرفة. (ه) تمتلئ الغرفة ب RIMS دون ترك فقاعات هواء. (و) سد الثقب في الغرفة بالغراء الساخن لمنع أي تسرب. منظر جانبي. (ز) في هذه المرحلة ، يجب قطع أي بقايا غراء ساخن تمتد فوق حواف الشريحة من الغرفة. (ح) غرفة معدة تجهيزا كاملا، جاهزة للتصوير تحت المجهر. اختصار: RIMS = حل مطابقة معامل الانكسار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: جميع الخلايا النجمية المصورة (AAV1-GFAP::TdTomato، أحمر) في الحصين المسحوب. إطار واحد من الفيديو 1 يلتقط جميع الخلايا النجمية المصورة (AAV1-GFAP::TdTomato، أحمر) في الحصين الشفاف. يتم وصف جميع تفاصيل خصائص الصورة ضمن الفيديو 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الخلايا النجمية (AAV1-GFAP::TdTomato، أحمر) ونوى الخلايا الهرمية الحصينية (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP، أخضر) في أنسجة شفافة سميكة. إطار واحد من الفيديو 2 يظهر كلا من الخلايا النجمية (AAV1-GFAP::TdTomato، أحمر) ونوى الخلايا الهرمية الحصينية (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP، أخضر) في أنسجة شفافة سميكة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: المحاور الخضراء (AAV5-CaMKII::eGFP، الخضراء) والمحاور الحمراء (AAV5-CaMKII::TdTomato). إطار واحد من الفيديو 3 يظهر كلا النوعين من المحاور المحورية المشتقة من عدة مواقع في دماغ الفأر والتي يمكن تتبعها في جميع أنحاء نصف الكرة الأرضية بأكمله. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيديو 1: لقطات لشريحة بسمك >1 مم من الخلايا النجمية الظهرية CA1 الحصين (AAV1-GFAP::TdTomato، أحمر). تم الحصول على الفيديو باستخدام مجهر ثنائي الفوتون باستخدام هدف 16x (0.8 NA) مع تكبير 2.4 بعد إجراء CLARITY. على غرار الشكل 1A ، تم تعيين الفاصل الزمني z-stack إلى 0.937 ميكرومتر. تم توفير التألق عن طريق نقل النواقل الفيروسية الخاصة بالخلايا النجمية. يبلغ عدد الخلايا النجمية في هذا المكعب >300 ، ومعظم العمليات متاحة للتحليل في معظم الخلايا. الاختصارات: NA = الفتحة العددية; AAV = الفيروس المرتبط بالغدية; GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: الخلايا النجمية ونوى الخلايا العصبية المثيرة في مكعب ثلاثي الأبعاد. يحتوي المكعب على جميع الصفيحات من dCA1 في ظل الظروف البصرية المذكورة للشكل 1A والفيديو 1. يعرض هذا المكعب القرب المكاني بين الخلايا النجمية (AAV1-GFAP::TdTomato، أحمر) ونوى الخلايا الهرمية الحصينية (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP، أخضر). الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط بالغدية; GFAP = البروتين الحمضي الليفي الدبقي. CAMKII = الكالسيوم / كيناز البروتين المعتمد على الكالمودولين II ؛ eGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. H2B = histone 2B. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 3: تتبع الحزم المحورية عبر نصف الكرة الأرضية بأكمله. يمكن تتبع المحاور الخضراء (AAV5-CaMKII::eGFP، الخضراء) التي تنتهي عند الحبل الشوكي بسهولة إلى القشرة الحركية الأولية (على بعد أكثر من 7 مم). من الحصين (الجانب الظهري) ، يتم تتبع حزمة أخرى نحو أجسام Supra Mammillary (معظم الجانب البطني من الدماغ) ، وهو أثر يبلغ طوله حوالي 3 مم. يتتبع النصف الثاني من الفيديو حزمة حمراء من المحاور العصبية (AAV5-CaMKII::tdTomato) تنشأ في الحصين البطني عائدة من موقعها المستهدف في أجسام الثدييات. تم التقاط الصورة تحت مجهر أوليمبوس المحدق البؤري بالليزر المسح الضوئي FV1000 باستخدام هدف 4x (0.16 NA) ، وتم الجمع بين عائد استثمار متعدد باستخدام ميزة MATL FluoView لتقديم نصف الكرة بأكمله. الاختصارات: AAV = الفيروس المرتبط بالغدية; CAMKII = الكالسيوم / كيناز البروتين المعتمد على الكالمودولين II ؛ eGFP = بروتين الفلورسنت الأخضر المحسن. NA = فتحة عددية; MATL = الفاصل الزمني متعدد المناطق. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
| محلول هيدروجيل (1 لتر) | |
| مادي | مبلغ |
| VA-044 البادئ | 2.5 غ |
| PFA 4٪ | 900 مل |
| أكريلاميد (40٪) | 50 مل |
| بيساكريلاميد (2٪) | 50 مل |
الجدول 1: تحضير محلول هيدروجيل (1 لتر). يجب تحضير محلول هيدروجيل على سطح بارد مثلج. الترتيب الذي يتم به خلط المكونات ليس مهما. لاحظ أن النسبة المئوية الإجمالية للأكريلاميد هي 2٪ على عكس البروتوكولات المماثلة التي تستخدم إما 1٪ 17 أو 4٪ 22.
| حلول المقاصة (1 لتر) | ||
| مادي | مبلغ | |
| CS1 | CS2 | |
| حمض البوريك (M.W. = 61.83 جم / مول) | 12.366 غ | 3.4 غ |
| الحزب الديمقراطي الصربي | ٨٠ جرام | ٨٠ جرام |
| قاعدة تريس (M.W. = 121.14 جم/مول) | 0 | 12.1 غ |
| الماء المقطر (DW) | املأ إلى 1 لتر | املأ إلى 1 لتر |
| ناوه | الرقم الهيدروجيني 8.5 | |
| 1 لتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 0.5٪ تريتون X-100 | ||
| مادي | مبلغ | |
| برنامج تلفزيوني | 995 مل | |
| تريتون X-100 | 5 مل | |
الجدول 2: إعداد محاليل المقاصة 1 و 2 (1 لتر) و 1 لتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.5٪ Triton X-100. يمكن تحضير حلول المقاصة مسبقا والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة. يجب التعامل مع أي محلول يحتوي على حمض البوريك و SDS تحت غطاء الدخان لتجنب الاستنشاق أو ملامسة الجلد إما SDS أو حمض البوريك. يجب إضافة NaOH في CS1 أخيرا لتعيين الرقم الهيدروجيني عند 8.5. يجب وضع كل عينة دماغية في ما لا يقل عن 5-25 مل من CS1 والاحتفاظ بها بين عشية وضحاها للانتشار الكافي. الاختصارات: CS1 = حل المقاصة 1 ؛ SDS = كبريتات دوديسيل الصوديوم. M.W. = الوزن الجزيئي.
| اسم المنتج | الميزة الأساسية | العيب الأساسي |
| رابي كلير | تبقى العينة شفافة | تورم الأنسجة |
| رابي كلير سي اس | تتقلص العينة مرة أخرى إلى الحجم الطبيعي | قد تفقد العينة الشفافية |
الجدول 3: خيارات RIMS مع مزايا وعيوب. Rapiclear (RC ، RI = 1.47) أو Rapiclear الخاص بالوضوح (CSRC ، RI = 1.45). الفرق الأساسي بين هذين الحلين هو أنه في حين أن CSRC يقلص الدماغ الصافي مرة أخرى إلى حجمه الأصلي ، فإن محلول RC لا يفعل ذلك ، تاركا العينة التي تم مسحها منتفخة قليلا. اختصار: RI = معامل الانكسار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقدم طرق تطهير الأنسجة أداة ثورية في أبحاث الدماغ ، مما يدعو إلى أسئلة لم يكن من الممكن طرحها من قبل. من استهداف خصائص مجموعة صغيرة من الخلايا أو خلية واحدة أو حتى مشبك واحد ، يتيح CLARITY الآن استهداف إجمالي عدد الخلايا أو ميزات الاتصال بعيدة المدى باستخدام الفلوروفورات ذات الصلة.
نتيجة التعبير عن الفلوروفور والجمع بين إجراء الوضوح ليست ثنائية. قد تتداخل العديد من العوامل مع الإجراء مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل. أولا ، يجب التحقق من تعبير الفلوروفور مقدما. نظرا لأن إجراء CLARITY يسبب بعض فقدان المعلومات ، فإن التعبير الكافي عن بروتين الفلوروفور أمر بالغ الأهمية لصحة الصورة في نهاية عملية CLARITY. ثانيا ، يجب التعامل مع التروية عبر الجمجمة بعناية ، مما يضمن خروج جميع الدم من الدماغ ، لأن التألق الذاتي للدم سيؤدي إلى بيانات غير موثوقة في شرائح سميكة. ثالثا ، يجب التعامل مع جميع المعلمات التي نوقشت في البروتوكول في كل خطوة من خطوات عملية التطهير بدقة ، على سبيل المثال ، بقايا O2 في النظام المنسق قبل أن تمنع البلمرة أو عدم دقة درجة الحرارة في كل مرحلة التفاعل الكيميائي بين المواد النشطة من الحدوث.
توصي البروتوكولات السابقة 17,22 بتركيزات مختلفة من الأكريلاميد في HS. الغرض الأساسي من مادة الأكريلاميد هو تثبيت الجزيئات بشكل أفضل مع بقايا الأمين (البروتينات والأحماض النووية). تؤثر التعديلات الطفيفة في التركيز بشكل كبير على عملية التطهير بأكملها: إذا كان التثبيت مضغوطا للغاية ، فلن تنفصل جزيئات الدهون عن الأنسجة ، وستكون عملية التطهير طويلة دون داع أو تؤدي إلى أدمغة غير شفافة. ومع ذلك ، فإن التركيزات المنخفضة من الأكريلاميد لن تحافظ بشكل كاف على بنية الدماغ بمجرد خلوها من الدهون. في هذا البروتوكول ، يتم تعيين نسبة الأكريلاميد لتوفير التوازن الدقيق للأنسجة المثبتة ولكن الواضحة.
تتم معظم عملية التطهير في CS2 ، ويجب اختبار مستوى وضوح الأنسجة يوميا. يعد تنظيف PBST خطوة أساسية بين حلول المقاصة وحلول مطابقة معامل الانكسار لأنه ينظف جزيئات SDS المتبقية ، والتي قد تتفاعل مع RIMS. من الممكن أيضا الحفاظ على الأنسجة الواضحة في PBST (0.5٪) إلى أجل غير مسمى إذا لم تكن هناك حاجة بعد إلى إعداد الغرفة.
عند وضع الدماغ في RIMS ، يجب على المرء أن يصبح على دراية بفوائد وقيود الحلول. على سبيل المثال ، سوف يسبب RapiClear شفافية كاملة حتى في الأنسجة شبه الواضحة ، ولكنه سيسبب أيضا بعض التورم ، والذي لا ينبغي إهماله عند تحليل البيانات. تشير القياسات السابقة9 إلى توسع متساو على طول جميع المحاور (أي المحاور الظهرية البطنية والأمامية والخلفية والجانبية الإنسية) ، مما يجعل من الممكن حساب مؤشر التورم مقارنة بالشرائح الرقيقة من نفس منطقة الدماغ. استخدام RapiClear الخاص ب CLARITY يزيل التورم. ومع ذلك ، إذا بقيت أي بقايا SDS في الأنسجة ، فسوف تتجمع في كتل غير شفافة.
فائدة أخرى لهذا البروتوكول المعدل هي تكلفته. تقترح البروتوكولات السابقة أنواعا مختلفة من الغراء لإنشاء غرفة يمكنها الاحتفاظ بالدماغ في RIMS. في هذا البروتوكول ، نستخدم ببساطة الغراء الساخن. لا يتفاعل مع الحلول ، وهو متاح للشراء في كل مكان ، وسهل الاستخدام ، وأرخص بكثير من المواد اللاصقة المقترحة من قبل.
يمكن للبيانات التي يتم الحصول عليها من تصوير عينات الدماغ السميكة أن تصف مجموعات الخلايا بأكملها ، أو الاتصال عبر هياكل الدماغ ، أو تتبع محور عصبي واحد عبر مسافات كبيرة (فيديو 3). على الرغم من أن الأسئلة المتعلقة بهذه الخصائص قد طرحت من قبل ، إلا أن صحة البيانات التي يمكن تحقيقها الآن باستخدام شرائح دماغية سميكة تتحسن بشكل كبير على الطرق السابقة المعرضة للخطأ لتراكب الصور ذات الشرائح الرقيقة.
تمنح عملية CLARITY إزالة ناجحة وموحدة للشرائح السميكة - من عدة ملليمترات إلى تصوير الدماغ بالكامل. يقلل التطهير السلبي (أي عدم استخدام ETC) من خطر إلحاق الضرر بالأنسجة ، والوقت الذي يتم فيه غمر العينات في محاليل التطهير بحيث لا تؤثر على الكفاءة العالية لحفظ البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 803589)، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة ISF رقم 1815/18)، والمنح الكندية الإسرائيلية (CIHR-ISF، المنحة رقم 2591/18). نشكر نيشاما نوفيك على تعليقه على المخطوطة بأكملها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
