Methodenartikel

Einzelzell-Proteomik-Vorbereitung für die massenspektrometrische Analyse mittels Gefrierwärmelyse und isobarem Träger

DOI:

10.3791/63802

⸱

9. Dezember 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Barnett Institute, Northeastern University, 3Department of Biology, Northeastern University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll beschreiben wir, wie Säugetierzellen für die Einzelzell-Proteomik-Analyse mittels Massenspektrometrie unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien und Geräte mit Optionen für manuelles und automatisches Pipettieren vorbereitet werden können.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Einzelzell-Proteomik-Analyse erfordert empfindliche, quantitativ genaue, allgemein zugängliche und robuste Methoden. Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, wurde das Single-Cell ProtEomics (SCoPE2)-Protokoll als Methode der zweiten Generation zur Quantifizierung von Hunderten bis Tausenden von Proteinen aus begrenzten Proben bis auf die Ebene einer einzelnen Zelle entwickelt. Experimente mit dieser Methode haben die Quantifizierung von über 3.000 Proteinen in 1.500 einzelnen Säugetierzellen (500-1.000 Proteine pro Zelle) in 10 Tagen Massenspektrometer-Instrumentenzeit erreicht. SCoPE2 nutzt einen Gefrier-Wärme-Zyklus für die Zelllyse, wodurch die Reinigung einzelner Zellen entfällt und somit Probenverluste reduziert werden, während die Probenvorbereitung beschleunigt und die Automatisierung vereinfacht wird. Darüber hinaus verwendet die Methode einen isobaren Träger, der die Proteinidentifizierung unterstützt und Probenverluste reduziert.

Dieses Videoprotokoll bietet detaillierte Anleitungen, um die Einführung einer automatisierten Einzelzellproteinanalyse zu ermöglichen, bei der nur Geräte und Reagenzien verwendet werden, die allgemein zugänglich sind. Wir demonstrieren kritische Schritte bei der Vorbereitung einzelner Zellen für die Proteomanalyse, von der Ernte über die Injektion bis hin zur Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analyse. Darüber hinaus werden die Betrachter durch die Prinzipien des experimentellen Designs mit dem isobaren Träger, die Qualitätskontrolle sowohl für isobare Träger- als auch für Einzelzellpräparate und repräsentative Ergebnisse mit einer Diskussion der Grenzen des Ansatzes geführt.

Einleitung

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Die Einzelzellanalyse wird häufig verwendet, um den Grad der Heterogenität innerhalb biologischer Systeme zu untersuchen, der sonst durch Massenmessungen nicht erkennbar wäre 1,2,3. Eine solche zelluläre Vielfalt kann funktionelle Konsequenzen haben, die das Verständnis integraler biologischer Prozesse fördern können, von der therapeutischen Resistenz von Krebszellen 4,5,6 bis zur Zell-zu-Zell-Heterogenität bei Diabetes 7,8,9,10. Viele Untersuchungen konzentrierten sich auf die Messung von Nukleinsäuren in einzelnen Zellen durch Messung genetischer oder transkriptomischer Ebenen und ermöglichten die Klassifizierung von Zelltypen und -zuständen. Ein solcher Fortschritt im Nukleinsäurebereich kann jedoch die Wissenslücke der posttranskriptionellen Regulation11 nicht schließen, was die Notwendigkeit ähnlicher Hochdurchsatz-Proteinmessungen in Einzelzellen12,13,14,15 erhöht.

Wir haben SCoPE216,17 entwickelt, um der Nachfrage nach rigoroser und robuster Einzelzell-Proteomik von Säugetiersystemen gerecht zu werden. Es handelt sich um eine Multiplexmethode, die einen erhöhten Durchsatz ermöglicht, indem viele Zellen parallel markiert und analysiertwerden 18, im Gegensatz zu markierungsfreien Mthoden, die eine Zelle zum Zeitpunkt19,20 analysieren. Die Probenvorbereitungsmethodik, der massenspektrometrische Ansatz und die nachfolgenden Datenanalyseschritte ermöglichen eine genaue Quantifizierung von Hunderten bis Tausenden von Proteinen pro Zelle. Diese Methode ermöglicht die massenspektrometrische Analyse einzelner Zellen durch den isobaren Träger21, eine kleine Massenprobe von Zellen (normalerweise 25-200), die der interessierenden Einzelzellpopulation biologisch ähnlich ist. Dieses Trägermaterial wird in einem Set mit einem Referenzkanal aus dem gleichen Material und einzelnen Zellen durch die Verwendung von Tandem-Massentags (TMT-Labels) gemultiplext. Der Trägerkanal reduziert den Probenverlust an Oberflächen und liefert die Ionenrückgratfragmente für eine erfolgreiche Peptididentifizierung. Der Referenzkanal, der in großen Mengen hergestellt und anschließend auf 5-10 Zelläquivalente für jeden Einzelzellsatz verdünnt wird, hilft bei der Kontrolle der technischen Variabilität in der Analyse. Insbesondere ermöglicht die Referenz die Normalisierung der Variabilität, die durch LC-MS/MS-bezogene Effekte wie Ionenprobenahme und Ionisationseffizienz verursacht wird. In der Regel werden die Referenz- und die Trägerkanäle aus derselben Zellpopulation hergestellt.

Dieses Probenvorbereitungsprotokoll ist eine Methode der zweiten Generation, die auf SCoPE-MS22 durch mehrere synergistische Verbesserungen aufbaut. Zu den Verbesserungen gehört eine Zelllysemethode, die die Probenreinigung vermeidet, was ein üblicher Schritt von MS-Proteomik-Präparaten ist. Es verwendet mPOP (minimal ProteOmic sample Preparation)23, eine Gefrier-Wärme-Lysemethode. Diese Methode ermöglichte die Lyse einzelner Zellen in kleineren Volumina und in Multiwell-Platten anstelle von Vials, was eine höhere Durchsatzrate und Automatisierung durch Thermocycler ermöglichte. Insgesamt hat diese Methode die Kosten pro einzelne Zelle gesenkt und die quantitative Genauigkeit im Vergleich zu SCoPE-MS16,24 erhöht.

Dieses Protokoll beschreibt, wie einzelne Zellen für die Proteomanalyse vorbereitet werden, einschließlich der Vorbereitung der Träger- und Referenzkanäle unter Verwendung von TMTpro 18-plex isobaren Markierungen. Säugetierzellen, die sich in einzelliger Suspension befinden und in 384-Well-Platten isoliert werden können, sind wahrscheinlich für dieses Protokoll geeignet. Ebenfalls enthalten sind repräsentative Ergebnisse erfolgreicher Einzelzellensätze, die mehrere Qualitätskontrolldiagramme anzeigen, die von einer R Shiny-App, DO-MS25, generiert wurden. Andere veröffentlichte Software-Tools 26,27 und experimentelle Richtlinien 17,21 haben die Annahme dieses Protokolls verbessert. Wir hoffen, dass dieser visuelle Leitfaden Forschern bei der Durchführung von Einzelzell-Proteomik-Experimenten helfen wird.

Protokoll

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HINWEIS: In diesem Protokoll beträgt die Raumtemperatur (RT) 18-22 °C.

1. Träger- und Referenzmaterialerzeugung

  1. Zellisolierung
    1. Sammeln Sie interessante Zellen in Zellsuspensionen in eiskaltem 1x PBS.
      ANMERKUNG: Wenn möglich, sollten der Träger und das Referenzmaterial aus den Zellpopulationen hergestellt werden, die ausgewählt wurden, um auf Einzelzellebene untersucht zu werden. Eine ähnliche Anzahl von Zellen aus den verschiedenen experimentellen Bedingungen (wie stimulierte und nicht stimulierte Immunzellen) sollte den Träger und die Referenz bilden. In Situationen, in denen eine ausreichend große Anzahl dieser Zellen nicht geerntet werden kann, sollte eine geeignete Zellpopulation basierend auf biologischer Ähnlichkeit ausgewählt werden.
    2. Zählen Sie mit einem Hämozytometer oder anderen Mitteln zur Zellzählung (z. B. FACS) die Anzahl der Zellen in der Suspension.
    3. Spin down und resuspendieren Sie 22.000 Zellen jedes Zelltyps in 11 μL HPLC-Wasser, separat in PCR-Röhrchen (Standard-250-μL-PCR-Röhrchen).
      HINWEIS: Die hier angegebene Anzahl von Zellen ist ausreichend für die Träger und Referenzen für die Anzahl der Sets, die aus einer 384-Well-Platte voller Einzelzellen hergestellt werden können. Die Zelleingabe in diesem Schritt und die Reagenzmengen in den nachfolgenden Schritten können proportional für eine größere Anzahl von Sätzen skaliert werden. Die Geschwindigkeit des Abdrehens hängt von den Zellkulturpraktiken des Labors ab. Ein typischer Spin-Down: 300 × g für 5 min.
    4. Die Proben werden für mindestens 30 min in einen -80 °C Gefrierschrank überführt.
      PAUSENPUNKT: Proben können mehrere Monate lang eingefroren bleiben, ohne dass dies Auswirkungen auf Einzelzelldaten hat.
  2. Zelllyse
    1. Erhitzen Sie das PCR-Röhrchen mit den Zellen 10 min lang auf 90 °C (mit Thermocyclerdeckel auf 105 °C) und lassen Sie die Röhrchen direkt nach dem Heizzyklus auf 12 °C abkühlen.
    2. Wirbeln Sie das Röhrchen kurz vor und drehen Sie sich dann in einem PCR-Tischröhrchenspinner bei RT herunter, um die gesamte Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu sammeln.
    3. In einem Wasserbadsonikator die Röhren 5 Minuten lang beschallen und dann bei RT auf Eis legen.
  3. Trypsin-Verdauung
    1. Geben Sie 2,2 μL der Mastermischung (siehe Tabelle 1 für die Komponenten) zu jedem Probenröhrchen auf Eis.
      VORSICHT: Trypsin kann Haut-, Atemwegs- und Augenreizungen verursachen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Griff unter einem chemischen Abzug.
    2. Wirbeln Sie die Röhrchen kurz, um sie zu mischen und in einem PCR-Tischröhrenspinner bei RT zu verdrehen, um die gesamte Flüssigkeit am Boden jedes Röhrchens zu sammeln.
    3. Die Proben werden 3 h lang bei 37 °C erhitzt (mit dem Thermocyclerdeckel auf 52 °C).
  4. TMT-Markierungsreaktion
    1. Schleudern Sie die Proben nach dem Aufschluss in einem Tisch-PCR-Röhrchenspinner bei RT herunter.
    2. Teilen Sie jede Probe in zwei gleiche Volumina von jeweils 6,6 μL auf, so dass jedes Röhrchen 11.000 Zellen enthält.
    3. Zu den Röhrchen, die für den Träger bestimmt sind, fügen Sie 3,3 μL TMT-Label 126 hinzu, das in einer Konzentration von 85 mM resuspendiert wurde.
    4. Zu den Röhrchen, die als Referenz bestimmt sind, fügen Sie 3,3 μL TMT-Label 127N hinzu, das in einer Konzentration von 85 mM resuspendiert wurde.
    5. Wirbeln Sie die Röhrchen kurz ab und drehen Sie sich in einem PCR-Tischröhrenspinner bei RT herunter, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln.
    6. Lassen Sie die Röhrchen 1 h bei RT.
  5. Abschrecken der TMT-Markierungsreaktion
    1. Fügen Sie 1,65 μL 0,5% Hydroxylamin in jedes Röhrchen hinzu.
      ACHTUNG: Hydroxylamin kann Hautreizungen verursachen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen.
    2. Wirbeln Sie die Röhrchen kurz ab und drehen Sie sich in einem PCR-Tischröhrenspinner bei RT herunter, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln.
    3. Lassen Sie die Röhrchen 30 Minuten bei RT.
  6. Kombination aus Träger und Referenz
    1. Wenn Proben, die den Träger bilden werden, separat gekennzeichnet wurden, mischen Sie sie in gleichen Verhältnissen.
    2. Wenn Proben, die die Referenz bilden sollen, separat gekennzeichnet wurden, mischen Sie sie in gleichen Verhältnissen.
    3. Mischen Sie den Träger und die Referenz so, dass die Endkonzentration des Trägers 100-200 Zellen / μL und die Referenzkonzentration 5-10 Zellen / μL beträgt.
    4. Bewerten Sie die Qualität des Trägers und der Referenzmaterialien, bevor Sie sie mit Einzelzellensätzen kombinieren.
      HINWEIS: Die Qualitätskontrolle des Trägers und des Referenzmaterials kann durch eine Vielzahl von Methoden durchgeführt werden, es wird jedoch empfohlen, die DO-MS-Software zu verwenden, die unter do-ms.slavovlab.net17 verfügbar ist. Kritische Qualitätsmessungen umfassen die Misclevage-Rate (<25%, eine Metrik, die als Anzahl der sicher identifizierten Peptide mit einer verpassten Spaltung dividiert durch die Anzahl der sicher identifizierten Peptide insgesamt berechnet wird) und die Markierungseffizienz (>99%, eine Metrik, die als Anzahl der Markierungsstellen berechnet wird, nämlich der Peptid-N-Terminus und Lysin, mit einer Markierung geteilt durch die Gesamtzahl der Markierungsstellen).
      PAUSE POINT: Der Träger und die Referenzmaterialien können bei -80 °C gelagert werden, bis sie benötigt werden.
BestandteilMischungskonzentrationEndkonzentration je Röhrchen
Trypsin Gold50 ng/μL8,33 ng/μL
TEAB, pH = 8,5500 mM83,33 mM
Benzonase-Nuklease1,2 Einheiten0,2 Einheiten

Tabelle 1: Reagenzienmenge der Mastermischung. Die endgültigen Konzentrationen von Reagenzien, die für die Trypsinverdauung benötigt werden, sind aufgeführt.

2. SCoPE2 Probenvorbereitung

  1. Zellisolierung
    1. Ergänzen Sie Wasser in HPLC-Qualität mit 25 fmol pro Peptid pro μl einer synthetischen Peptidlösung.
      HINWEIS: Waters MassPrep Peptidlösung ist ein Beispiel dafür, was verwendet werden kann. Es besteht aus sieben Peptiden, die nicht sehr gut ionisieren. Dies ist ein Schlüsselaspekt dieser Lösung: Diese Peptide stören nicht die genaue massenspektrometrische Quantifizierung einzelner Zellen. Jede hochgereinigte Mischung einiger weniger Peptide, die wahrscheinlich nicht in den interessierenden Proben enthalten sind, ist angemessen.
    2. Fügen Sie 1 μL dieser Mischung zu jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte mit einem Flüssigkeitsdosierroboter oder einer manuellen Pipette hinzu.
    3. Versiegeln Sie die Platte und drehen Sie sie in einem Tischplattenspinner bei RT, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln.
      PAUSENPUNKT: Platten mit dieser Lösung können bei -80 °C gelagert werden, bis sie benötigt werden.
    4. Erhalten Sie eine Suspension von nicht fixierten Zellen, die disaggregiert sind.
      HINWEIS: Wie genau die Zellsuspension erhalten wird, hängt vom interessierenden Zelltyp ab. Hier sind einige Beispiele:
      1. Suspensionszellen: Schleudern Sie die Zellen zu einem Pellet und entfernen Sie das Zellkulturmedium.
      2. Adhärente Zellen: Entfernen Sie die Zellen aus der Schale oder dem Kolben durch Trypsinisierung oder Schaben. Dann drehen Sie sie nach unten, um das Zellkulturmedium zu entfernen.
    5. Waschen Sie die Zellsuspension zweimal mit 1x eiskaltem PBS. Lassen Sie die Zellen nach dem zweiten Waschgang in 1x PBS suspendieren.
    6. Wenn die 384-Well-Platte eingefroren wurde, tauen Sie sie bei RT auf. Drehen Sie sie herunter, um sicherzustellen, dass sich die gesamte Flüssigkeit am Boden der Vertiefungen befindet.
    7. Verwenden Sie einen Zellsortierer oder andere verfügbare Mittel, z. B. manuelle Handkommissionierung, um einzelne Zellen in die jeweiligen Vertiefungen zu verteilen.
      HINWEIS: Fügen Sie einzelne Zellen zu Vertiefungen hinzu, während einige Vertiefungen für Negativ- und Positivkontrollen leer bleiben (siehe Diskussion). Verwenden Sie bei der Durchflusszytometrie die niedrigstmögliche Durchflussrate für das Durchflusszytometer. Es wird angenommen, dass eine niedrigere Durchflussrate für die Zellhandhabung schonender ist. Darüber hinaus sollte die Düsengröße für die Verwendung mit den interessierenden Zellen geeignet sein. Es wird empfohlen, mit einer Durchflusszytometrie-Einrichtung zusammenzuarbeiten.
    8. Fügen Sie Positivkontrollen von 2-5 Zelläquivalenten Lysat zu ausgewählten Vertiefungen hinzu, die manuell oder mit Liquid-Handling-Robotern pipettiert werden.
    9. Versiegeln und drehen Sie die Platte mit sortierten Zellen in einem Tischplattenspinner bei RT, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln. Die Platte so schnell wie möglich bei -80 °C einfrieren.
      PAUSE POINT: Platten mit sortierten Einzelzellen können bei -80 °C bis zum Bedarf gelagert werden.
  2. Zelllyse
    1. Nehmen Sie die 384-Well-Platte mit den sortierten Einzelzellen und legen Sie sie so schnell wie möglich in den Thermocycler.
    2. Die Platte 10 min lang auf 90 °C erhitzen (bei Deckeltemperatur auf 105 °C) und dann auf 12 °C abkühlen lassen.
    3. Drehen Sie die Platte kurz in einem Tischplattenspinner bei RT herunter.
    4. In einem Wasserbadsonikator die Platte 5 Minuten lang bei RT beschallen und dann auf Eis legen.
  3. Trypsin-Verdauung
    1. Bereiten Sie 100 μL der Mastermischung (siehe Tabelle 1 für Komponenten) pro 384-Well-Platte vor.
    2. Zu jeder Vertiefung der 384-Well-Platte werden 0,2 μl der in Schritt 2.3.1 mit einem Liquid Handler hergestellten Mastermischung hinzugefügt.
      HINWEIS: Verwenden Sie größere Volumina, wenn manuelles Pipettieren verwendet wird, und stellen Sie sicher, dass die Endkonzentrationen der Reagenzien pro Vertiefung immer noch gleich sind.
    3. Versiegeln Sie die Platte, wirbeln Sie für 5 s und drehen Sie sich in einem Tischplattenspinner bei RT herunter.
    4. Erhitzen Sie die 384-Well-Platte 3 h lang bei 37 °C (mit Deckeltemperatur auf 52 °C).
  4. TMT-Markierungsreaktion
    1. Nehmen Sie die 85 mM Bestände an TMT-Etiketten (128N bis 135N) aus dem -80 °C Gefrierschrank. Erwärmen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur, bevor Sie sie öffnen.
    2. Die Etiketten werden auf 22 mM in wasserfreiem Acetonitril verdünnt.
      ACHTUNG: Acetonitril ist eine brennbare Flüssigkeit. Es kann Haut, Augen, Atemwege und zentrales Nervensystem reizen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Griff unter einem chemischen Abzug.
    3. Fügen Sie mit dieser Markierungsstrategie 0,5 μl verdünnte TMT-Etiketten in jede Vertiefung der 384-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie entweder einen Flüssigkeitsdosierroboter (wenn Sie einen Flüssigkeitshandler verwenden, achten Sie darauf, die zugehörige Ausrüstung zu verwenden, die für organische Lösungsmittel geeignet ist) oder eine manuelle Pipette.
      HINWEIS: Die Kennzeichnungsstrategie finden Sie in Tabelle 2 . Ein Beispiel für ein Plattenlayout finden Sie in Tabelle 3 .
    4. Versiegeln Sie die Platte, wirbeln Sie für 5 s und drehen Sie sich in einem Tischplattenspinner bei RT herunter.
    5. Die Markierungsreaktion wird bei RT für 1 h fortgesetzt.
  5. Abschrecken der TMT-Markierungsreaktion
    1. Zu jeder Vertiefung der 384-Well-Platte werden 0,2 μL 0,5% Hydroxylamin (verdünnt in HPLC-Wasser) mit einem Liquid Handler hinzugefügt.
      HINWEIS: Verwenden Sie größere Volumina, wenn manuelles Pipettieren verwendet wird, und stellen Sie sicher, dass die Endkonzentrationen der Reagenzien pro Vertiefung immer noch gleich sind.
    2. Versiegeln Sie die Platte, wirbeln Sie für 5 s und drehen Sie sich in einem Tischplattenspinner bei RT herunter.
    3. Halten Sie die Platte 30 Minuten bei RT.
  6. Vorbereitung für die LC-MS/MS-Analyse: Kombination von Einzelzellen und Kontrollmulden mit Träger-/Referenzmaterial
    1. Entfernen Sie den kombinierten Träger/Referenzmaterial aus dem Gefrierschrank bei -80 °C.
    2. Pipettieren Sie für jeden Satz 1 μL Träger- und Referenzmaterial in die erste Vertiefung, die Teil eines einzigen Satzes sein wird. Pipetten Sie das gesamte Volumen der ersten Vertiefung in die nachfolgende Vertiefung. Pipettieren Sie das gesamte Volumen von einer Zelle zur nächsten, bis alle Vertiefungen, die in einem einzigen Satz enthalten sein sollen, in der endgültigen Vertiefung kombiniert wurden.
      HINWEIS: Der Träger und das Referenzmaterial sollten eine Konzentration von 200- bzw. 5-Zell-Äquivalenten aufweisen, aber wie bereitserwähnt 21, können diese Mengen variieren. Jeder Satz sollte, wie in der Kennzeichnungsstrategie beschrieben (siehe Tabelle 2), Träger-, Referenz- und bis zu 12 oder 14 Einzelzellen- oder Kontrollproben enthalten, wenn TMTpro-16plex bzw. TMTpro-18plex verwendet wird (siehe Schritt 2.4.3).
    3. Fügen Sie für jeden Satz 5 μL 50% Acetonitril (verdünnt in HPLC-Wasser) in die erste Einzelzellmulde hinzu, die in jedem Satz enthalten sein soll. Pipeten Sie das gesamte Volumen von der ersten Vertiefung bis zur folgenden Vertiefung. Pipettieren Sie das gesamte Volumen von einer Zelle zur nächsten, bis alle Vertiefungen, die in einem einzigen Satz enthalten sein sollen, in der endgültigen Vertiefung kombiniert wurden.
      HINWEIS: Dieser Waschschritt kann bei der Probengewinnung aus den Bohrlöchern helfen.
    4. Übertragen Sie jedes Set in seine individuellen Autosampler-Glaseinsätze.
      HINWEIS: Diese Sets können auch zu einzelnen Vertiefungen einer 384-Well-Platte kombiniert und direkt in den Autosampler für die Injektion28 platziert werden.
    5. Sobald alle Sets kombiniert und in Glaseinsätze gelegt sind, trocknen Sie die Proben.
      PAUSE POINT: Getrocknete Sets können mindestens 1 Woche bei -80 °C gelagert werden, bevor sie auf einem Massenspektrometer laufen.
    6. Vor der LC-MS/MS-Analyse werden 1,2 μl 0,1% Ameisensäure (verdünnt in HPLC-Wasser) zu jedem Set gegeben, um die markierten Peptide zu resuspendieren.
      ACHTUNG: Ameisensäure ist eine brennbare Flüssigkeit. Es kann schwere Augenschäden oder Hautverbrennungen verursachen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Handgriff in einem gut belüfteten Bereich.
    7. Legen Sie die Autosampler-Einsätze in Glas-Autosampler-Fläschchen und verschließen Sie jede Probe mit einer Kappe.
    8. Ziehen Sie jede Durchstechflasche 5 s lang durch, um sicherzustellen, dass die Resuspension abgeschlossen ist, und drehen Sie sich dann in einer Durchstechflasche bei RT herunter.
    9. Stellen Sie sicher, dass sich jede Probe am Boden des Einsatzes befindet und nicht an den Seiten verspritzt wird.
    10. Legen Sie die Durchstechflaschen in das Autosampler-Fach.
    11. Für jeden Satz 1 μL für die LC-MS/MS-Analyse injizieren.
Etikett126127N127C128N128C129N129C130N130C....135N
Art der StichprobeTrägerReferenzLeerLeerSC/SteuerungSC/SteuerungSC/SteuerungSC/SteuerungSC/Steuerung....SC/Steuerung

Tabelle 2: Beispiel SCoPE2 TMTpro-18plex Beschriftungsschema. Der Träger und die Referenz sind normalerweise in den ersten beiden TMT-Etiketten beschriftet. Dann werden die nächsten beiden Markierungen aufgrund einer möglichen Isotopenkontamination übersprungen, was die Quantifizierung weniger genau machen würde. Die anderen verbleibenden Bezeichnungen gelten für einzelne Zellen oder Steuerelemente.

128C129N129C130N130C131N131C132N132C133N133C134N128C129N129C130N130C131N131C132N132C133N133C134N
123456789101112131415161718192021222324
EinSCSC-SCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSC-SC+SCSCSC
BSC+SCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSC+
CSC-SC-SCSCSC+SC-SCSCSCSC+SC-SCSCSCSCSCSC-
DSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC+SC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
ESCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSC-SCSC
FSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC+SCSCSC+SCSCSC+SCSC
GSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSC
HSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSCSCSCSC
IchSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
J-SC+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSC
KSCSCSCSC-SCSCSCSC-SCSC+SC--SCSCSCSCSCSCSCSC
LSCSCSCSCSC-SCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SC
MSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSCSC
N+SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
OSCSCSCSC+SCSCSCSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC
PSCSC-SCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSCSC+SCSCSC-SC

Tabelle 3: Beispiel für ein Plattenlayout für die Beschriftung mit TMTpro-16plex. Bei Verwendung eines 384-Well-Plattenformats (oder eines anderen Plattenformats) ist es wichtig, die Vertiefungen zu randomisieren, in die Zellen sortiert werden. Für TMTpro-18plex wird ein anderes Plattenlayout verwendet.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Positive Ergebnisse des Protokolls beinhalten die Überprüfung, dass eine Reihe kritischer Schritte im Protokoll erfolgreich durchgeführt wurden. Dazu gehören die Vorbereitung des Trägers, die Einzelzellisolierung, die Lyse, der Aufschluss, die Barcode-Kennzeichnung und die Optimierung der MS-Parameter. DO-MS-Diagramme ermöglichen die einfache Beurteilung des Abschlusses jedes kritischen Schritts im Protokoll. Ein erfolgreich präparierter Träger, der in der Regel 25 und 200 Zellen in der Menge (pro Set) entspricht, ist gut verdaut und gut markiert. Plots von DO-MS ermöglichen die Quantifizierung der Intensität der Probe (zur Schätzung der Menge), der Aufschlusseffizienz (idealerweise <25% Miscleavages) und der Markierungseffizienz (muss >99%) betragen. Am kritischsten ist, dass Trägerproben, die nicht vollständig markiert sind, die Kreuzreaktion mit den für einzelne Zellen bestimmten Barcodes ermöglichen und ein falsches Signal zur Quantifizierung von Einzelzellpeptiden hinzufügen können.

Negative Kontrollbrunnen umfassen alle experimentellen Reagenzien, aber keine Zelle. Auf diese Weise kann nicht nur das Hintergrundrauschen bewertet, sondern auch die Effizienz der Zellisolierung bestimmt werden, indem ein repräsentatives Signal eines leeren Bohrlochs bereitgestellt wird. Der DO-MS-Bericht bietet Diagramme, um das gemessene Signal der Kontrollbohrung neben den Einzelzelltöpfen zu bewerten, um den Erfolg der Zellisolierung und des Hintergrundrauschens zu bestimmen. Zusätzlich kann die Qualität der Quantifizierung unter Verwendung der SCoPE2-Pipeline (verfügbar auf GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) oder des SCP Bioconductor-Pakets29 bewertet werden.

Die Verdauungs- und Markierungseffizienz der einzelnen Zellen kann nicht direkt wie beim Träger untersucht werden, aber DO-MS liefert wiederum Diagramme, die die Abschätzung der Verdauungs- und Markierungseffizienz ermöglichen. Durch die Einbeziehung einer Kontrolle von 100-200 Zellen zusammen mit der Herstellung der einzelnen Zellen (d.h. durch die Aufnahme der gleichen Reagenzzusätze) kann die Verdauungs- und Markierungseffizienz für diese Kontrolle bewertet und angenommen werden, dass sie von den parallel hergestellten Einzelzellen gemeinsam genutzt wird. Eine schlechte Verdauung wird durch ein hohes Verhältnis der Intensität der gespaltenen Peptide zu ihren vollständig gespaltenen Gegenstücken angezeigt (Abbildung 1).

Ein weiterer Faktor, der in den Sets zu berücksichtigen ist, ist der Anteil der fehlenden Daten und die mediane Reporterionenintensität in jedem TMT-Kanal (Abbildung 2). Wenn einzelne Zellen erfolgreich präpariert werden, ist die Menge der fehlenden Daten pro Zelle und Positivkontrolle viel geringer als in Negativkontrollproben. Ebenso ist die mediane Intensität von Vorläufern in Einzelzellen und Positivkontrollen viel höher als bei Negativkontrollen. Die Optimierung von MS-Parametern wurde an anderer Stelleausführlich diskutiert 21, und optimale Parameter können mit Werkzeugen wie DO-MS oder SCP Companion25,27 bestimmt werden.

figure-results-1
Abbildung 1: Qualitätskontrolle der Trägervorbereitung. DO-MS-Diagramme, die (A) die Markierungseffizienz eines erfolgreich hergestellten Trägers an Markierungsstellen mit TMT darstellen: das primäre Amin auf der Seitenkette von Lysin und dem Peptid-N-Terminus und (B) die Verdauungseffizienz bei Aminosäureresten der tryptischen Spaltung. Abkürzung: TMT = Tandem-Massenmarke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Qualitätskontrolle der Einzelzellpräparation. DO-MS-Diagramme, die (A) den Anteil fehlender Daten in einzelnen Zellen (C5-10), Kontrollen (C13,16), Träger (C1) und Referenz (C2) und (B) die Intensität einzelner Zellen und Kontrollen darstellen. Die Tags 127C, 128N, 131C, 132N, 133N und 133C, die C3, C4, C11, C12 und C15 entsprechen, werden in diesem speziellen Satz nicht verwendet. Die Positivkontrolle besteht aus Zellmaterial, das in großen Mengen zu Peptiden verarbeitet und dann vor der Markierung auf ein Niveau von 2-5 Zellen / μL verdünnt wird. Die Negativkontrolle besteht darin, dass alle Vorbereitungsschritte für einzelne Zellen durchgeführt werden, nur ohne Zugabe einer einzelnen Zelle. Abkürzung: TMT = Tandem-Massenmarke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Einer der Schlüssel zur erfolgreichen Vorbereitung und Analyse einzelner Zellen durch SCoPE2 ist die Vorbereitung der Träger- und Referenzkanäle. Die vorgeschlagene Trägergröße beträgt 100 bis 200 Zellen; Die Anzahl der Zellen, die für ein bestimmtes Einzelzellexperiment benötigt werden, kann jedoch auf der Grundlage von Prinzipien bestimmt werden, wie an anderer Stelle21 erörtert. Für die vorgeschlagene Größe werden mindestens ~ 11.275 Zellen pro 384-Well-Platte benötigt, was einen 200-Zell-Träger und eine 5-Zell-Referenz in jedem Satz ermöglicht. Es kann vorteilhaft sein, mehr Zellen zu isolieren, wenn die gewünschten Zellpopulationen kein limitierender Faktor sind, einfach zusätzliches Material im Falle von Fehlern zu haben (wie in diesem Protokoll 22.000 Zellen statt 11.275 Zellen isoliert). Die Menge an Träger und Referenz, die für die Anzahl der gewünschten Platten benötigt wird, sollte in einer einzigen Charge vorbereitet werden, um jede Chargenvariation zu minimieren, die dazu führen kann, dass sich die Peptididentifizierung oder -quantifizierung zwischen den Chargen unterscheidet.

Bevor einzelne Zellen in Vertiefungen einer 384-Well-Platte isoliert werden, ist es wichtig, das Design des Plattenlayouts zu berücksichtigen. Innerhalb jeder 384-Well-Platte wird empfohlen, sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen durchzuführen. Negativkontrollen sind Vertiefungen, in denen keine Zellen hinzugefügt werden, sondern die gleichen Reagenzzusätze und -verfahren durchlaufen wie die Einzelzellmulden. Positivkontrollen sind Vertiefungen, in denen Zelllysat anstelle von Einzelzellen auf 2-5 Zellen/μL verdünnt zugegeben wird. Dies ist besonders wichtig, wenn Einzelzellisolierungsmethoden nicht gut validiert sind. Jede 384-Well-Platte sollte idealerweise eine randomisierte Verteilung einzelner Zellen und Kontrollen aufweisen (z. B. keine negativen oder positiven Kontrollen in nur einer Reihe). Jede Platte sollte eine gleichmäßige Verteilung aller interessierenden Zellpopulationen aufweisen, anstatt einen Zelltyp in einer Platte und einen zweiten Zelltyp in einer zweiten Platte zu isolieren. Dadurch wird vermieden, dass Batch-Effekte mit interessierenden Zelltypen verknüpft werden. Wenn mehr als eine 384-Well-Platte für die Analyse benötigt wird, ist es ratsam, Zellen in einer einzigen Sitzung zu isolieren, anstatt den Isolationsschritt nach Möglichkeit über mehrere Tage zu verteilen.

Die Lyse sowohl einzelner Zellen als auch des Trägers/der Referenz erfolgt in Wasser durch einen Gefrier-Wärme-Zyklus23. Es wird erwartet, dass die meisten Proteasen während dieses Schrittes denaturiert wurden. Trypsin wird dann unmittelbar nach dem Denaturierungsschritt in einer hohen Konzentration zugegeben, die um viele Größenordnungen höher ist als selbst die häufigsten zellulären Proteasen. Durch Massenwirkung werden die meisten Produkte der Proteaseaktivität auf Trypsin zurückzuführen sein.

Die Reduktion/Alkylierung von Cysteinresten wird in diesem Protokoll vor dem Trypsinaufschluss nicht durchgeführt. Cystein-haltige Peptide machen etwa 10% der tryptischen Peptide aus dem menschlichen Proteom aus. Wir beobachten weniger Cystein-haltige Peptide mit einem Ansatz ohne Reduktion / Alkylierung. Diese Schritte verwenden Reagenzien, die mit der Markierung durch TMT (NHS-Esterchemie) unmittelbar nach dem Aufschluss nicht kompatibel sind.

Bei dieser TMT-Markierungsstrategie werden der Träger und die Referenzen mit 126 bzw. 127N markiert, während Einzelzell- und Kontrollmulden mit 128C bis 135N gekennzeichnet sind. Die beiden Markierungen nach der Referenz, 127C und 128N, werden aufgrund der isotopischen Kreuzkontamination durch die Träger- und Referenzkanäle, die im Peptidmaterial deutlich häufiger vorkommen als die einzelnen Zellen, nicht verwendet. Insgesamt gibt es 12 TMT-Kanäle pro Set, die zur Markierung einzelner Zellen oder Regelmulden mit TMTpro-16plex verwendet werden können, oder 14 TMT-Kanäle pro Set mit TMTpro-18plex.

Die kritischen Schritte im Protokoll zur Durchführung von Einzelzell-Proteomik-Messungen mit diesem Protokoll umfassen die Vorbereitung des Trägers, die Einzelzellisolierung, die Lyse, den Aufschluss, die Barcode-Kennzeichnung und die richtigen Massenspektrometrieparameter. Diese Schritte wurden in diesem Dokument skizziert und an anderer Stelleausführlich beschrieben 17,21,25. Jeder Schritt hat ein entsprechendes Diagramm oder eine Reihe von Diagrammen in DO-MS, die eine einfache Qualitätskontrolle ermöglichen. Im Falle einer erfolgreichen Erstellung des Trägers ermöglichen beispielsweise Diagramme, die die Anzahl der identifizierten Peptide, die Markierungseffizienz und den Prozentsatz der Misclevage-Rate darstellen, die Überprüfung seiner erfolgreichen Herstellung. Repräsentative DO-MS-Berichte sind in dieser Veröffentlichung enthalten und können unter http://scope2.slavovlab.net/ für die Originaldaten eingesehenwerden 16. Diese DO-MS-Berichte ermöglichen es, die Optimierung der Methode in Richtungen zu bewerten, die von den Autoren noch nicht untersucht wurden, wie z.B. längere LC-Gradienten, andere Verdauungsenzyme oder alternative chemische Barcodes.

Derzeit begrenzt die serielle Analyse von Peptiden durch datenabhängige Erfassungsalgorithmen die Anzahl der Peptide, die in einem LC-Lauf von angemessener Länge analysiert werden können. Dies ist zum Teil auf die längeren Füllzeiten zurückzuführen, die für die erfolgreiche Gewinnung von genügend Ionen für eine zuverlässige Einzelzellquantifizierung erforderlich sind21. Eine inhärente Einschränkung bei der Verwendung des Trägers ist das Fehlen einer direkten Bewertung der Verdauungs- und Markierungseffizienz der einzelnen Zellen. Derzeit besteht eine Lösung für diese Einschränkung darin, eine Qualitätskontrolle an einer größeren Probe durchzuführen, die neben den einzelnen Zellen verarbeitet wird.

Wir schlugen eine Reihe von Möglichkeiten zur Verbesserung der Einzelzell-Proteomik vor, wie z.B. den Bau von Massenspektrometern mit mehreren Analysatoren. Die derzeitige Methode ermöglicht die Quantifizierung von Tausenden von Proteinen aus einzelnen Säugetierzellen mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 Zellen pro Tag mit kommerziell erhältlichen Reagenzien und Geräten. SCoPE2, die zweite Generation des SCoPE-MS-Ansatzes, verbesserte sich gegenüber seinem Vorgänger deutlich in Bezug auf die Anzahl der pro Zeiteinheit analysierbaren Zellen, die Anzahl der pro Zeiteinheit analysierbaren Proteine, die für die Probenvorbereitung benötigte Zeit, die Zugänglichkeit von Reagenzien und Geräten sowie die Gesamtkosten für die Vorbereitung und Analyse pro einzelne Zelle. Membrangebundene Proteine sind durch die Gefrierhitzelyse und Proteaseverdauung zugänglich, wie im Vergleich zur Harnstofflysegezeigt 23. Die Methode identifiziert viele Proteine aus dem oberen Drittel des Proteoms in Bezug auf die Häufigkeit16. Wenn sich die modifizierte Proteoform im oberen Drittel des Proteoms befindet und das modifizierte Peptid für die massenspektrometrische Analyse zugänglich ist (ionisiert gut, hat einen Massenunterschied zu unmodifiziertem Peptid), wird es eher für dieses Protokoll zugänglich sein. Diese Methode kann fruchtbar in biologischen Systemen angewendet werden, in denen eine signifikante Heterogenität zwischen den Zellen besteht, z. B. in Bezug auf Differenzierung, Seneszenz oder immunologische Reaktionen (dh Phagozytose).

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Wir möchten uns für den Preis des NSF I-Corps Program (Northeastern University) im Herbst 2021 bedanken, der diese Publikation finanziert hat.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
384-Well-Platte, Standard-PCR-PlatteThermo Fisher ScientificAB1384Polypropylenplatten sollten verwendet werden, falls ein Ersatz erforderlich ist. Falls substituiert, sollte der Grad der potenziellen Polymerkontamination durch andere Platten vor der SCoPE2-Herstellung beurteilt werden.
Acetonitril (zur Herstellung von Puffern), Optima LC-MS/MS typeFisher ScientificA955-1Dieses Acetonitril wird für alle Puffer verwendet, nämlich für das 50%ige Acetonitril, das verwendet wird, um nach dem Durchlaufen des Trägers durch die Vertiefungen zu gelangen, und die Referenz bei der Kombination von SCoPE2-Sets.
Achtung: Acetonitril ist eine brennbare Flüssigkeit. Es kann Haut, Augen, Atemwege und das zentrale Nervensystem reizen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Griff unter einem chemischen Abzug.
Acetonitril (zur Herstellung von TMT), wasserfrei, 99,8%Sigma Aldrich271004-100MLDieses Acetonitril wird zur Resuspendierung von TMT-Etiketten in der Herstellerkonzentration verwendet.
Achtung: Acetonitril ist eine brennbare Flüssigkeit. Es kann Haut, Augen, Atemwege und das zentrale Nervensystem reizen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Griff unter einem chemischen Abzug.
Selbstklebende PCR-PlattenfolienThermo Fisher ScientificAB0626
Autosampler Fläschchen mit SchraubgewindeThermo Fisher ScientificC5000-51B
Autosampler Fläschchen-Spinner (z. B. myFuge 5)MTC BioC2595Dieses Modell verfügt über keine Geschwindigkeitsregelung. Es wird einfach verwendet, um Flüssigkeit am Boden von Autosampler-Fläschchen zu sammeln.
Benzonase-NukleaseSigma AldrichE1014-25KU
Klarglasfläschchen mit Schraubgewinde, 9 mmThermo Fisher Scientific60180-509
Ameisensäure, Pierce, LC-MS/MS-QualitätThermo Fisher Scientific85178Achtung: Ameisensäure ist eine brennbare Flüssigkeit. Es kann zu schweren Augenschäden oder Hautverbrennungen kommen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen. In einem gut belüfteten Bereich handhaben.
Autosampler-Einsätze aus Glas, 9 mmThermo Fisher ScientificC4010-630
Hydroxylamin (HA), 50% Gew./VolSigma Aldrich467804-50MLAchtung: Hydroxylamin kann Hautreizungen verursachen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen.
Mantis Mikrofluidik-Chips, 3PFE-Chips mit geringem VolumenFormulatrixMCLVPR2Diese Chips sind für die Verwendung mit dem Mantis Mikrofluidik-Liquidhandler zur Abgabe organischer Lösungen vorgesehen. Diese können zum Spenden von TMT-Etiketten verwendet werden.
Mantis Mikrofluidik-Chips, Silikonchips mit geringem VolumenFormulatrixMCLVS12Diese Chips sind für die Verwendung mit dem Mantis Mikrofluidik-Liquidhandler zur Abgabe wässriger Lösungen vorgesehen. Diese können nicht zum Spenden von TMT-Etiketten verwendet werden.
Der mikrofluidische Liquid HandlerFormulatrixLiquid Handler von Mantis kann ersetzt werden. Es ist jedoch wichtig zu überprüfen, ob das System mit 100 % Acetonitril kompatibel ist (wie im Fall von TMT-Etiketten) und dass das System keine Polymerverunreinigungen oder andere Arten von Verunreinigungen in die Proben einbringt.
Mantis PCR-Plattenadapter mit breiten konischen Stiften für die automatisierte PlattenhandhabungFormulatrix232400
MassPREP-PeptidmischungWasser186002337Mischung aus neun nicht-tryptischen Peptiden
PCR-Röhrchenspinner (d. h. Mikrozentrifuge mit 16 Plätzen für 0,2-ml-Röhrchen)USA Scientific2621-0016Dieses Modell verfügt über keine Geschwindigkeitsregelung. Es wird einfach verwendet, um Flüssigkeit am Boden von Rohren zu sammeln.
PCR-Röhrchen: TempAssure 0,2 mL PCR 8-Röhrchen-StreifenUSA Scientific1402-3900Wenn sie ersetzt werden, sollte der Grad einer potenziellen Polymerkontamination durch andere Platten vor der SCoPE2-Herstellung beurteilt werden.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 10x, pH 7,4, RNasefreiThermo Fisher ScientificAM9625
Plattenspinner (d. h. PlateFuge-Mikrozentrifuge)Benchmark ScientificModell C2000Dieses Modell verfügt über keine Geschwindigkeitsregelung. Es wird einfach verwendet, um Flüssigkeit am Boden von Brunnen zu sammeln.
Thermocycler (d. h. C1000 Touch mit 384-Well-Modul)Biorad1851138
TMTpro 16plex Markierungsreagenzienset, 1 x 5 mgThermo Fisher ScientificA44520
Triethylammoniumbicarbonat (TEAB), 1 M, pH 8,5Sigma AldrichT7408100ML
Trypsin-Gold-MassenspektrometriePromegaV5280Das Trypsin ist von sehr hoher Reinheit. Andere Trypsin-Reagenzien können in ihrem Reinheitsgrad variieren. Der Reinheitsgrad ist wichtig, um positive SCoPE2-Ergebnisse zu erzielen.

Achtung: Trypsin kann Haut-, Atemwegs- und Augenreizungen verursachen. Achten Sie darauf, persönliche Schutzausrüstung zu tragen. Griff unter einem chemischen Abzug.
Vortex (Analoger Vortex-Mischer)VWRModell 58816-121
Wasserbad-Ultraschallgerät (d. h. 2,8-Liter-Ultraschallreiniger mit digitalem Timer)VWR97043964
Wasser, Optima LC-MS/MS-QualitätFisher ScientificW6-1Es wird empfohlen, alle Lösungen, die verdünnt oder hergestellt werden müssen, mit massenspektrometrischem Wasser herzustellen. Alle Verdünnungen und/oder Mastermixe sollten frisch hergestellt werden. Verunreinigungen durch minderwertiges Wasser können sich negativ auf den Peptidnachweis und die Datenqualität einzelner Zellen auswirken.
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Referenzen

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SCoPE2 ProtokollTandem MassentaggingProteinquantifizierungFl ssigkeitschromatographieTrypsinverdauautomatisierte Probenvorbereitung

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