Ensemble Force Spektroskopie durch Scherkräfte

In der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie¹ (SMFS) wurden die mechanischen Eigenschaften einzelner Molekülstrukturen mit hochentwickelten Instrumenten wie dem Rasterkraftmikroskop, einer optischen Pinzette und einer Magnetpinzette ^2,3,4 untersucht. Eingeschränkt durch die gleiche Richtungsanforderung der Moleküle in den krafterzeugenden/detektierenden Aufbauten oder das kleine Sichtfeld in Magnetpinzetten und dem Miniatur-Zentrifugenkraftmikroskop (MCF)5,6,7,8^, kann nur eine begrenzte Anzahl von Molekülen gleichzeitig mit SMFS untersucht werden. Der geringe Durchsatz von SMFS verhindert seine breite Anwendung im Bereich der molekularen Erkennung, was die Beteiligung einer großen Anzahl von Molekülen erfordert.

Die Scherströmung bietet eine mögliche Lösung, um Kräfte auf eine massive Gruppe von Molekülen auszuüben⁹. In einer Flüssigkeitsströmung innerhalb eines Kanals gilt: Je näher an der Kanaloberfläche, desto langsamer ist die Durchflussrate¹⁰. Ein solcher Strömungsgeschwindigkeitsgradient verursacht eine Schubspannung, die parallel zur Grenzfläche verläuft. Wenn ein Molekül in diese Scherströmung gebracht wird, orientiert sich das Molekül so, dass seine Längsachse mit der Strömungsrichtung übereinstimmt, da die Querkraft auf die lange Achse¹¹ aufgebracht wird. Als Ergebnis dieser Neuorientierung wird erwartet, dass sich alle Moleküle des gleichen Typs (Größe und Länge der Griffe) in die gleiche Richtung ausrichten, während sie die gleiche Scherkraft erfahren.

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, um eine solche Scherströmung zu verwenden, um Scherkraft auf einen massiven Satz molekularer Strukturen auszuüben, wie das DNA-i-Motiv veranschaulicht. Bei diesem Protokoll wird eine Scherströmung zwischen Rotor und Stator in einer Homogenisatorspitze erzeugt. Die vorliegende Studie ergab, dass die gefaltete DNA-i-Motivstruktur durch Scherraten von 9724-97245 s⁻¹ entfaltet werden konnte. Außerdem wurde eine Dissoziationskonstante von 36 μM zwischen dem L2H2-4OTD-Liganden und dem i-Motiv gefunden. Dieser Wert stimmt mit dem Wert von 31 μM überein, gemessen mit dem Gelverschiebungsassay¹². Weiterhin wird die aktuelle Technik verwendet, um das i-Motiv zu entfalten, das das chelatierte Kupfer (I) freilegen kann, um eine Klickreaktion zu katalysieren. Dieses Protokoll ermöglicht es somit, einen großen Satz von i-Motiv-Strukturen mit kostengünstigen Instrumenten in angemessener Zeit (kürzer als 30 min) zu entfalten. Da die Querkrafttechnik den Durchsatz der Kraftspektroskopie drastisch erhöht, nennen wir diese Technik Ensemblekraftspektroskopie (EFS). Dieses Protokoll zielt darauf ab, experimentelle Richtlinien bereitzustellen, um die Anwendung dieses auf Scherkraft basierenden EFS zu erleichtern.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Puffer und chemischen Reagenzien sind in der Tabelle Materialien aufgeführt.

1. Vorbereitung des Scherkraftmikroskops

HINWEIS: Das Scherkraftmikroskop besteht aus zwei Teilen, einer Reaktionseinheit (Homogenisator) und einer Detektionseinheit (Fluoreszenzmikroskop). Die Vergrößerung des Okulars beträgt 10x und die Vergrößerung der Objektivlinse (Luft) ist 4x.

1. Montieren Sie den Homogenisator und das Mikroskop auf einem Montagetisch. Tragen Sie eine Schutzbrille und schalten Sie das Fluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie dann den Homogenisator ein, um sicherzustellen, dass der Anregungslichtstrahl einer geeigneten Wellenlänge (hier wurden 488 nm verwendet) durch die Mitte der Dispergierspitze des Homogenisators geht.
2. Bereiten Sie eine Reaktionskammer mit flachem Boden vor, die 5 cm hoch und 1,5 cm 2 x 1,5 cm² im Querschnitt ist. Um den Hintergrund zu reduzieren, stellen Sie sicher, dass das ausgewählte Kammermaterial nicht fluoresziert, wie z. B. Gläser (einige Kunststoffe haben Fluoreszenz).
3. Wählen Sie eine geeignete Homogenisator-Dispergierspitze, die die gewünschte Scherkraft bereitstellen kann.
   HINWEIS: Die Scherrate ist abhängig vom Abstand zwischen Rotor und Stator bei einer festen Drehzahl¹¹ gemäß der folgenden Gleichung:
   
   wobei μ die dynamische Viskosität von Wasser bei 20 °C ist; D ist der Innendurchmesser des Stators; d ist der Außendurchmesser des Rotors und V die Schergeschwindigkeit (U/min).
4. Klemmen Sie die Reaktionskammer auf den Probentisch des Fluoreszenzmikroskops, und stellen Sie die Kammer dann so ein, dass sie die Dispergierspitze des Homogenisators hält (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass sich die Dispergierspitze etwas über (~ 1 mm) der unteren Oberfläche der Reaktionskammer befindet.
5. Stellen Sie die vertikale Position des Homogenisators und der Kammer zusammen ein, um sicherzustellen, dass der Fokus des Mikroskops auf der Oberfläche der Dispergierspitze liegt. Stellen Sie dann die horizontale Position der Dispergierspitze ein, um sicherzustellen, dass der Erfassungsbereich (Sichtfeld) zwischen Rotor und Stator eingestellt ist (Abbildung 1).
6. Schalten Sie die Fluoreszenzkanäle entsprechend dem im Experiment verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ein.
7. Verwenden Sie vor dem Hochgeschwindigkeitsscherexperiment entionisiertes (DI) Wasser, um die Scherung mit einer niedrigen Schergeschwindigkeit (z. B. 2.000 U/min) zu testen, um sicherzustellen, dass die Dispergierspitze ordnungsgemäß arbeiten kann, ohne die Reaktionskammer zu berühren.

2. Entfaltung von i-Motiven mit und ohne Liganden

1. Bereiten Sie eine menschliche Telomer-i-Motiv-DNA (Table of Materials) vor, die an ihren beiden Enden mit einem Farbstoff bzw. einem Quencher markiert ist, in DI-Wasser, wie in Hu et ^al.11 beschrieben.
   HINWEIS: i-Motiv mit Sequenz: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.
2. Die DNA wird im 30 mM MES-Puffer bei pH 5,5 oder pH 7,4 auf 5 μM verdünnt. Der DNA-Lösung wird der Ligand L2H2-4OTD, der nach Abraham Punnoose et al.13 synthetisiert wurde, in einem Konzentrationsbereich von 0-60 μM hinzugefügt. Mischen Sie die Lösung vorsichtig für ¹⁰ min, um die i-Motivstrukturen ohne Licht zu falten.
3. Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der Reaktionskammer, die mit deionisiertem DI-Wasser gefüllt ist, mit dem Fluoreszenzmikroskop ohne Scherung. Eine einfache Möglichkeit, die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, besteht darin, die Reaktionskammer mit DI-Wasser zu waschen. Der Hintergrundfluoreszenzwert muss später in den Datenanalysen subtrahiert werden.
   HINWEIS: Streulicht sollte ab diesem Schritt vermieden werden.
4. Stellen Sie die Parameter der CCD-Kamera über die Software ein. Die empfohlenen Parameter lauten wie folgt: Belichtungszeit = 0,5 s, CCD-Empfindlichkeit = 1600 und Aufnahmezeit = 20 min.
5. Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere und saubere Reaktionskammer. Decken Sie die Reaktionskammer mit einer schwarzen Box ab. Starten Sie dann den Homogenisator, um die Scherung mit einer ausgewählten Scherrate von 9.724 s⁻ 1 bis 97.245 s⁻¹ (ausgewählt mit der mit dem Homogenisator verbundenen Software) für 20 Minuten durchzuführen, wobei die CCD-Kamera eingeschaltet ist, um die Daten aufzuzeichnen.
6. Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit DI-Wasser.

3. Scherkraftbetätigte Klickreaktion

1. Bereiten Sie i-Motiv-DNA in DI-Wasser vor. Inkubation von 10 μM i-Motiv-DNA in 300 μL 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4), ergänzt mit 150 μM CuCl und 300 μM Ascorbinsäure für 10 min, um die i-Motivstrukturen zu falten (alle Konzentrationen sind Endkonzentrationen in der Lösung).
   HINWEIS: CuCl ist der Katalysator der Klickreaktion. Ascorbinsäure verhindert die Oxidation von Kupfer (I).
2. Ultrafiltrieren Sie die Lösung mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung bei einer Zentrifugalkraft von 14.300 x g. Die Lösung wird nach jeder Filtration mit 30 mM Tris-Puffer (pH 7,4), ergänzt mit 300 μM Ascorbinsäure, auf ~500 μL aufgefüllt.
3. Wiederholen Sie die Filtration 3x.
4. Die Restlösung wird gesammelt und ergibt ein Endvolumen von 300 μL durch Zugabe von 30 mM Tris (pH 7,4), ergänzt mit 300 μM Ascorbinsäure, zusammen mit 20 μM Calfluor 488 Azid, 20 μM HPG und 10 μM TBTA. Sobald die Reagenzien hinzugefügt wurden, bringen Sie die Lösung in die Dunkelkammer.
   HINWEIS: Licht sollte nach diesem Schritt vermieden werden.
5. Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der mit DI-Wasser gefüllten Reaktionskammer vor den Scherexperimenten mit dem Mikroskop. Eine einfache Möglichkeit, die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren, besteht darin, die Reaktionskammer mit DI-Wasser zu waschen.
6. Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere Reaktionskammer und starten Sie dann die Homogenisatorscherung mit einer Scherrate von 63.209 s−1 für 20 Minuten bei eingeschalteter ^CCD-Kamera .
7. Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit DI-Wasser.

Abbildung 1 zeigt die mechanische Entfaltung und Echtzeiterfassung von Ensemblemolekülen in EFS. In Abbildung 1B wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität der i-Motiv-DNA mit einer Scherrate von 9.724 s−1 bis 97.245 s−1 in einem pH-Puffer von 5,5 MES zunahm. Als Kontrolle wurde die Fluoreszenzintensität nicht erhöht, wenn die gleiche i-Motiv-DNA mit einer Rate von 63.209 s−1 in einem pH-Puffer von 7,4 MES geschert wurde. Dies liegt daran, dass sich das i-Motiv bei pH 7,414 nicht faltet. In der vorherigen Arbeit haben wir festgestellt, dass je höher die Scherrate, desto mehr entfaltet sich das i-Motiv11. Basierend auf der Entfaltung des i-Motivs in der optischen Pinzette 11 kalibrierten wir die Scherkraft gegen die Scherrate, wie in Abbildung 1C gezeigt, die zeigte, dass bis zu 41 pN bei einer Scherrate von 77.796 s−1 auf das FRET-Paar mit der Bezeichnung i-Motiv aufgebracht werden konnten. In Abbildung 2B wurde der Ligand (L2H2-4OTD) bewertet, der an die DNA-i-Motivmoleküle bindet, die dem Scherfluss ausgesetzt sind, was zeigte, dass der Anstieg der Fluoreszenzintensität mit zunehmender L2H2-4OTD-Konzentration (0-60 μM) weniger offensichtlich wurde. Aus der Bindungskurve (d.h. einem Diagramm der gebundenen Anteile des Liganden vs. der freien Ligandenkonzentration) in Abbildung 2C wurde eine Dissoziationskonstante (Kd) von 36 μM für die Wechselwirkung zwischen dem L2H2-4OTD-Liganden und dem i-Motiv11 bestimmt. Als praktische Anwendung der Scherkraft für chemische Reaktionen zeigt Abbildung 3 eine Mechano-Klick-Reaktion, die durch die Scherströmung ausgelöst werden kann. In Abbildung 3B wurde das Cu(I)-chelatierte i-Motiv mit der Scherrate von 63.209 s−1 entfaltet, und das freigesetzte Kupfer (I) löste die in Abbildung 3A gezeigte fluorogene Klickreaktion aus, was im Laufe der Zeit zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität führte (Abbildung 3C).

Abbildung 1: Entfaltung der i-Motiv-DNA-Struktur durch Scherfluss im EFS. (A) Schematische Darstellung der Entfaltung einer i-Motiv-DNA-Struktur, die mit einem FRET-Paar (Cy5 und Quencher) markiert ist, durch den in einem Tischhomogenisator erzeugten Scherfluss. Linker Einschub: Das Hellbraun zeigt den Stator an, das Dunkelbraun den Rotor. Rechter Einschub: Der gestrichelte cyanfarbene Kreis zwischen Rotor und Stator zeigt den Pufferstrom unter Scherbedingungen an. Der dunkelbraune Kreispfeil zeigt die Richtung des Rotors an. Die Cyanpfeile in der vergrößerten Ansicht des rechten Einschubs zeigen den Pufferfluss unter Scherung an. Die Länge jedes Pfeils stellt die Geschwindigkeit eines bestimmten Strömungsstroms dar (längere Pfeile zeigen höhere Geschwindigkeiten an). (B) Die prozentuale Änderung der Fluoreszenzintensität in der Echtzeitmessung ist auf die Entfaltung des i-Motivs bei unterschiedlichen Scherraten von 9.724 s−1 bis 97.245 s−1 zurückzuführen. Durchgezogene Kurven zeigen die Exponentialanpassung an. Die Fluoreszenzintensität wird in Bezug auf den im Experiment beobachteten Maximalwert normalisiert. (C) Diagramm der Scherrate im Vergleich zur Querkraft für das in (A) dargestellte i-Motiv. Die rote Linie zeigt eine lineare Anpassung (R2 = 1,00). Diese Abbildung wurde von Hu et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Entfaltung von i-Motiven, die mit Liganden gebunden sind. (A) Schematische Darstellung des i-Motivs mit einem FRET-Paar (Cy5 und Quencher), gebunden mit dem L2H2-4OTD-Liganden13. (B) Die verminderte Fluoreszenzintensität des i-Motivs mit steigenden Konzentrationen des L2H2-4OTD-Liganden (rosa: 0 μM, grün: 6 μM, Cyan: 30 μM, grau: 36 μM, schwarz: 45 μM und hellbraun: 60 μM). Die Fluoreszenzintensität wird in Bezug auf den im Experiment beobachteten Maximalwert normalisiert. (C) Bindungskurve des i-Motivs bei verschiedenen freien L2H2-4OTD-Konzentrationen. Diese Abbildung wurde von Hu et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Mechano-Klick-Reaktionen . (A) Fluorogene Klickreaktion zwischen Calfluor 488 und HPG. Die grün dargestellte Verbindung ist das fluoreszierende Reaktionsprodukt. (B) Die mit Kupfer (I) bei pH 7,4 chelatierte i-Motiv-DNA-Struktur wurde filtriert, um ungebundenes Kupfer (I) in der Lösung zu entfernen. Das Kupfer (I) chelatierte i-Motiv wurde durch Scherströmung in EFS entfaltet. Das freigesetzte Kupfer (I) katalysierte die fluorogene Klickreaktion, die in den Kapillarröhrchen (unten rechts) gezeigt wurde. (C) Prozentuale Erhöhung der Fluoreszenzintensität der Klickreaktion bei einer Scherrate von 63.209 s−1 für 20 min. Die dunkle Kurve zeigt die Anpassung der Fluoreszenzintensität aus einer Kontrollklickreaktion ohne DNA. Die grüne Kurve stellt die exponentielle Anpassung dar. Die Fluoreszenzintensität wird in Bezug auf den im Experiment beobachteten Maximalwert normalisiert. Diese Abbildung wurde von Hu et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.