Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe und deren Differenzierung in die Skelettmuskellinie

Der menschlichen Nabelschnur wird ein robustes Reservoir mesenchymaler Stammzellen zugeschrieben, die derzeit aufgrund ihrer robusten Proliferations- und Differenzierungsraten, immunmodulatorischen Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, Zellen aus allen drei Keimschichten 1 zu erzeugen, für regenerative Therapien erforscht^werden. Das Nabelschnurgewebe besteht aus mehreren Kompartimenten wie dem Nabelschnurblut, dem Nabelvenensubendothel und dem Wharton-Gelee (WJ), das an sich drei ununterschiedliche Regionen umfasst - die perivaskuläre Zone, die intervaskuläre Zone und das Subamnion oder die Nabelschnurauskleidung (CL)². Während uMSCs aus all diesen verschiedenen Regionen isoliert werden können und wichtige MSC-Marker weitgehend ausdrücken, gibt es keine Klarheit darüber, ob diese Kompartimente die gleiche Population von uMSCs enthalten oder Unterschiede in ihren Differenzierungspotenzen^{aufweisen 3}. Daher erfordern Protokolle für die Isolierung von uMSCs eine größere Präzision in ihrem Modus und Bereich der Isolation, die robuste Charakterisierung von Differenzierungspotentialen und schließlich eine vergleichende Analyse aus verschiedenen Kompartimenten der Schnur.

In diesem Zusammenhang haben nur wenige Studien Unterschiede in den proliferativen und differenzativen Potentialen von uMSC zwischen verschiedenen Teilen der Schnur gezeigt. Von diesen ergaben vergleichende Analysen zwischen uMSCs, die aus den CL- und WJ-Regionen isoliert wurden, ein größeres Proliferationspotenzial in CL-abgeleiteten uMSCs ^3,4. In einer separaten Studie schnitten WJ-abgeleitete uMSCs in Proliferationsassays im Vergleich zu perivaskulären Zellen (HUCPV) besser ^ab.5. Bei der Untersuchung von Unterschieden zwischen aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs und aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs, die keine vaskuläre Kontamination aufweisen, wurde eine differentielle Expression der wichtigsten MSC-Marker zwischen den beiden Kompartimenten sowie erhöhte Proliferationsraten in Nabelschnurgewebe-abgeleiteten uMSCs^{berichtet 6}.

Von den verschiedenen Studien, die die Differenzierungspotenziale von uMSCs hauptsächlich in Gewebe der Mesoderm-Linie wie osteogene, adipogene und chondrogene Linien untersuchen, haben nur sehr wenige detaillierte Protokolle für die myogene Differenzierung und anschließende Charakterisierung sowie vergleichende Analysen zwischen verschiedenen Nabelschnurkompartimenten geliefert. In diesem Zusammenhang haben wir ein robustes Muskeldifferenzierungsprotokoll entwickelt und beobachtet, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs im Vergleich zu Nabelschnurblut überlegene myogene Differenzierungsfähigkeiten^{aufweisen 6}. Hier wird ein schrittweises Protokoll für die Isolierung von uMSCs aus dem gesamten Nabelschnurgewebe ohne Zellen, die mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, ihre Charakterisierung und ihre Differenzierung in die myogene Linie detailliert beschrieben.

Die Verwendung von Nabelschnurgewebe in dieser Studie wurde vom Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), dem Institutional Ethics Committee, dem Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), dem Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana, und dem Institutional Biosafety Committee, THSTI, genehmigt. Menschliche Nabelschnurgewebeproben wurden aus Terminlieferungen zum Zeitpunkt der Geburt entnommen. Von den Probanden wurde eine informierte schriftliche Zustimmung eingeholt. Alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

1. Isolierung von MSCs aus Nabelschnurgewebe

1. Zum Zeitpunkt der Lieferung schneiden Sie mindestens 5 cm Schnur, vorzugsweise näher an der Plazenta, und sterilisieren Sie die Schnur, indem Sie die äußere Oberfläche mit 70% Ethanol abtupfen. Übertragen Sie das Stück Nabelschnurgewebe nacheinander von einem 50-ml-Sammelröhrchen, das phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält, zu einem anderen, das dasselbe enthält. Transportieren Sie das Sammelrohr mit dem Namen des Probanden auf Eis innerhalb von 1 Stunde ins Labor.
   HINWEIS: Bei einer größeren Studie kann es sinnvoll sein, die Proben mit einem Barcode zu versehen, um ihre Verfolgung während der gesamten Studie zu ermöglichen. Wichtig ist, dass allen Mitarbeitern, die mit menschlichem Gewebe umgehen, das vollständige Regime des Hepatitis-B-Impfstoffs angeboten wird.
2. Schalten Sie im Labor das UV für 25 Minuten in der BSL-2-Haube ein, um autoklavierte Instrumente und Pipetten vor dem Gebrauch zu sterilisieren.
3. Überführen Sie das Schnurgewebestück aus dem Entnahmeröhrchen in eine 10 cm 2 große mit Gewebekultur behandelte Schale, die PBS enthält, das mit 5 g/L Glukose, 50 μg/ml Gentamicin,^2,5 μg/ml Amphotericin B, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin angereichert ist (schematisch in Abbildung 1).
4. Schneiden Sie das Nabelschnurgewebe mit einem Skalpell vertikal entlang seiner Längsachse auf, um zwei halbzylindrische Stücke zu erhalten. Aufgrund der Nabelschnurtorsion und der Schleimhautoberfläche das Gewebe mit einer Pinzette in der anderen Hand festnageln.
5. Beobachten Sie an dieser Stelle die Nabelschnurarterien und die Vene und entfernen Sie die Blutgefäße, indem Sie sie mit einem Skalpell in eine Richtung von der Oberfläche abkratzen. Spülen Sie das Nabelschnurgewebe noch einmal in PBS, um das gesamte mit dem Gewebe verbundene Restblut zu entfernen. Stellen Sie sicher, dass das Abkratzen schonend ist, um die Integrität der Zellen in der WJ, die die Gefäße umgibt, zu erhalten.
6. Zerkleinern Sie jede Hälfte des Schnurgewebes in 0,5 cm³ große Fragmente und legen Sie die Fragmente mit der luminalen Oberfläche nach unten auf die Schale. Brüten Sie die Schale kurz für 10 min in einer 37 °C befeuchteten Kammer, die 5% CO₂ enthält.
7. Nach der Inkubation die Schale mit den Nabelschnurgewebestücken mit 20 ml Medium, das MEM Alpha Modification ohne L-Glutamin, Ribo- und Desoxyribonukleoside, 15% fetales Rinderserum (nicht hitzeinaktiviert) und 50 μg/ml Gentamycin enthält, überfluten. Fügen Sie das Wachstumsmedium vorsichtig an den Seiten hinzu, um zu verhindern, dass sich die Gewebeexplantationen von ihrer Orientierung lösen. Fügen Sie überschüssiges Medium hinzu, um einen Bruchteil zu berücksichtigen, der während der Inkubation von den Gewebeexplantaten aufgesaugt wird.
8. Nach 3 Tagen Inkubation frischen Medium zu den Kulturen hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass die Kulturen vor Stößen und Bewegungen der Explantate geschützt sind, während Sie mit dem Geschirr umgehen.
9. Nach 1 Woche die Gewebefragmente einzeln mit steriler Pinzette entfernen und mit geeigneten Biohazard-Beuteln zur Entsorgung entsorgen. Behalten Sie das vorhandene Medium bei und fügen Sie 10 ml frisches Wachstumsmedium hinzu. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium alle 4 Tage, bis einzelne Kolonien einen Zusammenfluss von 70% erreichen.
   HINWEIS: Es ist wahrscheinlich, dass die Zellen nicht gleichmäßig in der Schale verteilt sind, da es einzelne proliferative Kolonien geben wird, die mit der Zeit auf Zusammenfluss überwacht werden müssen. Im Allgemeinen erzeugt eine 10 cm 2 große Schale innerhalb eines Monats genügend Zellen, um in eine separate^Schale aufgeteilt zu werden.
10. Ernten Sie die adhärenten Zellen mit Trypsin / EDTA-Lösung (1x 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Die Zellsuspension bei 470 × g für 5 min bei 25 °C zentrifugieren und das Zellpellet in Wachstumsmedium resuspendieren.

2. Immunphänotypisierung und Ausbreitung von uMSCS

1. Fahren Sie mit der Immunphänotypisierung fort, sobald die adhärenten Zellen einen Zusammenfluss von 50% -60% erreicht haben und gut verteilt sind. Führen Sie keine MSC-Markeranalyse für vollständig konfluente Kulturen durch, da dies tendenziell zu einer Herunterregulierung der wichtigsten MSC-Marker führt.
2. Nach der Trypsinisierung eine Zellsuspension von 1 × 10⁶ Zellen/ml in FACS-Röhrchen (1 × 10⁵ Zellen/Röhrchen) verteilen und mit geeigneten fluorophorgebundenen Antikörpern (alle 1:50-Verdünnung) in Kombination anfärben: ungefärbt; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (gewöhnlicher Fluorophor); Isotypkontrollen für jedes Fluorophor. Zeichnen Sie eine Gesamtzahl von Ereignissen von mindestens 10.000 auf dem Durchflusszytometer zur weiteren Analyse auf.
   HINWEIS: Da die Zellen für jeden Oberflächenmarker separat analysiert werden, ist kein Gating auf Zellteilmengen erforderlich.
3. Zusätzlich zu den oben genannten Markern ist das Vorhandensein positiver und negativer Oberflächenmarker in uMSC-Linien zu bestätigen, die aus einzelnen Nabelschnurgewebeproben erstellt wurden (Tabelle 1).
4. Analysieren Sie die markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie und bestimmen Sie den Prozentsatz der CD105 + ^{CD90 + -} und CD105 + CD73 ⁺ -Zellen. Analysieren Sie CD105⁺ und CD34⁻CD45⁻ Zellen separat.

3. Differenzierung von uMSCs in Skelettmuskulatur

1. Beschichten Sie Gewebekulturplatten mit 0,01% Kollagen und 20 μg/ml Laminin in PBS. Beschichten Sie diese Platten für mindestens 4 h bei Raumtemperatur.
2. Platte uMSCs mit einer Dichte von 10.000 Zellen/^cm2 in Wachstumsmedium.
3. Wenn die Zellen zu 70% konfluent sind, saugen Sie das Wachstumsmedium ab und spülen Sie die Kulturen 2x mit PBS aus. Fügen Sie den uMSCs myogenes Differenzierungsmedium (M1) hinzu, das aus DMEM + 5% Pferdeserum + 0,1 μM Dexamethason + 50 μM Hydrocortison besteht. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, fügen Sie den Kulturen jeden zweiten Tag M1-Medium hinzu.
4. Um die Kinetik der myogenen Progression zu bestimmen, analysieren Sie uMSCs für Pax7, MyoD, Myogenin und MyHC-Expression nach 2 Tagen, 4-5 Tagen, 6-7 Tagen bzw. 10-14 Tagen.

Der Erfolg der Isolierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe beträgt >95%, im Gegensatz zu den schlechten Erfolgsraten von Nabelschnurblut. Nach erfolgreicher Isolierung von uMSCs zeigt die FACS-Analyse, dass alle Zellen CD34−CD45−CD105+CD90+ sind. In der vergleichenden Analyse zeigen uMSCs, die aus Nabelschnurblut isoliert wurden, jedoch heterogene Populationen, wobei ein Teil der Zellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) aufweist. Darüber hinaus sind doppelt positive CD105 + CD90+ weniger zahlreich (~ 5%) (Ergänzende Abbildung S1). Dies führt zu einer reduzierten myogenen Differenzierung zwischen uMSCs aus Nabelschnurblut, da sowohl CD105- als auch CD90-Expression für die Induktion der Myogenese erforderlich sind. uMSCs zeigen auch den Ausdruck der in Tabelle 1 aufgeführten Markierungen an. Wenn es eine Kontamination der aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs gibt, wird auch CD34 + CD45 + -Zellen vorhanden sein. Dies führt zu falschen Zellzahlen für die Beschichtung zur myogenen Differenzierung. Ein Hinweis darauf, dass >90% der Zellen doppelt positiv für CD105- und CD90-Expression sind, ist, dass sich die uMSCs keiner mesodermalen Linie verschrieben haben und weiterhin multipotent bleiben, da sowohl die CD105- als auch die CD90-Expression bei der Differenzierung herunterreguliert werden. Es ist unerlässlich, mehrere Marker für die Bestätigung von uMSC-Phänotypen zu verwenden, da es keinen einzigen definitiven uMSC-Marker gibt. In dieser Analyse bewerteten wir das Vorhandensein aller in Tabelle 1 aufgeführten Marker für jede der im Labor festgelegten uMSC-Linien. Darüber hinaus haben wir den doppelt positiven Status von CD105 und CD90 (Abbildung 2A) sowie von CD105 und CD73 (Abbildung 2B) bestimmt, um sicherzustellen, dass die uMSCs mehrere Schlüsselmarker ausdrücken. Dies ist notwendig, um eine Kontamination einzelner positiver Zellen zu vermeiden, die in einer Anzahl von weniger als 0,05% vorhanden sind.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der schrittweisen Isolierung und Charakterisierung von uMSCs aus Nabelschnurgewebe. Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: MSC-Markeranalyse in aus Nabelschnurgewebe abgeleiteten uMSCs. (A) uMSCs zeigen die Expression von CD105 und CD90 und exprimieren keine hämatopoetischen Marker, CD34 und CD45. Repräsentative FACS-Diagramme von drei uMSC-Linien (UCT15, UCT18 und UCT26) werden angezeigt (N = 16). Die obere Reihe der Panels zeigt Zellen in allen drei uMSC-Linien im Q2-Quadranten, die positiv auf CD105- und CD90-Expression sind. Die untere Reihe der Panels zeigt Zellen im Q1-Quadranten, die positiv für die CD105-Expression und negativ für die CD34- und CD45-Expression sind. (B) uMSCs zeigen den Ausdruck des MSC-Markers CD73 an (N = 16). Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Liste der positiven und negativen Marker für uMSCs Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe.

Für die Differenzierung von uMSCs in die myogene Linie exprimieren uMSCs typischerweise Pax7, einen Marker für Vorläuferzellen innerhalb der ersten 2 Tage nach der Addition von M1, gefolgt von MyoD innerhalb der ersten 4 Tage nach der M1-Addition (Abbildung 3). Nach 6 Tagen Differenzierung exprimieren die Zellen das Myogenin-Protein, gefolgt von der Expression der Myosin-Schwerkette (MyHC) zwischen 10 Tagen und 14 Tagen nach der Induktion der Differenzierung. Wir charakterisierten detaillierter die Kinetik der myogenen Expression mittels RNA-Sequenzierung, Durchflusszytometrie, Immunzytochemie, RT-PCR und Western-Blot-Analyse, um die stufenweise Expression myogener Marker zu dokumentieren und die Robustheit dieses Protokolls zu bestätigen. Die transkriptomische Sequenzierung des gesamten Genoms zwischen undifferenzierten uMSCs und uMSCs, die in Skelettmuskeln differenziert wurden, zeigte die Hochregulierung von 907 Genen als Reaktion auf die Induktion der myogenen Differenzierung (Abbildung 4).

Abbildung 3: Differenzierung von uMSCs in Skelettmuskulatur. uMSCs wurden in M1 medium für 2 Tage, 4 Tage, 7 Tage und 10 Tage kultiviert und nach 2 Tagen auf (A) Pax7, (B) MyoD nach 4 Tagen, (C) Myogeninexpression aus verschiedenen uMSC-Linien, gekennzeichnet durch T8, T12, T14 und T25 nach 7 Tagen, und (D) MyHC nach 10 Tagen untersucht. Maßstabsstäbe = (B, D) 50 μm. Abkürzungen: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe; GAPDH = Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; MyoD = Myoblastenbestimmungsprotein 1; MyHC = Myosin schwere Kette; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; Mb = Myoblast; MT = Myotube. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Vergleichende transkriptomische Profilierung von uMSCs aus Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe differenziert in Skelettmuskulatur. Heatmap der normalisierten Zählungen von 907 Genen zwischen Kontroll-uMSCs und uMSCs, die 7 Tage lang aus Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe in Skelettmuskeln differenziert wurden. Das Venn-Diagramm (links) zeigt eine größere Anzahl von myogenen Genen, die in aus Nabelschnurgewebe gewonnenen uMSCs hochreguliert sind, verglichen mit aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs. Die folgende Tabelle zeigt die häufigsten myogenen Gene, die sowohl im Nabelschnurgewebe als auch im Nabelschnurblut hochreguliert sind. Diese Figur stammt von Mishra et al.6. Abkürzungen: 1, 2 = biologische Replikate; CB1,2 = myogene Zellen, die aus uMSCs des Nabelschnurblutes gewonnen werden; CT1, 2 = myogene Zellen, die aus uMSCs von Nabelschnurgewebe gewonnen werden; coB1,2 = undifferenzierte uMSCs aus Nabelschnurblut kontrollieren; coT1, 2 = undifferenzierte uMSCs aus Nabelschnurgewebe kontrollieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Für eine vergleichende Analyse verglichen wir uMSCs, die aus Nabelschnurblut und Nabelschnurgewebe isoliert wurden. RNA-Sequenzierungsdaten zeigten, dass in uMSCs mehr myogene Gene aus aus Nabelschnurgewebe gewonnenen myogenen Zellen hochreguliert waren als aus Nabelschnurblut (Abbildung 4). Die RNA-Sequenzierungsdaten, die zur Unterstützung dieser Studie verwendet werden, werden in NCBI hochgeladen (SRA-Beitritt ist GSE147114). Kurz gesagt, die gewebespezifische transkriptomische Analyse unter Verwendung der PANTHER GO-slim-Datenbank identifizierte zytoskelettale Proteine, die mit der Aktinbindung und Sarkomerassemblierung (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) assoziiert sind, Transportern, die mit kontraktiler Funktion assoziiert sind (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), Muskelmasseerhaltung ( FBXO32, TRIM16L, GHR), Calciumsignalisierung (FKBP5) und enzymatische Funktion (COX7A1, PDK4) (Abbildung 4). Insgesamt zeigen diese Daten, dass aus Nabelschnurgewebe gewonnene uMSCs ein Kompartiment darstellen, das ein robustes myogenes Potenzial aufweist.

Aufgrund individueller Unterschiede zwischen uMSC-Linien, die sich aus isolierten Wirkungsgraden, Heterogenität innerhalb des uMSC-Kompartiments, dem Alter der Mutter und dem Gesundheitszustand der Mutter, einschließlich ihres Nährstoffgehalts, ergeben können, kann es Unterschiede in den Proliferationsraten und myogenen Potenzialen zwischen etablierten uMSC-Linien geben. Trotz Unterschieden in der Kinetik der Expression wird jedoch der allgemeine Trend der zunehmenden Myogenität mit der stufenweisen Expression myogener Marker beibehalten.

Ergänzende Abbildung S1: MSC-Markeranalyse in aus Nabelschnurblut gewonnenen uMSCs. uMSCs zeigen die Expression von CD105 und hämatopoetischen Markern, CD34 und CD45. Die Analyse der CD105+ -Population zeigt, dass nur ein kleiner Teil dieser Zellen CD90 koexprimiert (N = 5). Abkürzung: uMSCs = mesenchymale Stammzellen aus menschlichem Nabelschnurgewebe. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.