Dissektionsteknikker og histologisk prøveudtagning af hjertet i store dyremodeller for hjerte-kar-sygdomme

Summary

På grund af den komplekse anatomi kan en konsekvent reproducerbar dissektions- og høstprotokol for hjerteprøver være udfordrende at implementere. Dette manuskript præsenterer nøgleelementerne i nogle standard hjertedissektionsprotokoller og fremhæver både de grove undersøgelsesmetoder og de prøveudtagningssteder, der almindeligvis anvendes til histopatologisk undersøgelse.

Abstract

Standard bruttoundersøgelse og prøveudtagning er nøgleelementer i reproducerbarheden og succesen af eksperimentelle undersøgelser af hjerte-kar-sygdomme udført hos store dyr. I betragtning af hjertets komplekse anatomi, forskelle mellem arter og typer af kompenserende og patologiske reaktioner er konsekvente protokoller udfordrende at implementere. Brugen af flere dissektionsprotokoller tilpasses normalt til prosektorens erfaring, og personlig præference er fortsat en kilde til eksperimentel og interobserver variabilitet. Her er målet at præsentere de vigtigste anatomiske træk og vartegn, dissektionsprotokoller og histologiske prøveudtagningsstandarder for hjertet hos nogle almindeligt anvendte arter (herunder hunde, svin, drøvtyggere og katte) som modeller af hjerte-kar-sygdomme.

To standard bruttoundersøgelsesprotokoller præsenteres her. For det første indstrømnings-udstrømningsmetoden, som følger den fysiologiske blodgennemstrømningsretning gennem hjertet og store kar (ofte anvendt til hunde, drøvtyggere og svin), og for det andet firekammerdissektionsteknikken (eksemplificeret hos katte). Begge teknikker kan tilpasses enhver art under visse eksperimentelle omstændigheder. Prøveudtagningsprotokollerne omfatter alle interesseområder (sinoatrialknude, ventrikler, interventrikulær septum, atrier, ventiler og aorta), og hvis de udføres korrekt, forbedrer både reproducerbarheden og pålideligheden af eksperimentelle undersøgelser.

Introduction

På grund af den komplekse anatomi og tidlige strenghed, som kan forstyrre vurderingen af hjertevægtykkelsen, er den grove undersøgelse af hjertet udfordrende og tilbøjelig til flere teknikrelaterede eller fortolkningsfejl. Dette forstærkes af de interspecifikke morfologiske variationer og af det faktum, at mange kliniske, større hjertepatologier (herunder tidlige tilfælde af koronar hjertesygdomme, fibrose, arteritis og amyloidose) ikke er forbundet med nogen grove ændringer, idet de i det væsentlige er histologiske patologier. En standardiseret dissektion og histologisk prøvehøstprotokol kan bringe konsistens mellem observatører og samtidig sammenlignelighed og reproducerbarhed af eksperimentelle undersøgelser af hjerte-kar-sygdomme.

Prøverne blev indsamlet fra to hunde (Canis lupus familiaris) (en 3-årig, fransk bulldog og en 8-årig, kvindelig blandet race), en kat (Felis catus) (en 6-årig, mandlig europæisk korthår), en tamsvin (Sus scrofa domesticus) (en 1-årig, mandlig stor hvid) og en ko (Bos taurus) (en 2 måneder gammel, kvindelig Holstein). Hver af de valgte arter har særlig anvendelse som en kardiovaskulær model for en anden sygdom; for eksempel er hunde en foretrukken model til arytmimodellering; katte foretrækkes til hypertrofisk kardiomyopati (HCM), da det er den art med den højeste forekomst af HCM; svin anvendes som model for akut myokardieinfarkt; og drøvtyggere bruges som model for forgiftning på grund af deres eksponering for toksiner, der let kan findes på enge¹¹.

I dette manuskript præsenteres en obduktionsprotokol og to dissektionsprotokoller i hjertet, der er designet til at forbedre den grove og histologiske undersøgelse af hjertet i eksperimentelle hjerte-kar-sygdomme. De beskrevne protokoller blev udviklet på baggrund af oplysninger fra veterinære lærebøger 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, tidsskriftslitteratur 3,13,14^, officielle dokumenter 15 og webinarer ^{16 ,17}. Prøverne, der blev brugt i denne undersøgelse, blev høstet fra kadavere, der blev indsendt til patologiafdelingen i USAMV Cluj-Napoca til rutinemæssig obduktionsdiagnostik.

Protocol

Den eksperimentelle protokol modtog bioetisk aftale (nr. 311 fra 2022) og blev godkendt af Bioetikudvalget ved University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca i overensstemmelse med både national (lov nr. 43 af 2014) og europæisk (EU-direktiv nr. 63 fra 2010) lovgivning. Se materialetabellen for detaljer om alle materialer og instrumenter, der anvendes i denne protokol.

1. Obduktionsprotokol

BEMÆRK: Det anbefales, at den samme obduktionsprotokol anvendes til alle de præsenterede arter på grund af lettere adgang, det er, når det udføres ^2,12. Følgende trin repræsenterer obduktionen udført i en mellemstor hund. Tilpas trinene, når du udfører obduktioner på forskellige emner.

1. Vej emnet og læg det på obduktionsbordet på venstre side (figur 1A). Fortsæt til den eksterne undersøgelse af emnet (ved inspektion og palpation af cutis og slimhinder, idet man bemærker alle ændringer i farve, konsistens og volumen).
2. Brug en kniv (eller en skalpel) og lav et snit på 7 cm i højre axilla (figur 1A).
3. Find coxofemoral-krydset (figur 1A, B). Åbn kapslen med en kniv. Skær ledbåndet på lårbenets hoved (figur 1B).
4. Brug kniven til at forlænge hudsnittet i axilla kranialet til mandibulær symfyse og caudalt til perineum (figur 1B).
5. Fjern huden med skalpellen og udsæt thorax- og abdominalvæggen fra den ventrale midterlinje til niveauet for de vertebrale tværgående processer (figur 1B).
6. Med skalpellen og tangen skal du oprette en klap gennem mavemuren, ventrocaudal til højre kystbue. Åbn bukhulen med en saks-følg det kaudale aspekt af den højre hypokondrium (figur 1B).
7. Forlæng snittet caudalt langs det højre paralumbarområde indtil den ydre iliac crest. Derefter forlænges snittet indtil pubic indsættelsen af linea alba.
8. Kort fortalt undersøge abdominale organer in situ (ved at bemærke eventuelle ændringer i farve, konsistens, volumen og position af organerne).
9. Med skalpellen og tangen punkteres membranen på det højeste punkt (figur 1B).
10. Indtast brysthulen ved at fjerne højre brystkasse med to langsgående sektioner ved hjælp af knogleskærende tang. Sektion det parasternale brusksegment af ribbenene. Dernæst skal du sektionere det dorsale segment af ribbenene, proximale til costovertebrale led (figur 1C).
11. Undersøg hjertet in situ (figur 1C). Bemærk størrelse, position, farve, forbindelser med de tilstødende væv og ved palpation, eventuelle ændringer i konsistensen⁹.
    BEMÆRK: Hvis der er en trombose eller medfødt hjertesygdom, skal hjertet dissekeres in situ (denne fremgangsmåde muliggør fuldstændig undersøgelse af de store kar).
12. Brug saks til at undersøge og åbne perikardialhulen med en langsgående sektion fra bunden til toppen af hjertet. Undersøg perikardialhulen og epikardiet (bemærk eventuelle ændringer i farve, konsistens og volumen)¹².
13. Slip hjertet med en saks, hvilket giver tværgående sektioner af aorta, lungestammen og begge vena cavae. Sektion den overlegne vena cava mindst 1 cm over indgangen til højre atrium for at bevare crista terminalis^11,13.
14. Undersøg organets ydre kontur, epikardiets udseende, myokardiets udseende ved epikardiets gennemsigtighed og det ydre udseende af de store kar (figur 2A).
    BEMÆRK: Generelt præsenterer åbningen og undersøgelsen af perikardiet nogle forskelle mellem arten. Undersøgelsen af perikardialhulen starter med en ekstern inspektion og vurdering gennem perikardiets gennemsigtighed af det samlede perikardieindhold ^1,2. Hos en kat eller hund indeholder perikardiet typisk ca. 0,25 ml/kg tynd, klar, gennemskinnelig til lysegul væske⁹. Hvis der er patologiske effusioner, skal de opsamles med en steril sprøjte eller vakuumrør.

2. Dissektion protokol

BEMÆRK: Flere obduktionsteknikker bruges til hjertet, hver med flere fordele. Til denne protokol blev to af de mest anvendte teknikker valgt: 1) "indstrømnings-udstrømningsmetoden", som muliggør en bedre undersøgelse af ventilerne og endokardiet og er en protokol, der anvendes til de fleste af arterne 2,11,12,16, og²) "fire kamre dissektion"/"ekkokardiografisk plan" -teknik, der typisk anvendes til katte eller små hunde^{1, 17}.

1. "Indstrømnings-udstrømningsmetoden" til hjertedissektion 2,11,12,16
   1. Placer hjertet med atriefladen opad (figur 2A).
   2. Brug saks og tandløs tang til bredt at skære fra den kaudale vena cava sammen ind i højre atrium (figur 2B). Fortsæt snittet til højre auricular appendage for at udsætte crista terminalis / sinoatrial node (SA node). Undersøg tricuspidventilen fra dorsal visning.
   3. Skær et afsnit fra højre atrium til krydset mellem højre ventrikel og interventrikulær septum (figur 2C). Vis den højre atrioventrikulære ventil.
   4. Sektion den højre ventrikel fri væg langs interventrikulær septum. Fortsæt sektionen indtil lungestammens oprindelse (figur 2C, D).
   5. Undersøg grundigt de højre atrioventrikulære ventiler, herunder chordae tendineae, og papillærmusklerne (figur 2D). Skær chordae tendineae.
   6. Placer tang gennem lungestammen og skær bagagerummet i længderetningen (figur 2E). Undersøg lungeudstrømningskanalen, lungestammens oprindelse og semilunarventiler.
   7. Skær venstre atrium fra lungevenerne til spidsen af venstre auricle (figur 2F). Undersøg bicuspid (mitral) ventilen fra dorsal visning.
   8. Placer hjertet med interventrikulær septum nedad (figur 2F). Lav et stort snit i den ventrikulære frie væg fra bunden af ventriklen til hjertetoppen. Vis den venstre atrioventrikulære ventil helt.
   9. Skær chordae tendineae af spidsen af den venstre atrioventrikulære ventil.
   10. Placer tang gennem venstre ventrikulære udstrømningskanal og brug den som vejledning til at åbne aorta (figur 2G).
   11. Brug saltopløsning til at fjerne alle blodpropper. Når alle blodpropper er fjernet, vurderes og sammenlignes hjertevægten med kropsmassen eller almindelige hjertevægttabeller (tabel 1)^11,13.
   12. Vej hjertet.
   13. Hvis kun SA-knuden er interessepunktet, skal du efter venstre ventrikelundersøgelse placere hele hjertet helt i 10% neutralbufferet formalin (NBF) i 24 timer og trimme højre atrium for at prøve crista terminalis.
       BEMÆRK: Ved denne teknik kan venstre og højre ventrikler let værdsættes. Forholdet mellem venstre og højre ventrikulær vægtykkelse er 3: 1, med små forskelle efter art og race; For dyrefosterets hjerte er forholdet 1:1¹².

3. Prøveudtagningsprotokol for histologi¹⁶

1. Med en skalpel laves to langsgående, parallelle snit (ca. 5 mm fra hinanden), der involverer højre atrium, tricuspidventilen og den højre ventrikulære frie væg (figur 2I)
2. Lav to langsgående parallelle snit (ca. 5 mm fra hinanden), der involverer venstre atrium, mitralventil, dorsal papillærmuskel og venstre ventrikel (figur 2H).
3. Inden for den dorsale øvre tredjedel af hjertet skal du tværgående sektionere bunden af hjertet efter en linje, herunder interventrikulær septum, højre atrium, aorta, aortaklap og tricuspidventil (figur 2J).
4. Lav to langsgående parallelle snit, der involverer bunden af aorta og interventrikulær septum (figur 2J).
5. Trim højre atrium omkring crista terminalis , og sørg for flere parallelle sektioner orienteret på tværs på cristaens længdeakse (ca. 3-4 mm fra hinanden) for at opnå seks stykker af SA-noden (figur 3, figur 4I og figur 5H).
6. Trim det opnåede væv i histologiske kassetter.
   BEMÆRK: Anbefalet blokeringsprotokol: trin 3.1.-histologisk blok 1 (figur 6 viser det resulterende dias fra denne blok.), trin 3.2.-histologisk blok 2 (figur 7 viser det resulterende dias fra denne blok), trin 3.4.-histologisk blok 3 (figur 8 viser det resulterende dias fra denne blok), trin 3.5.-histologisk blok 4 (figur 9 viser det resulterende dias fra denne blok).
7. Nedsænk vævene i 10% NBF i mindst 48 timer.

4. Prøveudtagning af kranspulsårer 3,10,14

1. Brug tang og en skalpel til at dissekere kranspulsårerne fra hjertets parakonale rille (figur 4K). Fix koronararterien natten over i 10% NBF.
2. Afkalkning om nødvendigt tilstrækkeligt i en 1:1 blanding af 8% myresyre og saltsyre.
3. Lav flere tværgående snit med 3 mm intervaller. Placer sektionerne i en kassette, og sæt derefter kassetten i 10% NBF indtil indlejring.
   BEMÆRK: Grise kan bruges som en hjertemodel for mennesker, især når det kommer til koronar hjertesygdom. Derfor anbefales supplerende prøver og histologiske sektioner af kranspulsårer 3,10,14.

5. Hjertets dissektionsteknik "fire kamre"/"ekkokardiografiske plan" ^1,17

BEMÆRK: Fire-kammer dissektionsteknikken består af et snit fra bunden til toppen af hjertet for at opnå standardvisningen¹. "Fire-kammer" -teknikken anvendes bedst på faste væv.

1. Placer hele hjertet i 10% NBF i mindst 48 timer.
2. Når hjertet er fastgjort i 10% NBF i mindst 48 timer (figur 10A), skal du placere to tandløse lige dissektionstang, den ene gennem kraniale cava-højre atrium-tricuspidventil-højre ventrikel og den anden gennem lungevenen-venstre atrium-mitralventil-venstre ventrikel-venstre ventrikel (figur 10B).
3. Brug mellemrummet mellem tangarmene som vejledning til skærebladet fra bunden til toppen af hjertet (figur 10C). Der skal være en ekstra sektion i længderetningen, som er ca. 5 mm fra den sektion, der er beskrevet i trin 5.2. på hjertesegmentet, som omfatter aorta.
4. Med et tværgående snit skal du helt adskille hjertebasen fra toppen. Placer hvert vævssegment i en histologisk kassette.
   BEMÆRK: Anbefalet blokeringsprotokol: hjertetoppens histologiske blok 5 (figur 11A viser det resulterende dias fra denne blok), hjertebase-histologisk blok 6 (figur 11B viser det resulterende dias fra denne blok).
5. Anbring kassetterne i 10% NBF indtil indlejring. Fix alle hjerteprøverne i 10% NBF (mere end 10 gange vævets volumen), behandl dem rutinemæssigt i paraffinvoks, sektion ved 4 μm tykkelse og plet med hæmatoxylin og eosinplet (H&E-plet) efter en tidligere beskrevet protokol¹⁰.
   BEMÆRK: Hvis der er mistanke om myokarditis, "skal et stykke frisk hjertevæv opbevares under sterile forhold med sterilt kirurgisk materiale og steril prøvebeholder til mikrobiologiske og virale undersøgelser"¹³.

6. Fotografisk dokumentation

BEMÆRK: Fotografisk dokumentation er et valgfrit trin i obduktionen. Fotografering og videooptagelser er imidlertid afgørende for at have en "nøjagtig dokumentation af normal og unormal anatomi"³.

1. For korrekt fotografisk dokumentation skal du tage digitale billeder, mens du udfører "progressiv dissektion af hjertevæv"¹³. Der henvises til retningslinjerne for fotografisk dokumentation og fotografi¹⁵ den generelle syns-forreste og bageste; et stykke af hjertet; og eventuelle formodede læsioner.

Representative Results

Denne protokol blev brugt til at visualisere anatomiske træk og indsamle prøver til histologisk undersøgelse af hjertet i fire forskellige arter (hund, kat, gris og ko). Obduktionsprotokollen blev gentaget i hver af de ovennævnte arter, men kun illustreret hos hunde. Obduktionsprotokollen begynder med en omfattende ekstern undersøgelse af kroppen (figur 1A) (inklusive huden, udforskelige lymfeknuder og ydre slimhinde), måling af den samlede vægt og scoring af dyrets generelle tilstand. Efter den eksterne undersøgelse fortsætter obduktionen med en delvis flåning af kroppen (rettet mod grundigt at undersøge subcutis og overfladiske muskler) og med åbningen af hovedkroppens hulrum (figur 1B-D).

Bughulen er typisk det første, der undersøges (figur 1C), efterfulgt af en omfattende in situ-undersøgelse af bughulen og abdominale organer efterfulgt af sektionering af membranen og endelig fjernelse af højre hemithorax (figur 1D). Ved denne teknik kan der opnås en god in situ-undersøgelse af thoracoabdominale organer (herunder perikardialhulen og hjertet), samtidig med at det giver en korrekt vurdering af forbindelserne mellem disse organer og de lokale blodkar, lymfatiker, ledbånd og nerver. Undersøgelsen af perikardialhulen opnås ved bred sektionering af parietal perikardiet efter hjertets længdeakse efterfulgt af fjernelse af hjertet ved at sektionere hjertets store kar tæt på lungeparenchymen. Den eksterne undersøgelse af hjertet efterfølges af sektionering af hjertehulrummet, hvilket muliggør en omfattende inspektion og endelig korrekt høst af vævsprøverne til histopatologi. Kort fortalt præsenteres proceduren og resultaterne af de to hjertedissektionsteknikker, "blodgennemstrømningen" (figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5) og de "fire kamre" (figur 10).

"Blodgennemstrømningsteknikken" blev brugt i hjertet af hunde, svin og drøvtyggere (figur 2, figur 4 og figur 5). Efter at hjertet blev fjernet fra kroppen, blev den eksterne konfiguration observeret (figur 2A, figur 4A og figur 5A). Under udførelsen af dissektionen skal man bemærke den atrieformede konfiguration, crista terminalis, som er det makroskopiske identifikationselement for sinoatrialknuden (figur 2B, figur 4B og figur 5B). Efter at have fortsat med protokollens trin (figur 2B-G, figur 4B-G og figur 5B-G) er dissektionen afsluttet, og høstprotokollen for histologien kan påbegyndes (figur 2H-J, figur 4G-J og figur 5H-K). Alternativt kan crista terminalis også høstes, efter at hjertet er fikseret (figur 3) i 10% NBF. Sammenlignet med hunde er der et ekstra trin, der skal udføres i hjertet af svinet - høsten af kranspulsåren (figur 4K).

Efter høsten blev prøverne fastgjort i 10% NBF, rutinemæssigt behandlet og indlejret i paraffinvoks og til sidst snittet til 4 μm og farvet af H&E. De histologiske dias opnået ved denne teknik omfatter typisk følgende: 1) epikardiet, myokardiet og endokardiet i højre atrium og ventrikel, tricuspidventilen og koronararterierne til histologisk blok 1 (figur 6); 2) epikardiet, myokardiet og endokardiet i venstre atrium og ventrikel, mitralventilen, kranspulsårerne og hjertenerverne til histologisk blok 2 (figur 7); 3) myokardiet, endokardiet i interventrikulær septum og epikardium i højre atrium og tricuspidventilen til histologisk blok 3 (figur 8); 4) flere sektioner fra SA-knuden for histologisk blok 4 (figur 9); 5) epikardiet, myokardiet og endokardiet i toppen af hjertet (venstre og højre ventrikler og interventrikulær septum) for histologisk blok 5 (figur 11A); og 6) epikardiet, myokardiet og endokardiet i bunden af hjertet (venstre og højre atri, ventrikler, interventrikulær septum, atrioventrikulære ventiler og koronararterier) for histologisk blok 6 (figur 11B).

Figur 1: Obduktionsteknik hos en hund. (A) placeringen af motivet på venstre side; B) åbning af bughulen C) åbning af brysthulen D) undersøgelse af brysthulen. 1-7 angiver placeringen og rækkefølgen af de anbefalede snit. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Dissektions- og prøveudtagningsprotokol i hundens hjerte. (A) Ekstern konfiguration af hjertet; (B) Start fra den kaudale cava og trim det højre atrium, åbn det højre atrium og observer crista terminalis; C) trimme højre ventrikel langs krydset med interventrikulær septum vis tricuspidventilen; (D) efter at have skåret chordae tendineae, undersøge højre ventrikel og fortsætte snittet langs den parakonale rille; E) føre tangen gennem lungestammen og bruge dem til at styre snittet undersøge lungeudstrømningen (F) 1-åben venstre atrium, 2-fra bunden, skåret til toppen; undersøge mitralventilen og venstre ventrikel; G) føre tangen gennem aorta og bruge dem til at styre snittet undersøge aorta; (H) lav to snit langs venstre hjerte og læg det midterste stykke i 10% NBF; (I) lav to snit langs højre hjerte, læg det midterste stykke i 10% NBF og trim crista terminalis væk; (J) trim bunden af hjertet væk, lav to snit langs stykket, og læg det midterste stykke i 10% NBF. Forkortelser: SAN = sinoatrial knude; NBF = neutral-bufferet formalin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Prøveudtagning af crista terminalis fra et formalinfikseret hjerte. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Dissektions- og prøveudtagningsprotokol i svinehjerte. (A) Ekstern konfiguration af hjertet; (B) Start fra den kaudale cava og del det højre atrium, undersøg det højre atrium, find crista terminalis, og begynd at åbne højre ventrikel; (C) trim højre ventrikel langs krydset med interventrikulær septum og undersøge tricuspidventilen; (D) efter at have skåret chordae tendineae, undersøge højre ventrikel, placere tangen gennem lungestammen og bruge dem til at styre snittet; E) undersøge lungeudstrømningen efter sektionering af venstre atrium skal du skære venstre ventrikel fra base til spids; F) undersøge mitralventilen og venstre ventrikel og skære chordae tendineae placer tang gennem aorta og brug dem til at styre snittet; (G) undersøge aorta, lave to snit langs venstre hjerte, placere det midterste stykke i 10% NBF; H) foretage to snit langs højre hjerte; placer det midterste stykke i 10% NBF; (I) trim crista terminalis væk, læg stykket i 10% NBF; J) trim hjertets bund væk, lav to snit langs stykket og læg det midterste stykke i 10% NBF; (K) trim kranspulsåren, fastgør den natten over og lav derefter flere tværgående snit med 3 mm intervaller. Forkortelse: NBF = neutral-bufferet formalin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Dissektions- og prøveudtagningsprotokol i koens hjerte. (A) Ekstern konfiguration af hjertet; (B) Start fra den kaudale cava og del det højre atrium, undersøg det højre atrium, find crista terminalis, og begynd at åbne højre ventrikel; C) trimme højre ventrikel langs krydset med interventrikulær septum og undersøge tricuspidventilen (D) fortsætte snittet parallelt med den parakonale rille, føre tangen gennem lungestammen og bruge dem til at styre snittet; (E) undersøge lungeudstrømningen, begynde at skære lungevenerne og venstre atrium og derefter fortsætte med at skære venstre ventrikel fra base til spids; F) undersøge mitralventilen og venstre ventrikel og skære chordae tendineae (G) føre tangen gennem aorta, bruge dem til at styre snittet og undersøge aorta; H) trim crista terminalis væk, og læg stykket i 10% NBF (I) lav to snit langs venstre hjerte, og placer det midterste stykke i 10% NBF; (J) lav to snit langs højre hjerte og læg det midterste stykke i 10% NBF; (K) trim bunden af hjertet væk, lav to snit langs stykket, og læg det midterste stykke i 10% NBF. Forkortelse: NBF = neutral-bufferet formalin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Histologisk undersøgelse af højre ventrikel, højre atrium og tricuspidventil i hjertet af en hund. H&E farvning. (A) Histologisk prøve af højre ventrikel, højre atrium og tricuspidventil; (B) højre ventrikel, højre atrium og tricuspidventil. Skala søjler = 500 μm; (C) højre ventrikel, højre atrium og kranspulsårer. Skala søjler = 100 μm; (D) højre atrium. Skalastænger = 500 μm. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; RV = højre ventrikel; RA = højre atrium; Ts-V = tricuspidventil; CA = koronararterie; EnC = endokardium; MC = myokardium; EpC = epikardium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Histologisk undersøgelse af venstre ventrikel, venstre atrium og mitralventil i hjertet af en hund. H&E farvning. (A) Histologisk prøve af venstre ventrikel, venstre atrium og mitralventil; (B) venstre atrium. Skala søjler = 500 μm; (C) venstre atrium, venstre ventrikel, kranspulsåre og nerve. Skala søjler = 100 μm; (D) koronararterie, nerve. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; LA = venstre atrium; LV = venstre ventrikel; Mt-V = mitralventil; CA = koronararterie; EnC = endokardium; MC = myokardium; EpC = epikardium; NV = nerve. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: Histologisk undersøgelse af interventrikulær septum, højre atrium og tricuspidventil i hjertet af en hund. H&E-farvning (A) Interventrikulær septum, højre atrium og tricuspidventil-histologisk prøve; (B) interventrikulær septum, højre atrium og tricuspidventil. Skalastænger = 500 μm. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; IVS = interventrikulær septum; RA = højre atrium; Ts-V tricuspid ventil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 9: Histologisk undersøgelse af sinoatrialknuden i hjertet af en hund. H&E farvning. A) histologisk prøve af crista terminalis (B) sinoatrial knude 4x forstørrelse. Skala søjler = 500 μm; (C) sinoatrial knude 20x forstørrelse. Skala søjler = 100 μm; (D) sinoatrial knude 40x forstørrelse. Skalastænger = 50 μm. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; SA-knude = sinoatrial-knude. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 10: Dissektionsprotokol på et formalinfast hjerte hos en kat. (A) Ekstern konfiguration af hjertet; (B) føre tangen gennem kranial cava og lungevener; tangen styrer længdesektionen fra base til spids; (C) fire-kammer visningen efter snittet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 11: Histologiske prøver af en kats hjerte. H&E farvning. A) toppen af den hjertehistologiske prøve B) grundlaget for den hjertehistologiske prøve. Forkortelser: H&E = hæmatoxylin og eosin; LV = venstre ventrikel; IVS = interventrikulær septum; RV = højre ventrikel; LA = venstre atrium; MV = mitralventil; TS-V = tricuspidventil; RA = højre atrium. Klik her for at se en større version af denne figur.

Art	Alder	Gennemsnitlig %BW	(LV + S)/RV	Citationsnumre
Kat	Nyfødt	0.77%	-	7
Kat	Voksen	0.33%-0.46%	2.94-4.17	8, 5, 11
Hund	Nyfødt	0.47%-0.76%	-	8, 7
Hund	Voksen	0.70%-0.85%	2.39-5.12	8, 6, 11
Svin	Voksen	0.32%-0.48%	2.38-3.84	11
Får	Voksen	0.17%-0.65%	2.63-4.54	11
Ko	Voksen	0.30%-0.66%	2.43-4.00	11

Tabel 1: Referenceværdier for forholdet mellem normal hjertevægt og legemsvægt og ventrikulært forhold hos dyr. Hjertemålinger for kat, hund, gris, får og ko. Forkortelser: BW = kropsvægt; LV = venstre ventrikel; S = interventrikulær septum; RV = højre ventrikel.

Discussion

Når du udfører den aktuelle protokol, skal flere kritiske trin overvejes nøje for ensartede resultater. Hos unge dyr er hjertemålinger forskellige fra dem hos voksne (herunder ventrikulær vægtykkelse), og generelt repræsenterer hjertet en større andel af kropsvægten^11,12. Graden af ventrikulær hypertrofi kan kvantificeres ved at anvende en generel vægtformel, forholdet mellem venstre ventrikel plus septum divideret med den frie højre ventrikelvægt, som under normale forhold skal være 2,8-4,0 hos modne dyr (tabel 1). Hvis dette forhold overstiger 4,0, indikerer det venstre ventrikulær hypertrofi, og hvis det er mindre end 2,8, indikerer det højre ventrikulær hypertrofi 4,11,12. For at opnå kammerets værdi skal den højre ventrikulære frie væg dissekeres langs interventrikulær væg, og koronarrillen skal adskilles fra højre atrium. Dissektionen af venstre ventrikel fra venstre atrium er lavet ved den atrioventrikulære ring⁴.

Hjertet adskilles fra kroppen ved at sektionere de store kar. Hvis sektionerne af de store fartøjer er for tæt på hjertebasen, kan flere strukturer blive kompromitteret, hovedsageligt atrierne og auriklerne. For at lette processen er det nødvendigt at trække hjertet forsigtigt ventralt for korrekt at sektionere de store kar over hjertets bund. Et andet kritisk trin er at genkende morfologien af crista terminalis, som er en diskret anatomisk struktur, der kræver detaljeret strukturel viden om hjertet. SA-knuden skal høstes omhyggeligt og indlejres med særlig hensyntagen til arrangementet af vævsprøverne i blokkene under den histologiske proces.

Modifikationen af "fire-kammer" -teknikken var at ændre det histologiske blokeringsskema fra en blok til to. Standarddimensionerne for bredt anvendte histologiske kassetter og den tilpassede histologiske procedure (inklusive den roterende mikrotomfarvningsstation) er ikke egnede til at passe hele hjertesektionen i en blok uden vævsforvrængning. Selvom "fire-kammer" -teknikken letter undersøgelsen af hjertekamrenes struktur, begrænser den undersøgelsen af det ledende system. Dette er især vigtigt i tilfælde, hvor hjertearytmi er dokumenteret. I betragtning af at "firekammer" -teknikken kræver væv fastgjort i NBF, kan flere yderligere undersøgelser såsom bakteriologi og molekylærbiologi til en vis grad kompromitteres.

Når det kommer til hjertet af en kat eller en lille hund, opnås en nøjagtig standard ekkokardiografisk plan på fast væv. Fire-kammervisningen er nyttig, især for kammerdimensioner, hvis der er variationer i ventrikulære eller atriestørrelser¹. Ud over fordelene ved den perfekte overlejring af bruttotrimningen høvlet med dem, der opnås under klinisk undersøgelse ved ekkokardiografi, giver denne teknik fordelen ved at inkludere de fleste af hjertets nøglekomponenter i kun to histologiske blokke.

Metoden "inflow-outflow" beskrevet hos svin blev tilpasset fra protokoller, der blev brugt i menneskers hjerter ved at tilføje koronararterieprøvetagningstrinnet. De aktuelt beskrevne hjertedissektionsprotokoller illustrerer standardpunkter for prøveudtagning. Når dissektoren observerer eller har mistanke om andre læsioner ud over dem, der er omfattet af protokollen, skal der desuden indsamles supplerende prøver fra interesseområderne.

Under udviklingen af de nuværende protokoller blev andre metoder undersøgt, såsom metoden, der involverer et indledende langsgående snit af de store hjertekurver¹² og "brødbrød" / kortakseteknik ^9,11. Teknikken, der involverer et langsgående snit af de store hjertekurver, er en enklere protokol, der ofte anvendes i biomedicinsk uddannelse¹². Den kortaksede sektionsteknik ("brødbrødsteknik") kan udføres med en kortaksesektion¹¹ eller en række sektioner på 1-2 cm tykkelse fra toppen mod bunden, hvilket efterlader det atrioventrikulære apparat intakt⁹. Denne teknik er den mest egnede, hvis dissektoren har mistanke om myokardiepatologier (herunder inflammatoriske patologier og kardiomyopatier), men har ulempen ved en overfladisk undersøgelse af valvulære komponenter⁹.

Begge disse teknikker mestres let af personer med en relativt grundlæggende viden om hjertets anatomi, men mangler robuste punkter til histologisk prøveudtagning og vægtning af hver hjertekomponent. Efter at have fortsat med disse metoder indebærer den efterfølgende høstprocedure besværligt arbejde for at identificere interesseområderne og opnå konstante prøver. På hjerterne dissekeret ved hjælp af disse metoder kræver den separate vejning af de to halvdele en indsats for at kunne beregne forholdet mellem dem. Den kortaksede metode har brug for yderligere trin til undersøgelse af endokardiet og alle komponenter placeret ved bunden af hjertet. Desuden består høstproceduren efter disse metoder af besværligt arbejde for at identificere de interessante områder og opnå konstante prøver.

Dette manuskript præsenterer nøgleelementerne i nogle standard hjertedissektionsprotokoller og fremhæver både de grove undersøgelsesmetoder og de prøveudtagningssteder, der almindeligvis anvendes til histopatologisk undersøgelse. Med hensyn til de fremtidige anvendelser af teknikken er hovedformålet med den præsenterede protokol at tilbyde en robust retningslinje for hjertedissektion, der let kan bruges i alle de eksperimentelle undersøgelser, der kræver en detaljeret hjertevurdering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.