Disseksjonsteknikker og histologisk prøvetaking av hjertet i store dyremodeller for hjerte- og karsykdommer

Summary

På grunn av den komplekse anatomien kan en konsekvent reproduserbar disseksjons- og høstingsprotokoll for hjerteprøver være utfordrende å implementere. Dette manuskriptet presenterer nøkkelelementene i noen standard hjertedisseksjonsprotokoller, og fremhever både bruttoundersøkelsesmetodene og prøvetakingsstedene som vanligvis brukes til histopatologisk undersøkelse.

Abstract

Standard bruttoundersøkelse og prøvetaking er sentrale elementer i reproduserbarheten og suksessen til eksperimentelle studier av kardiovaskulære sykdommer utført hos store dyr. Med tanke på hjertets komplekse anatomi, interspecies forskjeller og typer kompenserende og patologiske reaksjoner, er konsistente protokoller utfordrende å implementere. Bruken av flere disseksjonsprotokoller er vanligvis tilpasset prosektorens erfaring, og personlig preferanse fortsetter å være en kilde til eksperimentell og interobservervariabilitet. Her er målet å presentere de viktigste anatomiske egenskapene og landemerkene, disseksjonsprotokollene og histologiske prøvetakingsstandardene til hjertet hos noen vanlige arter (inkludert hunder, griser, drøvtyggere og katter) som modeller for kardiovaskulære sykdommer.

To standard brutto undersøkelsesprotokoller presenteres her. For det første innstrømningsmetoden, som følger den fysiologiske blodstrømningsretningen gjennom hjertet og store kar (ofte brukt hos hunder, drøvtyggere og griser), og for det andre firekammerdisseksjonsteknikken (eksemplifisert hos katter). Begge teknikkene kan tilpasses enhver art under visse eksperimentelle omstendigheter. Prøvetakingsprotokollene inkluderer alle interesseområder (sinoatrial node, ventrikler, interventrikulær septum, atria, ventiler og aorta), og hvis det utføres riktig, forbedrer både reproduserbarheten og påliteligheten av eksperimentelle studier.

Introduction

På grunn av den komplekse anatomien og den tidlige strengheten, som kan forstyrre vurderingen av hjerteveggtykkelsen, er den grove undersøkelsen av hjertet utfordrende og utsatt for flere teknikkrelaterte eller tolkningsfeil. Dette forsterkes av de interspesifikke morfologiske variasjonene og av det faktum at mange kliniske, store hjertesykdommer (inkludert tidlige tilfeller av koronar hjertesykdom, fibrose, arteritt og amyloidose) ikke er forbundet med noen grove endringer, som i hovedsak er histologiske patologier. En standardisert disseksjon og histologisk prøvehøstingsprotokoll kan gi konsistens mellom observatører og samtidig sammenlignbarhet og reproduserbarhet av eksperimentelle studier av kardiovaskulære sykdommer.

Prøvene ble samlet inn fra to hunder (Canis lupus familiaris) (en 3 år gammel, mannlig fransk bulldog og en 8 år gammel, kvinnelig blandingsrase), en katt (Felis catus) (en 6 år gammel, mannlig europeisk korthår), en tamgris (Sus scrofa domesticus) (en 1 år gammel, mannlig stor hvit) og en ku (Bos taurus) (en 2 måneder gammel, kvinnelig Holstein). Hver av de valgte artene har spesiell bruk som en kardiovaskulær modell for en annen sykdom; for eksempel er hunder en foretrukket modell for arytmimodellering; katter foretrekkes for hypertrofisk kardiomyopati (HCM), da det er arten med høyest forekomst av HCM; griser brukes som modell for akutt hjerteinfarkt; og drøvtyggere brukes som modell for rus på grunn av deres eksponering for giftstoffer som lett kan bli funnet på enger¹¹.

I dette manuskriptet presenteres en nekropsyprotokoll og to disseksjonsprotokoller i hjertet, designet for å forbedre den grove og histologiske undersøkelsen av hjertet i eksperimentelle kardiovaskulære sykdommer. De beskrevne protokollene ble utviklet basert på informasjon fra veterinære lærebøker 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, tidsskriftlitteratur 3,13,14^, offisielle dokumenter 15 og webinarer ^{16 ,17}. Prøvene som ble brukt i denne studien ble høstet fra sendt til patologiavdelingen ved USAMV Cluj-Napoca for rutinemessig obduksjonsdiagnostikk.

Protocol

Den eksperimentelle protokollen mottok bioetisk avtale (nr. 311 fra 2022) og ble godkjent av Bioethics Committee ved University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca, i samsvar med både nasjonal (lov nr. 43 av 2014) og europeisk (EU-direktiv nr. 63 fra 2010) lovgivning. Se materialtabellen for detaljer om alle materialer og instrumenter som brukes i denne protokollen.

1. Nekropsy-protokoll

MERK: Det anbefales at den samme nekropsyprotokollen brukes for alle artene som presenteres på grunn av lettere tilgang, det er når det utføres ^2,12. Følgende trinn representerer nekropsien som utføres i en mellomstor hund. Tilpass trinnene når du utfører nekropsier på forskjellige emner.

1. Vei motivet og legg det på nekropsibordet på venstre side (figur 1A). Fortsett til ekstern undersøkelse av emnet (ved inspeksjon og palpasjon av cutis og mucosas, og noter alle endringene i farge, konsistens og volum).
2. Bruk en kniv (eller en skalpell) og gjør et snitt på 7 cm i høyre aksille (figur 1A).
3. Finn det coxofemorale krysset (figur 1A,B). Åpne kapselen med en kniv. Klipp leddbåndet i lårbenets hode (figur 1B).
4. Bruk kniven til å forlenge hudinnsnittet i aksillakraniet til mandibulær symfyse og kaudalt til perineum (figur 1B).
5. Fjern huden med skalpellen og utsett thorax og bukvegg fra ventral midtlinje til nivået av vertebrale tverrgående prosesser (figur 1B).
6. Med skalpell og tang, lag en klaff gjennom bukveggen, ventrocaudal til høyre kystbue. Åpne bukhulen med saks - følg det kaudale aspektet av riktig hypokondrium (figur 1B).
7. Forleng snittet kaudalt langs høyre paralumbarområde til den ytre iliac-kammen. Etterpå forlenger du snittet til kjønnsinnsettingen av linea alba.
8. Kort sagt, undersøk bukorganene in situ (ved å merke seg eventuelle endringer i endringer i farge, konsistens, volum og plassering av organene).
9. Med skalpell og tang punkterer du mellomgulvet på høyeste punkt (figur 1B).
10. Gå inn i brysthulen ved å fjerne høyre ribbe bur med to langsgående seksjoner ved hjelp av beinskjærende tang. Seksjon det parasternale brusksegmentet av ribbeina. Deretter seksjonerer du det dorsale segmentet av ribbeina, proksimalt for costovertebral-leddene (figur 1C).
11. Undersøk hjertet in situ (figur 1C). Legg merke til størrelse, posisjon, farge, forbindelser med tilstøtende vev, og ved palpasjon, eventuelle endringer i konsistensen⁹.
    MERK: Hvis en trombose eller medfødt hjertesykdom er tilstede, må hjertet dissekeres in situ (denne tilnærmingen tillater fullstendig undersøkelse av de store karene).
12. Bruk saks til å undersøke og åpne perikardialhulen med en langsgående seksjon fra basen til hjertets topp. Undersøk perikardialhulen og epikardiet (noter eventuelle endringer i farge, konsistens og volum)¹².
13. Slipp hjertet med saks, noe som gir tverrgående deler av aorta, lungestamme og begge vena cavae. Seksjon den overlegne vena cava minst 1 cm over inngangen til høyre atrium for å bevare crista terminalis^11,13.
14. Undersøk organets ytre kontur, utseendet på epikardiet, myokardiets utseende ved epikardiets gjennomsiktighet og det ytre utseendet til de store karene (figur 2A).
    MERK: Generelt presenterer åpning og undersøkelse av perikardiet noen forskjeller mellom artene. Undersøkelsen av perikardialhulen starter med en ekstern inspeksjon og vurdering gjennom gjennomsiktigheten av perikardiet av det totale perikardialinnholdet ^1,2. Hos en katt eller hund inneholder perikardiet vanligvis ca. 0,25 ml/kg tynn, klar, gjennomsiktig til lysegul væske⁹. Hvis det er noen patologiske effusjoner, bør de samles med en steril sprøyte eller vakuumrør.

2. Disseksjonsprotokoll

MERK: Flere nekropsy teknikker brukes for hjertet, hver med flere fordeler. For denne protokollen ble to av de mest brukte teknikkene valgt: 1) "innstrømnings-utstrømningsmetoden", som tillater en bedre undersøkelse av ventilene og endokardiet og er en protokoll som brukes for de fleste artene 2,11,12,16, og²) "fire kamre disseksjon" / "ekkokardiografisk plan" -teknikken, vanligvis brukt til katter eller små hunder ^{1, 17}.

1. "Tilsig-utstrømningsmetoden" for hjertedisseksjon 2,11,12,16
   1. Plasser hjertet med atrieansiktet oppover (figur 2A).
   2. Bruk saks og tannløs tang til å skjære bredt fra kaudal vena cava sammen til høyre atrium (figur 2B). Fortsett kuttet til høyre ørevedheng for å eksponere crista terminalis / sinoatrialnoden (SA-noden). Inspiser trikuspidalklaffen fra dorsalvisningen.
   3. Skjær en seksjon fra høyre atrium til krysset mellom høyre ventrikkel og interventrikulær septum (figur 2C). Vis høyre atrioventrikulær ventil.
   4. Seksjon høyre ventrikelfri vegg langs interventrikulær septum. Fortsett avsnittet til lungestammens opprinnelse (figur 2C, D).
   5. Undersøk de høyre atrioventrikulære klaffene grundig, inkludert chordae tendineae, og papillærmusklene (figur 2D). Skjær chordae tendineae.
   6. Plasser tang gjennom lungestammen og skjær stammen i lengderetningen (figur 2E). Undersøk lungeutstrømningskanalen, lungestammens opprinnelse og semilunarventiler.
   7. Klipp venstre atrium fra lungevenene til spissen av venstre auricle (figur 2F). Inspiser bicuspid (mitral) ventilen fra dorsal visning.
   8. Plasser hjertet med den interventrikulære septum vendt nedover (figur 2F). Lag et stort snitt i ventrikulær fri vegg fra bunnen av ventrikkelen til hjertepunktet. Vis venstre atrioventrikulær ventil helt.
   9. Klipp chordae tendineae av cusp av venstre atrioventrikulær ventil.
   10. Plasser tang gjennom venstre ventrikkels utløpskanal og bruk den som veiledning for å åpne aorta (figur 2G).
   11. Bruk saltoppløsning for å fjerne alle blodproppene. Når alle blodproppene er fjernet, vurder og sammenlign hjertevekten mot kroppsmassen eller standard hjertevekttabeller (tabell 1) ^11,13.
   12. Vei hjertet.
   13. Hvis bare SA-knuten er interessepunktet, etter venstre ventrikelundersøkelse, plasser hele hjertet helt i 10% nøytralbufret formalin (NBF) i 24 timer, og trim høyre atrium for å prøve crista terminalis.
       MERK: Ved denne teknikken kan venstre og høyre ventrikler lett bli verdsatt. Forholdet mellom venstre og høyre ventrikkels veggtykkelse er 3: 1, med små forskjeller etter art og rase; For dyrefosterhjertet er forholdet 1:1¹².

3. Prøvetakingsprotokoll for histologi¹⁶

1. Med en skalpell lager du to langsgående, parallelle kutt (ca. 5 mm fra hverandre) som involverer høyre atrium, trikuspidalklaffen og høyre ventrikkelfrie vegg (figur 2I)
2. Lag to langsgående parallelle kutt (ca. 5 mm fra hverandre) som involverer venstre atrium, mitralklaff, dorsal papillær muskel og venstre ventrikel (figur 2H).
3. Innenfor den dorsale øvre tredjedelen av hjertet, transversalt delen av hjertet etter en linje, inkludert interventrikulær septum, høyre atrium, aorta, aortaklaff og trikuspidalklaff (figur 2J).
4. Lag to langsgående parallelle kutt som involverer bunnen av aorta og interventrikulær septum (figur 2J).
5. Trim høyre atrium rundt crista terminalis , og gi flere parallelle seksjoner orientert transversalt på den langsgående aksen til crista (ca. 3-4 mm fra hverandre) for å oppnå seks stykker av SA-knuten (figur 3, figur 4I og figur 5H).
6. Trim de oppnådde vevene i histologiske kassetter.
   MERK: Anbefalt blokkeringsprotokoll: trinn 3.1.-histologisk blokk 1 (figur 6 viser det resulterende lysbildet fra denne blokken.), trinn 3.2.-histologisk blokk 2 (figur 7 viser det resulterende lysbildet fra denne blokken), trinn 3.4.-histologisk blokk 3 (figur 8 viser det resulterende lysbildet fra denne blokken), trinn 3.5.-histologisk blokk 4 (figur 9 viser det resulterende lysbildet fra denne blokken).
7. Senk vevet i 10% NBF i minst 48 timer.

4. Prøvetaking av koronararteriene 3,10,14

1. Bruk tang og skalpell til å dissekere koronararteriene fra hjertets parakonale spor (figur 4K). Fiks koronararterien over natten i 10% NBF.
2. Avkalk om nødvendig tilstrekkelig i en 1: 1-blanding av 8% maursyre og saltsyre.
3. Gjør flere tverrgående kutt med 3 mm intervaller. Plasser seksjonene i en kassett og legg deretter kassetten i 10% NBF til den er innebygd.
   MERK: Griser kan brukes som en hjertemodell for mennesker, spesielt når det gjelder koronar hjertesykdom. Derfor anbefales supplerende prøver og histologiske seksjoner av koronararteriene 3,10,14.

5. Hjertets disseksjonsteknikk "fire kamre"/"ekkokardiografiske plan" ^1,17

MERK: Firekammerdisseksjonsteknikken består av et kutt fra basen til hjertets topp for å oppnå standardvisning¹. "Firekammer" -teknikken brukes best på faste vev.

1. Plasser hele hjertet i 10% NBF i minst 48 timer.
2. Etter at hjertet er festet i 10% NBF i minst 48 timer (figur 10A), plasser to tannløse rette disseksjonstang, en gjennom kranial cava-høyre atrium-tricuspid ventil-høyre ventrikel, og den andre gjennom lungevenen-venstre atrium-mitralklaff-venstre ventrikkel (figur 10B).
3. Bruk mellomrommet mellom tangarmene som veiledning for skjærebladet fra basen til hjertets topp (figur 10C). Gi en ekstra langsgående seksjon ca. 5 mm bortsett fra avsnittet beskrevet i trinn 5.2. på hjertesegmentet, som inkluderer aorta.
4. Med et transversalt snitt, skille hjertebasen helt fra toppunktet. Plasser hvert vevssegment i en histologisk kassett.
   MERK: Anbefalt blokkeringsprotokoll: hjertets apex-histologiske blokk 5 (figur 11A viser det resulterende lysbildet fra denne blokken), hjertebase-histologisk blokk 6 (figur 11B viser det resulterende lysbildet fra denne blokken).
5. Legg kassettene i 10 % NBF til de bygges inn. Fest alle hjerteprøvene i 10% NBF (mer enn 10 ganger volumet av vev), behandle dem rutinemessig i parafinvoks, seksjon ved 4 μm tykkelse og flekk med hematoksylin- og eosinflekk (H&E-flekk) etter en tidligere beskrevet protokoll¹⁰.
   MERK: Ved mistanke om myokarditt skal "et stykke friskt hjertevev oppbevares under sterile forhold med sterilt kirurgisk materiale og steril prøvebeholder for mikrobiologiske og virale studier"¹³.

6. Fotografisk dokumentasjon

MERK: Fotografisk dokumentasjon er et valgfritt trinn i nekropsiundersøkelsen. Fotografering og videoopptak er imidlertid avgjørende for å ha en "nøyaktig dokumentasjon av normal og unormal anatomi"³.

1. For riktig fotografisk dokumentasjon, ta digitale bilder mens du utfører "progressiv disseksjon av hjertevev"¹³. Se retningslinjene for fotografisk dokumentasjon og fotografi¹⁵ den generelle visningen - fremre og bakre; et stykke av hjertet; og eventuelle mistenkte lesjoner.

Representative Results

Denne protokollen ble brukt til å visualisere anatomiske egenskaper og samle prøver for histologisk undersøkelse av hjertet i fire forskjellige arter (hund, katt, gris og ku). Nekropsyprotokollen ble gjentatt i hver av de ovennevnte artene, men illustrert bare hos hunder. Nekropsyprotokollen begynner med en omfattende ekstern undersøkelse av kroppen (figur 1A) (inkludert huden, utforskbare lymfeknuter og ytre slimhinner), måle totalvekten og score dyrets generelle tilstand. Etter den eksterne undersøkelsen fortsetter nekropsien med en delvis skinning av kroppen (rettet mot å grundig undersøke subcutis og overfladiske muskler) og med åpningen av hovedkroppens hulrom (figur 1B-D).

Bukhulen er typisk den første som undersøkes (figur 1C), etterfulgt av en omfattende in situ-undersøkelse av bukhulen og bukorganene, etterfulgt av snitting av mellomgulvet, og til slutt fjerning av høyre hemithorax (figur 1D). Ved denne teknikken kan en god in situ-undersøkelse av thoracoabdominale organer (inkludert perikardialhulen og hjertet) oppnås, samtidig som det muliggjør en riktig vurdering av koblingene til disse organene med de lokale blodkarene, lymfene, ledbåndene og nervene. Undersøkelsen av perikardialhulen oppnås ved bred seksjonering av parietalperikardiet etter hjertets lengdeakse, etterfulgt av fjerning av hjertet ved å seksjonere hjertets store kar nær lungeparenkymen. Den eksterne undersøkelsen av hjertet etterfølges av seksjonering av hjertehulene, noe som muliggjør en omfattende inspeksjon og til slutt riktig høsting av vevsprøvene for histopatologi. Kort fortalt presenteres prosedyren og resultatene av de to hjertedisseksjonsteknikkene, "blodstrømmen" (figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5) og "fire kamre" (figur 10).

"Blodstrøm" -teknikken ble brukt i hjertet av hunder, svin og drøvtyggere (figur 2, figur 4 og figur 5). Etter at hjertet ble fjernet fra kroppen, ble den eksterne konfigurasjonen observert (figur 2A, figur 4A og figur 5A). Mens man utfører disseksjonen, bør man legge merke til atriekonfigurasjonen, crista terminalis, som er det makroskopiske identifikasjonselementet for sinoatrialnoden (figur 2B, figur 4B og figur 5B). Etter å ha gått videre med trinnene i protokollen (figur 2B-G, figur 4B-G og figur 5B-G), er disseksjonen fullført, og høstingsprotokollen for histologien kan påbegynnes (figur 2H-J, figur 4G-J og figur 5H-K). Alternativt kan crista terminalis også høstes etter at hjertet er fikset (figur 3) i 10% NBF. Sammenlignet med hunder, er det et ekstra trinn som skal utføres i hjertet av svinet - høsting av koronararterien (figur 4K).

Etter høstingen ble prøvene festet i 10% NBF, rutinemessig behandlet og innebygd i parafinvoks, og til slutt seksjonert ved 4 μm og farget av H&E. De histologiske lysbildene oppnådd ved denne teknikken inkluderer vanligvis følgende: 1) epikardiet, myokardiet og endokardiet til høyre atrium og ventrikel, trikuspidalklaffen og koronararteriene for histologisk blokk 1 (figur 6); 2) epikardiet, myokardiet og endokardiet i venstre atrium og ventrikkel, mitralklaffen, koronararteriene og hjertenervene for histologisk blokk 2 (figur 7); 3) myokardiet, endokardiet i det interventrikulære septum og epikardiet i høyre atrium og trikuspidalklaffen for histologisk blokk 3 (figur 8); 4) flere seksjoner fra SA-noden for histologisk blokk 4 (figur 9); 5) epikardium, myokard og endokard i hjertets topp (venstre og høyre ventrikkel og interventrikulær septum) for histologisk blokk 5 (figur 11A); og 6) epikard, myokard og endokard i hjertebunnen (venstre og høyre atria, ventrikler, interventrikulær septum, atrioventrikulære klaffer og koronararterier) for histologisk blokk 6 (figur 11B).

Figur 1: Nekropsiteknikk hos hund. (A) Plassering av motivet på venstre side; (B) åpning av bukhulen; (C) åpning av brysthulen; (D) undersøkelse av brysthulen. 1-7 angir plasseringen og rekkefølgen på de anbefalte snittene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Disseksjons- og prøvetakingsprotokoll i hundens hjerte. (A) Ekstern konfigurasjon av hjertet; (B) Start fra kaudal cava og trim høyre atrium, åpne høyre atrium og observer crista terminalis; (C) trim høyre ventrikel langs krysset med interventrikulær septum; vise tricuspidventilen; (D) etter å ha kuttet chordae tendineae, undersøk høyre ventrikel og fortsett kuttet langs det parakonale sporet; (E) pass tangen gjennom lungestammen og bruk dem til å lede kuttet; undersøke lungeutstrømningen; (F) 1-åpne venstre atrium, 2-fra basen, kuttet til toppunktet; undersøke mitralventilen og venstre ventrikel; (G) pass tangen gjennom aorta og bruk dem til å lede kuttet; undersøke aorta; (H) gjør to kutt langs venstre hjerte og plasser midtstykket i 10% NBF; (I) gjør to kutt langs høyre hjerte, plasser midtstykket i 10% NBF, og trim bort crista terminalis; (J) trim bort bunnen av hjertet, gjør to kutt langs stykket, og legg det midterste stykket i 10% NBF. Forkortelser: SAN = sinoatrial node; NBF = nøytralbufret formalin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Prøvetaking av crista terminalis fra formalinfiksert hjerte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Disseksjons- og prøvetakingsprotokoll i grisehjerte. (A) Ekstern konfigurasjon av hjertet; (B) Start fra kaudal cava og seksjon høyre atrium, undersøk høyre atrium, finn crista terminalis, og begynn å åpne høyre ventrikel; (C) trim høyre ventrikel langs krysset med interventrikulær septum og undersøk trikuspidalklaffen; (D) etter å ha kuttet chordae tendineae, undersøk høyre ventrikel, plasser tangen gjennom lungestammen og bruk dem til å lede kuttet; (E) undersøke lungeutstrømningen; etter å ha seksjonert venstre atrium, kutt venstre ventrikel fra base til topp; (F) undersøke mitralklaffen og venstre ventrikkel, og kutte chordae tendineae; plasser tang gjennom aorta og bruk dem til å lede kuttet; (G) undersøke aorta, lage to kutt langs venstre hjerte, plasser midtstykket i 10% NBF; (H) gjør to kutt langs høyre hjerte; plasser midtstykket i 10% NBF; (I) trim bort crista terminalis, plasser stykket i 10% NBF; (J) trim bort bunnen av hjertet, gjør to kutt langs stykket, og legg det midterste stykket i 10% NBF; (K) trim koronararterien, fest den over natten, og gjør deretter flere tverrgående kutt med 3 mm intervaller. Forkortelse: NBF = nøytralbufret formalin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: Disseksjon og prøvetakingsprotokoll i kuens hjerte. (A) Ekstern konfigurasjon av hjertet; (B) Start fra kaudal cava og seksjon høyre atrium, undersøk høyre atrium, finn crista terminalis, og begynn å åpne høyre ventrikel; (C) trim høyre ventrikel langs krysset med interventrikulær septum, og undersøk trikuspidalklaffen; (D) fortsett kuttet parallelt med parakonalsporet, pass tangen gjennom lungestammen og bruk dem til å lede kuttet; (E) undersøke lungeutstrømningen, begynne å kutte lungevenene og venstre atrium, og fortsett deretter å kutte venstre ventrikel fra base til topp; (F) undersøke mitralklaffen og venstre ventrikkel, og kutte chordae tendineae; (G) pass tangen gjennom aorta, bruk dem til å lede kuttet og undersøk aorta; (H) trim bort crista terminalis, og legg brikken i 10% NBF; (I) gjør to kutt langs venstre hjerte, og plasser midtstykket i 10% NBF; (J) gjør to kutt langs høyre hjerte, og plasser midtstykket i 10% NBF; (K) trim bort bunnen av hjertet, gjør to kutt langs stykket, og plasser midtstykket i 10% NBF. Forkortelse: NBF = nøytralbufret formalin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6: Histologisk undersøkelse av høyre ventrikkel, høyre atrium og trikuspidalklaff i hjertet til en hund. H&E-farging. (A) Histologisk prøve av høyre ventrikel, høyre atrium og trikuspidalklaff; (B) høyre ventrikkel, høyre atrium og trikuspidalklaff. Skala barer = 500 μm; (C) høyre ventrikkel, høyre atrium og koronararteriene. Skala barer = 100 μm; (D) høyre atrium. Skala barer = 500 μm. Forkortelser: H&E = hematoxylin og eosin; RV = høyre ventrikel; RA = høyre atrium; Ts-V = trikuspidalklaff; CA = koronararterie; EnC = endokardium; MC = myokard; EpC = epikardium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7: Histologisk undersøkelse av venstre ventrikkel, venstre atrium og mitralklaff i hundens hjerte. H&E-farging. (A) Histologisk prøve av venstre ventrikel, venstre atrium og mitralventil; (B) venstre atrium. Skala barer = 500 μm; (C) venstre atrium, venstre ventrikkel, koronararterie og nerve. Skala barer = 100 μm; (D) koronararterie, nerve. Skala barer = 50 μm. Forkortelser: H&E = hematoxylin og eosin; LA = venstre atrium; LV = venstre ventrikel; Mt-V = mitralventil; CA = koronararterie; EnC = endokardium; MC = myokard; EpC = epikardium; NV = nerve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8: Histologisk undersøkelse av interventrikulær septum, høyre atrium og trikuspidalklaff i hundens hjerte. H&E-farging (A) Interventrikulær septum, høyre atrium og trikuspidalklaff-histologisk prøve; (B) interventrikulær septum, høyre atrium og trikuspidalklaff. Skala barer = 500 μm. Forkortelser: H&E = hematoxylin og eosin; IVS = interventrikulær septum; RA = høyre atrium; Ts-V tricuspid ventil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9: Histologisk undersøkelse av sinoatrialknuten i hjertet til en hund. H&E-farging. (A) Histologisk prøve av crista terminalis; (B) sinoatrial node 4x forstørrelse. Skala barer = 500 μm; (C) sinoatrial node 20x forstørrelse. Skala barer = 100 μm; (D) sinoatrial node 40x forstørrelse. Skala barer = 50 μm. Forkortelser: H&E = hematoxylin og eosin; SA node = sinoatrial node. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10: Disseksjonsprotokoll på et formalinfiksert hjerte av en katt. (A) Ekstern konfigurasjon av hjertet; (B) passere tangen gjennom kraniale cava og lungevener; tangene styrer den langsgående delen fra base til topp; (C) firekammervisningen etter kuttet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 11: Histologiske prøver av hjertet til en katt. H&E-farging. (A) Apex av hjerte-histologisk prøve; (B) basen av hjerte-histologisk prøve. Forkortelser: H&E = hematoxylin og eosin; LV = venstre ventrikel; IVS = interventrikulær septum; RV = høyre ventrikel; LA = venstre atrium; MV = mitralventil; TS-V = trikuspidalklaff; RA = høyre atrium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Art	Alder	Gjennomsnittlig %BW	(LV + S)/RV	Sitering tall
Katt	Nyfødt	0.77%	-	7
Katt	Voksen	0.33%-0.46%	2.94-4.17	8, 5, 11
Hund	Nyfødt	0.47%-0.76%	-	8, 7
Hund	Voksen	0.70%-0.85%	2.39-5.12	8, 6, 11
Gris	Voksen	0.32%-0.48%	2.38-3.84	11
Sau	Voksen	0.17%-0.65%	2.63-4.54	11
Ku	Voksen	0.30%-0.66%	2.43-4.00	11

Tabell 1: Referanseverdier for normal hjertevekt/kroppsvekt ratio og ventrikkelratio hos dyr. Hjertemålinger for katt, hund, gris, sau og ku. Forkortelser: BW = kroppsvekt; LV = venstre ventrikel; S = interventrikulær septum; RV = høyre ventrikkel.

Discussion

Når du utfører den nåværende protokollen, bør flere kritiske trinn vurderes nøye for konsistente resultater. Hos unge dyr er hjertemålinger forskjellige fra voksne (inkludert ventrikulær veggtykkelse), og generelt representerer hjertet en større andel kroppsvekt^11,12. Graden av ventrikulær hypertrofi kan kvantifiseres ved å bruke en generell vektformel, forholdet mellom venstre ventrikel pluss septum dividert med fri høyre ventrikelvekt, som under normale forhold skal være 2,8-4,0 hos modne dyr (tabell 1). Hvis dette forholdet overstiger 4,0, indikerer det venstre ventrikulær hypertrofi, og hvis den er mindre enn 2,8, indikerer den høyre ventrikulær hypertrofi 4,11,12. For å oppnå verdien av kammeret, må den høyre ventrikulære frie veggen dissekeres langs interventrikulærveggen og koronarsporet skal skilles fra høyre atrium. Disseksjonen av venstre ventrikel fra venstre atrium er laget ved den atrioventrikulære ringen⁴.

Hjertet er skilt fra kroppen ved å seksjonere de store karene. Hvis delene av de store karene er for nær hjertebasen, kan flere strukturer bli kompromittert, hovedsakelig atriene og auriklene. For å lette prosessen, er det nødvendig å forsiktig trekke hjertet ventralt for å seksjonere de store karene riktig over hjertebunnen. Et annet kritisk skritt er å gjenkjenne morfologien til crista terminalis, som er en diskret anatomisk struktur som krever detaljert strukturell kunnskap om hjertet. SA-noden må høstes forsiktig og legges inn med spesiell hensyn til arrangementet av vevsprøvene i blokkene under den histologiske prosessen.

Modifikasjonen av "firekammer" -teknikken var å endre det histologiske blokkeringsskjemaet fra en blokk til to. Standarddimensjonene til bredt brukte histologiske kassetter og den tilpassede histologiske prosedyren (inkludert den roterende mikrotomfargingsstasjonen) er ikke egnet til å passe hele delen av hjertet i en blokk uten vevforvrengning. Selv om "firekammer" -teknikken letter undersøkelsen av strukturen i hjertekamrene, begrenser den undersøkelsen av det ledende systemet. Dette er spesielt viktig i tilfeller der hjertearytmi er dokumentert. Videre, med tanke på at "firekammer" -teknikken krever vev fast i NBF, kan flere tilleggsundersøkelser som bakteriologi og molekylærbiologi bli kompromittert til en viss grad.

Når det gjelder hjertet til en katt eller en liten hund, oppnås en nøyaktig standard ekkokardiografisk plan på fast vev. Firekammervisningen er nyttig, spesielt for kammerdimensjoner, hvis det er variasjoner i ventrikulære eller atriestørrelser¹. I tillegg til fordelene knyttet til den perfekte superposisjonen til bruttotrimmingen høvlet med de som oppnås under klinisk undersøkelse ved ekkokardiografi, gir denne teknikken fordelen av å inkludere de fleste nøkkelkomponentene i hjertet i bare to histologiske blokker.

"Inflow-outflow" -metoden beskrevet hos griser ble tilpasset fra protokoller som ble brukt i hjertene til mennesker ved å legge til koronararterieprøvetrinnet. De for tiden beskrevne hjertedisseksjonsprotokollene illustrerer standardpunkter for prøvetaking. I tillegg, når dissector observerer eller mistenker andre lesjoner i tillegg til de som omfattes av protokollen, bør supplerende prøver samles inn fra interesseområdene.

Under utviklingen av dagens protokoller ble andre metoder studert, for eksempel metoden som innebærer et innledende lengdesnitt av de store hjertekurvene¹² og "brødbrød"/kortakseteknikken ^9,11. Teknikken som involverer et langsgående kutt av de store hjertekurvene er en enklere protokoll som ofte brukes i biomedisinsk utdanning¹². Kortakseseksjoneringsteknikken ("brødbrødteknikk") kan utføres med en kort akseseksjon¹¹ eller en serie seksjoner med 1-2 cm tykkelse fra toppunktet mot basen, slik at det atrioventrikulære apparatet forblir intakt⁹. Denne teknikken er den mest egnede hvis dissektoren mistenker myokardpatologier (inkludert inflammatoriske patologier og kardiomyopatier), men har ulempen med en overfladisk undersøkelse av valvulære komponenter⁹.

Begge disse teknikkene er lett mestret av personer med relativt grunnleggende kunnskap om hjertets anatomi, men mangler robuste punkter for histologisk prøvetaking og vekting av hver hjertekomponent. Etter å ha gått videre med disse metodene, innebærer den etterfølgende høstingsprosedyren arbeidskrevende arbeid for å identifisere interesseområdene og oppnå konstante prøver. På hjertene som er dissekert ved hjelp av disse metodene, krever den separate veiingen av de to halvdelene innsats for å kunne beregne forholdet mellom dem. Kortaksemetoden trenger ytterligere trinn for undersøkelse av endokardiet og alle komponentene som ligger ved foten av hjertet. Videre består høstingsprosedyren etter disse metodene av møysommelig arbeid for å identifisere interesseområdene og oppnå konstante prøver.

Dette manuskriptet presenterer nøkkelelementene i noen standard hjertedisseksjonsprotokoller, og fremhever både bruttoundersøkelsesmetodene og prøvetakingsstedene som vanligvis brukes til histopatologisk undersøkelse. Når det gjelder fremtidige anvendelser av teknikken, er hovedformålet med den presenterte protokollen å tilby en robust retningslinje for hjertedisseksjon som lett kan brukes i alle eksperimentelle studier som krever en detaljert hjertevurdering.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.