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Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks aus dem menschlichen Unterkiefer

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DOI:

10.3791/63811

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13. April 2022

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1State Key Laboratory of Military Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2College of Life Sciences, Northwest University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen aus dem Unterkieferknochenmark unter Verwendung der Adhärenzmethode des gesamten Knochenmarks. Die kultivierten Zellen wurden durch Zellproliferationsassays, Durchflusszytometrie und Induktion der Differenzierung mehrerer Linien identifiziert.

Zusammenfassung

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) haben ein großes Potenzial bei der Knochenregeneration, der Immunmodulation und der Behandlung refraktärer chronischer Krankheiten gezeigt. In letzter Zeit wurden verschiedene Ursprünge gefunden, um hMSCs zu erhalten, während Knochenmark immer noch als Hauptquelle galt. Aus dem Knochenmark gewonnene MSCs (BMSCs) aus verschiedenen Spenderknochenstellen weisen aufgrund von Mikroumgebungsfaktoren unterschiedliche Merkmale auf. Studien haben gezeigt, dass BMSCs aus dem Kieferknochen größere proliferative und osteogene Kapazitäten haben können als BMSCs aus langen Knochen oder dem Beckenkamm. Und maxillofaziale BMSCs wurden als geeigneter für die Stammzelltherapie im Kiefer- und Gesichtsgewebe angesehen. Der Unterkiefer, insbesondere der aufsteigende Ramalbereich mit ausreichend Knochenmark, war eine geeignete Spenderstelle für die Entnahme von BMSCs. In dieser Studie wurde ein Protokoll für die Gewinnung, Isolierung und Kultivierung von MSCs aus dem menschlichen Unterkieferknochenmark (hmBMSCs) beschrieben. Des Weiteren wurden Immunphänotypisierungen von hmBMSCs, Proliferationsassays und in vitro Induktion von osteogener, adipogener und chondrogener Differenzierung durchgeführt, um die kultivierten Zellen zu identifizieren. Die Anwendung dieses Protokolls kann den Forschern helfen, genügend hochwertige hmBMSCs zu erhalten, die für weitere Studien der biologischen Funktion, der Auswirkungen auf die Mikroumwelt und der klinischen Anwendungen erforderlich sind.

Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) sind multipotente Zellen, die in verschiedene Zelltypen differenziert werden können, wie z. B. Osteozyten, Adipozyten und Chondrozyten aus der mesodermalen Linie, Hepatozyten und Pankreozyten aus der endodermalen Linie und Neurozyten aus der ektodermalen Linie1. Daher haben hMSCs ein großes Potenzial für die Geweberegeneration gezeigt. Darüber hinaus sind hMSCs leistungsstarke Immunmodulatoren, die das Mikromilieu im Wirtsgewebe regulieren und chronische refraktäre Erkrankungen wirksam behandelnkönnen 2. Daher wurden hMSCs in klinischen Studien in großem Umfang in der Zelltherapie eingesetzt. Daher ist es wichtig, ausreichend hMSCs mit hoher Qualität auf bequeme Weise erfolgreich zu erhalten.

Seit hMSCs zum ersten Mal im Knochenmark berichtet wurden, wurden viele alternative MSCs-Quellen gefunden, wie z. B. Fettgewebe, Synovialflüssigkeit, Skelettmuskulatur, Fruchtwasser, Endometrium, Zahngewebe und Nabelschnur 1,3. In den meisten präklinischen und klinischen Studien ist das Knochenmark jedoch nach wie vor die Hauptquelle für hMSCs, und aus Knochenmark gewonnene MSCs (BMSCs) werden als Standard für den Vergleich von MSCs aus anderen Quellen herangezogen4. Seit Jahren sind der Beckenkamm oder die langen Knochen (Tibia und Femur) die beliebtesten anatomischen Lokalisationen für die Gewinnung von Knochenmark 1,5. Der Beckenkamm oder die langen Knochen haben jedoch andere embryonale Ursprünge und Entwicklungsmuster als die Kieferknochen 5,6. Viele klinische, Labor- und Entwicklungsstudien haben gezeigt, dass BMSCs unterschiedlicher Herkunft ortsspezifische Eigenschaften aufweisen und die transplantierten BMSCs nach der Implantation an der Empfängerstelle die Eigenschaften der Spenderstelle beibehalten 5,6,7,8,9. Aus entwicklungsbedingter Sicht entstehen die Kiefer- und Gesichtsgewebe wie Oberkiefer, Unterkiefer, Dentin, Alveolarknochen, Pulpa und Parodontalband ausschließlich aus Neuralleistenzellen. Im Gegensatz dazu werden der Beckenkamm und die langen Knochen vom Mesoderm gebildet. Darüber hinaus werden Mandibeln durch intramembranöse Ossifikation gebildet, während axiale und appendikuläre Skelette eine endochondrale Ossifikation durchlaufen. Darüber hinaus haben einige klinische Studien gezeigt, dass aus dem Kieferknochenmark gewonnene hMSCs im Vergleich zum Beckenkamm und den langen Knochen eine bessere zelluläre proliferative Aktivität und Differenzierungsfähigkeit aufwiesen 6,8. Daher wird erwartet, dass BMSCs aus dem Kiefer- und Gesichtsbereich eine bessere Wahl für die Regeneration des Kiefer- und Gesichtsgewebes und die Therapie chronischer refraktärer Erkrankungen im Kiefer- und Gesichtsbereich sind.

Der Unterkiefer besteht aus zweilagigen dicken kortikalen Knochen mit spongiösem Knochenmark dazwischen, damit er die Kraft des Kauens aufladen kann. Daher wird der Unterkiefer, insbesondere der aufsteigende Ramalbereich, in der Regel als Entnahmestelle zur Entnahme von autologen Knochentransplantaten bei kraniomaxillofazialen Operationen verwendet10. Und bei Operationen wie der sagittalen Ramus-Osteotomie des Unterkiefers und der Unterkieferwinkelverkleinerungsplastik müssen Teile der Unterkieferrinde und des spongiösen Knochens entfernt werden, um eine angenehme Gesichtskontur zu erreichen. Diese weggeworfenen spongiösen Knochen könnten eine potenzielle Ressource für hMSCs sein. Nur wenige veröffentlichte Studien beschrieben jedoch das Protokoll zur schnellen Isolierung und Kultivierung hochwertiger menschlicher MSCs aus dem Unterkieferknochenmark (hmBMSCs).

In der vorliegenden Studie wird eine modifizierte Adhärenzmethode für das gesamte Knochenmark verwendet, um ein zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von hmBMSCs einzuführen. Die Stammzellen wurden durch durchflusszytometrische Immunphänotypisierung von MSCs, Proliferationsassays und Induktion der Multiliniendifferenzierung identifiziert. Die Anwendung dieses Standardverfahrens kann den Forschern helfen, qualitativ hochwertige MSCs aus dem menschlichen Unterkieferknochenmark zu erhalten, was für weitere Studien der biologischen Funktion, der Auswirkungen auf die Mikroumwelt und der klinischen Anwendungen wichtig ist.

Protokoll

Das Verfahren zur Entnahme von menschlichen Unterkieferknochenproben wurde von der Ethikkommission der Fakultät für Stomatologie, der Vierten Militärmedizinischen Universität, genehmigt. Die Studie folgte den ethischen Leitlinien der Deklaration von Helsinki von 1975. Alle Spender der vorliegenden Studie wurden über die möglichen Risiken und die Studienziele informiert. Das Alter der Spender lag zwischen 18 und 40 Jahren, und es gab keine geschlechtsspezifischen Vorurteile. Die schriftliche Zustimmung aller menschlichen Teilnehmer wurde eingeholt.

1. Vorbereitung der Operation

  1. Wählen Sie den passenden Spender aus.
    1. Wählen Sie die Patienten als Spender aus, die sich Operationen unterziehen möchten, wie z. B. Unterkieferrücksatz nach sagittaler Split-Ramus-Osteotomie und Unterkieferwinkelverkleinerungsplastik.
  2. Bereiten Sie die Konservierungslösung vor.
    1. Ergänzen Sie 30 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (1x PBS) mit 1% Penicillin und Streptomycin in einem sterilen und enzymfreien 50 mL Zentrifugenröhrchen am Tag vor der Operation. Im Kühlschrank bei 4 °C lagern.
    2. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen mit der Konservierungslösung am Tag der Operation in eine Eisbox und bewahren Sie es 1 h vor der Operation im Operationssaal auf.
  3. Sterilisieren Sie die Instrumente zur Isolierung des Knochenmarks am Tag vor der Operation, einschließlich Schere, Pinzette und Messer bei 120 °C und 0,27 MPa Druck für 20 Minuten.
  4. Bereiten Sie α-MEM-Kulturmedium vor, indem Sie mindestens essentielles Medium alpha (α-MEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin und Streptomycin mischen.
  5. Bereiten Sie ein osteogenes Differenzierungsmedium vor, indem Sie α-MEM-Kulturmedium mit 50 mM Ascorbinsäure, 10 mM β-Glycerinphosphat und 0,1 mM Dexamethason mischen (siehe Materialtabelle).
  6. Bereiten Sie das adipogene Differenzierungsmedium A vor, indem Sie α-MEM-Kulturmedium mit 1 mM Dexamethason, 0,2 mM Indomethacin, 10 μg/ml Insulin und 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) mischen (siehe Materialtabelle).
  7. Bereiten Sie das adipogene Differenzierungsmedium B vor, indem Sie α-MEM-Kulturmedium mit 10 μg/ml Insulin mischen.
  8. Bereiten Sie ein chondrogenes Differenzierungsmedium vor, indem Sie das modifizierte Eagle-Medium von Dulbecco mit hohem Glukosegehalt (HG-DMEM) und 100 nM Dexamethason, 100 g/ml Natriumpyruvat, 25 mg/ml Vitamin C, 40 mg/ml Prolin, 10 ng/ml TGF-β3 und 1% ITS mischen (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Das osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierungsmedium kann, wie oben erwähnt, im eigenen Haus hergestellt werden. In der vorliegenden Studie wurden jedoch kommerziell erhältliche Kits dafür verwendet (siehe Materialtabelle).

2. Entnahme von menschlichen Unterkieferknochenproben

  1. Studieren Sie vor der Operation sorgfältig die dreidimensionalen computertomographischen Scanbilder und die chirurgische Simulationsplanung der Spender (Abbildung 1).
  2. Wählen Sie die Unterkieferstelle aus, die der Spender operativ entfernen möchte und die reich an spongiösem Knochen ist, mit Knochenmark als Spenderstelle.
  3. Desinfizieren und drapschen Sie den Patienten vor der Operation.
  4. Sezieren Sie die ausgewählte Spenderstelle des Unterkiefers mit der Ultraschall-Osteotomklinge (siehe Materialtabelle), um eine Verletzung des Nervus alveolaris inferior und eine Beeinträchtigung des Spenderknochens zu vermeiden.
  5. Die Unterkieferknochenproben werden so bald wie möglich in die Konservierungslösung (Schritt 1.2) gegeben.
  6. Geben Sie die Konservierungslösung mit Knochenproben in eine Eisbox, bis die Isolierung der MSCs im Labor beginnt.
    HINWEIS: Die Isolierung von MSCs muss so bald wie möglich nach der Ernte begonnen werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Wenn die Isolierung von MSCs nicht sofort durchgeführt werden kann, kann die Konservierungslösung mit Knochenproben in einer Eisbox gelagert oder bei 4 °C für maximal 2 h gekühlt werden.

3. Isolierung und Kultivierung humaner mBMSCs

  1. Nehmen Sie die Knochenproben aus der Konservierungslösung und tauchen Sie sie in 1x PBS mit 1% Penicillin und Streptomycin für 5 min auf einer sauberen Bank des Laminar-Flow-Schranks.
    HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, das Blutgerinnsel und die restlichen Mundflüssigkeiten wegzuspülen und den Mikroorganismus weiter zu eliminieren, da der Mund keine vollständig sterile Umgebung ist. Waschen und desinfizieren Sie vor der Zellisolierung und -kultivierung die Hände mit Alkohol und tragen Sie sterile Einweghandschuhe und -masken.
  2. Reinigen Sie das anhaftende Weichgewebe und den Blutfleck auf der Knochenoberfläche mit steriler Feuchtgaze.
  3. Füllen Sie eine sterile Kulturschale von 6 cm mit 5 mL α-MEM-Nährmedium.
  4. Legen Sie den Knochen in die sterile Kulturschale und schneiden Sie ihn mit einem sterilisierten Messer oder einer Schere in kleine Stücke (ca. 2-3 mm3 Volumen).
    HINWEIS: Halten Sie die Knochenproben mit einer Pinzette, um einen Schnitt an den Finger zu vermeiden.
  5. Aspirieren Sie α-MEM-Nährmedium in der Kulturschale mit einer sterilen 1-ml-Einwegspritze.
  6. Führen Sie die Spritzennadel mit α-MEM-Kulturmedium tief in die Knochenmarkhöhle der spongiösen Knochenprobenstücke ein.
  7. Spülen Sie das Knochenmark mit der Spritze von allen Seiten der Knochenprobenstücke in die Kulturschale, mindestens 5-10 Mal pro Seite.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 3.5-3.7, bis alle Knochenprobenstücke rein weiß sind, um sicherzustellen, dass so viel Knochenmark wie möglich in das Kulturmedium gespült wird.
    HINWEIS: Die Gesamtbetriebszeit der obigen Schritte von 3.1-3.8 muss innerhalb von 30 Minuten auf Eis kontrolliert werden.
  9. Entfernen und entsorgen Sie alle Knochenprobenstücke mit einer Pinzette. Weitere kleine Fragmente werden mit einem Zellfilter mit 70 μm Porengröße entfernt.
  10. Schütteln Sie die Kulturschale leicht, damit sich die gespülten Zellen gleichmäßig verteilen.
  11. Stellen Sie die Kulturschale in einen Zellinkubator und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
  12. Überprüfen Sie am dritten Tag der Kultur die Zellmorphologie und den Wachstumsstatus unter einem Lichtmikroskop. Entfernen Sie die Hälfte des Kulturmediums ohne anhaftende Zellen und Gewebefragmente. Fügen Sie 3 ml frisches α-MEM-Nährmedium hinzu.
  13. Entfernen Sie am 7. Kulturtag das gesamte Nährmedium und fügen Sie 5 ml frisches α-MEM-Nährmedium hinzu.
  14. Frischen Sie dann das α-MEM-Kulturmedium alle 3 Tage auf.
  15. Überprüfen Sie täglich die Zellmorphologie und das Zellwachstum.
    HINWEIS: Wenn die primären Zellkulturen (P0) nach 7-10 Tagen Kultur eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen, führen Sie die Zellpassage durch.

4. Zellpassage

  1. Bei einer Konfluenz von 70 % bis 80 % wird das gesamte Kulturmedium der P0-Zellen entfernt. Waschen Sie die Kulturschale zweimal vorsichtig mit 1x PBS, um das restliche Kulturmedium zu reinigen.
  2. Geben Sie 1 ml 0,25 % Trypsin mit 0,02 % EDTA in die Kulturschale, um die Zellen zu verdauen. Schütteln Sie die Kulturschale leicht, um sicherzustellen, dass das Trypsin gleichmäßig verteilt ist. Stellen Sie die Kulturschale für 3 Min. bei 37 °C auf.
  3. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn 70%-80% der Zellen zusammengezogen und gerundet sind, fügen Sie 2 ml α-MEM-Kulturmedium hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen.
  4. Blasen Sie die Oberfläche der Schale mehrmals vorsichtig mit einer Pipette ab, um die Zellen abzublasen.
  5. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Die Zellsuspension bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  6. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit α-MEM-Kulturmedium. P0-Zellen in Kulturflaschen (25 cm) für die Expansion mit einem Spaltverhältnis von 1:2 säen. Die ersten Passagezellen wurden P1-Zellen genannt.
  7. Wenn die P1-Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen, wiederholen Sie die Zellpassage in den Schritten von 4.1-4.6. Die Zellen der zweiten Generation wurden P2-Zellen genannt.
  8. Ändern Sie das Expansionssplitting-Verhältnis auf 1:3 nach der Zellpassage der dritten Generation.
  9. Verwenden Sie P3- bis P5-Zellen, um Identifikationsexperimente durchzuführen.

5. Durchflusszytometrische Analyse

  1. Verdau P3 bis P5 MSCs mit 0,25 % Trypsin und 0,02 % EDTA gemäß den Schritten 4.1-4.5.
  2. Den Überstand verwerfen und die Zellen in 1x PBS in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml resuspendieren.
  3. Übertragen Sie die Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL der Zellsuspension pro Röhrchen.
  4. Geben Sie immunmarkierte monoklonale Anti-Human-Antikörper der Maus in die Mikrozentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden Phycoerythrin (PE)-konjugierte Antikörper gegen CD45, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierte Antikörper gegen CD90, CD34 und CD44 verwendet 4,11 (siehe Materialtabelle), und die Verdünnungen der Antikörper betrugen alle 1:100. Die Verdünnungen von Antikörpern müssen den Anweisungen des Herstellers folgen. PBS wird als Kontrolle dienen.
  5. Inkubieren Sie die Antikörper und die PBS-Kontrolle bei Raumtemperatur im Dunkeln für 30 min.
  6. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie die Suspension und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml 1x PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  7. Legen Sie die Schläuche in das Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle). Zählen Sie die fluoreszenzmarkierten Zellzahlen mit einem Durchflusszytometer mit mindestens 10.000 Ereignissen.
    HINWEIS: Es ist besser, den Prozess der Zellzählung des Durchflusszytometers unmittelbar nach der Immunfluoreszenzmarkierung zu starten. Ist dies nicht der Fall, müssen die Zellen in 1 % Paraformaldehyd fixiert, bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden und den Vorgang innerhalb von 24 Stunden abschließen.

6. Zellproliferations-Assay

  1. Verwenden Sie P3-Zellen, um den Zellproliferationsassay durchzuführen. P3-MSCs mit 0,25 % Trypsin verdauen, indem die Schritte 4.1-4.5 befolgt werden.
  2. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit α-MEM-Kulturmedium.
  3. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer und säen Sie die Zellen auf 96-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 3 x 103 Zellen pro Well, insgesamt 35 Wells, 5 Wells für jeden Zähltag (an Tag 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Frischen Sie das Kulturmedium der Zellen alle 3 Tage auf.
  4. Entsorgen Sie an jedem Zähltag α-MEM-Nährmedium der fünf Vertiefungen für den bestimmten Zähltag und fügen Sie dann 100 μl Kulturmedium und 10 μl CCK-8-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle). Bei 37 °C 1 h inkubieren.
  5. Legen Sie die Kulturplatten in ein Mikrotiterplatten-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) und messen Sie den optischen Dichtewert von fünf Vertiefungen für jeden Zähltag (insgesamt 7 Zähltage) bei einer Wellenlänge von 450 nm. Verwenden Sie fünf Vertiefungen des Kulturmediums ohne Zellen als Leerproben.
  6. Erfassen Sie den optischen Dichtewert jedes Wells, berechnen Sie den Durchschnittswert und die Standardabweichung von fünf Wells für jeden Zähltag und zeichnen Sie die Zellwachstumskurve 5,12.

7. Unterscheidung zwischen mehreren Abstammungslinien

  1. Führen Sie die osteogene Differenzierungsinduktion mit den folgenden Schritten durch.
    1. Verdauen Sie die P3-Zellen mit Trypsin, indem Sie die Schritte 4.1-4.5 befolgen. Die Zellen mit 2 x 105 Zellen/cm2 in eine 6-Well-Platte aussäen. Geben Sie 2,5 ml α-MEM-Nährmedium pro Vertiefung hinzu.
    2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 60 % bis 70 % erreichen, wechseln Sie das Kulturmedium in das osteogene Induktionsmedium (Schritt 1.5). Wechseln Sie dann das Induktionsmedium alle 3 Tage.
    3. Überprüfen Sie die Zellen alle 3 Tage nach der Induktion unter dem Mikroskop. Beobachten Sie die Zellmorphologie und suchen Sie nach offensichtlichen Mineralisierungsknoten.
    4. Führen Sie nach 7 Tagen Induktion die Färbung der alkalischen Phosphatase (ALP) durch, um die Verkalkung der Zellen zu beurteilen.
    5. Verwenden Sie 1x PBS, um die Zellen zweimal schonend zu waschen. Fügen Sie 4% Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren. Verwenden Sie dann 1x PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.
    6. Fügen Sie ALP-Färbelösung hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Verschiedene Arten von ALP-Färbelösungen können die Zellen mit unterschiedlichen Farben färben, z. B. Dunkelgrau, Rot und Blau. In diesem Protokoll wurden die Zellen blau gefärbt. Die Inkubationszeit kann verlängert werden, wenn die Färbefarbe nicht offensichtlich ist. Einige ALP-Lösungsfärbesets können giftig sein; Lesen Sie die Gebrauchsanweisung vor Gebrauch sorgfältig durch, tragen Sie während des Versuchs Handschuhe und eine Maske und waschen Sie sich nach Gebrauch sorgfältig die Hände.
    7. Waschen Sie die Zellen mit Wasser, um die ALP-Färbereaktion zu stoppen. Beobachten Sie blau pigmentierte Körnchen in den Zellen unter einem Lichtmikroskop und nehmen Sie die Fotos auf. Verwenden Sie die Image J-Software, um den Färbegrad quantitativ zu analysieren.
    8. Führen Sie eine Alizarinrot-Färbung durch (siehe Materialtabelle), um die Mineralisierungskapazität der Zellen zu bewerten.
      HINWEIS: Eine offensichtliche Mineralisierungsknotenbildung der differenzierten Zellen ist in der Regel nach 21 Tagen Induktion zu sehen.
    9. Verwenden Sie 1x PBS, um die Zellen zweimal schonend zu waschen. Fügen Sie dann 4% Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren.
    10. Die Zellen zweimal mit 1x PBS waschen, 0,1% Alizarinrot-Färbelösung zugeben (siehe Materialtabelle) und 20 min inkubieren. Auch hier werden die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen.
    11. Beobachten Sie unter einem Lichtmikroskop die roten Knötchen zwischen fixierten Zellen, die auf Kalziumablagerungen der osteogenen Differenzierung von kultivierten Zellen hinweisen, und machen Sie Fotos.
    12. Um die Menge an Alizarinrot zu quantifizieren, geben Sie 10% Cetylpyridiniumchlorid (CPC, siehe Materialtabelle) zu den mit Alizarinrot gefärbten Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    13. Aspirieren Sie 50 μl der CPC-Lösung und messen Sie die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 540 nm mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer.
  2. Führen Sie eine adipogene Differenzierungsinduktion durch.
    1. Aussaat der P3-Zellen in einer 6-Well-Platte nach dem oben beschriebenen Verfahren (Schritt 7.1).
    2. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, wechseln Sie das Kulturmedium in das adipogene Differenzierungsmedium A (Schritt 1.6).
    3. Inkubieren Sie die Zellen mit dem adipogenen Differenzierungsmedium A bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2 für 3 Tage.
    4. Wechseln Sie das Induktionsmedium auf das adipogene Differenzierungsmedium B (Schritt 1.7) und inkubieren Sie es 1 Tag lang.
    5. Wechseln Sie das Medium wieder auf das adipogene Differenzierungsmedium A und inkubieren Sie es 3 Tage lang. Ersetzen Sie dann 1 Tag lang durch Medium B. Wiederholen Sie diesen Zyklus 3-5 Mal, bis Lipidtröpfchen unter dem Mikroskop zu sehen sind.
      HINWEIS: Die Lipidtröpfchen sind etwa 21 Tage nach der Induktion zu sehen.
    6. Verwenden Sie das adipogene Differenzierungsmedium B, um die Zellen für weitere 7 Tage zu kultivieren; Dann sind große und runde Lipidtröpfchen unter dem Mikroskop zu sehen. Frischen Sie das Medium B alle 3 Tage auf.
    7. Entfernen Sie das Induktionsmedium und verwenden Sie 1x PBS, um die Zellen schonend zu waschen. Fügen Sie dann 4% Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren.
    8. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS; dann inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit ölroter O-Färbelösung (1 ml pro Vertiefung, siehe Materialtabelle). Auch hier werden die Zellen zweimal mit 1x PBS gewaschen.
    9. Legen Sie die Zellen unter ein Mikroskop und beobachten Sie die roten Lipidtröpfchen, um die Adipogenese differenzierter Zellen zu bewerten.
  3. Führen Sie eine chondrogene Differenzierungsinduktion durch.
    1. Verdauen Sie die P3-Zellen und überführen Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit einer Zellzahl von 5 x 105.
    2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 250 x g für 4 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie die obere Lösung vorsichtig dekantieren.
    3. Geben Sie 0,5 ml chondrogenes Differenzierungsmedium (Schritt 1.8) in das Röhrchen, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut bei 150 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
    4. Lösen Sie die Kappe des Zentrifugenröhrchens, um den Luftaustausch zu erleichtern. Legen Sie das Röhrchen in den Inkubator und induzieren Sie die Zellen mit 0,5 mL chondrogenem Differenzierungsmedium bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO2.
    5. Halten Sie das Zentrifugenröhrchen stabil, ohne es innerhalb von 24 oder 48 Stunden zu entfernen oder zu schütteln, bis die Zellen mit dem Pelletieren beginnen. Bewegen Sie den Boden des Zentrifugenröhrchens, um das Küvettenpellet im Differenzierungsmedium zu suspendieren (Schritt 1.5).
    6. Erneuern Sie das chondrogene Differenzierungsmedium alle 3 Tage mit einer Pipette. Vermeiden Sie es, das Zellpellet abzusaugen.
    7. Induzieren Sie die Zellen mindestens 21 Tage lang, bis das Pellet einen Durchmesser von 2 mm erreicht hat.
    8. Waschen Sie das Pellet mit 1x PBS und fixieren Sie es 30 min lang mit 4% Paraformaldehyd. Nach der Dehydratisierung und Paraffineinbettung13 wird das Pellet mit einer Dicke von 3 μm mit einem Mikrotom geschnitten (siehe Materialtabelle).
    9. Legen Sie die Abschnitte auf Glasobjektträger. Die Objektträger 1 h lang bei 37 °C mit Alcianblau-Lösung (siehe Materialtabelle) färben. Waschen Sie die fleckigen Dias mit Wasser. Legen Sie die Objektträger unter ein Lichtmikroskop und machen Sie Fotos von dem bläulich gefärbten sauren Mucopolysaccharid, das Knorpelgewebe anzeigt.

Ergebnisse

Dem Patienten wurde erfolgreich eine Unterkieferknochenprobe entnommen. Und die Zeit vom Schneiden mit der Ultraschall-Osteotomklinge bis zum Einsetzen des Knochenfragments in das Zentrifugenröhrchen beträgt ca. 5 Minuten. Keine der möglichen Komplikationen trat während und nach dem Resektionsverfahren auf, einschließlich Schädigung des Nervus alveolaris inferior oder der Zahnwurzel, Infektionen, Gefäßrisse und Blutungen, Schleimhautverletzungen, versehentliche Knochenbrüche usw. Die hmBMSCs wurden erfolgreich kultiviert, passageiert und ohne Kontamination differenziert.

In der vorliegenden Studie wurden viele anhaftende Zellen am dritten Tag nach der Erstkultur unter dem Mikroskop gesehen. Am siebten Tag waren die meisten der adhärenten Zellen bereits an der Kulturschale befestigt. Normalerweise erreichten die kultivierten Zellen nach 7-9 Tagen der Erstkultur eine Konfluenz von 70%-80%. Nach der Passage ging man in der Regel davon aus, dass es sich bei den P3-Zellen um gereinigte MSCs handelte, die eine spindelförmige, plastisch adhärente und fibroblastenähnliche Morphologie aufwiesen (Abbildung 2). Und die Identifizierungsexperimente wurden in P3- bis P5-Zellen durchgeführt. Zellproliferationsassay stieg die Wachstumsrate der Zellen ab dem dritten Tag der Kultur schnell an und verlangsamte sich am Tag 6 (Abbildung 2).

Nach der Definition der International Society for Cellular Therapy haben MSCs eine positive und negative Expression bestimmter Oberflächenmoleküle. In dieser Studie zeigte die durchflusszytometrische Analyse von Kulturzellen eine positive Expression von CD44, CD90 und eine negative Expression von CD45, CD34, was mit der Definition 4,11 übereinstimmt (Abbildung 3). In den Experimenten zur Differenzierungsfähigkeit mehrerer Linien zeigten die kultivierten Zellen eine starke osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierungsfähigkeit. Nach 7 Tagen osteogener Induktion zeigte sich unter dem Mikroskop die extrazelluläre Matrix-Calciumablagerung. Nach 21 Tagen osteogener Induktion zeigten die kultivierten Zellen deutliche Mineralisierungsknoten, und die Knoten wurden mit Alizarinrot-Färbung rot gefärbt (Abbildung 4). Für die Adipogenese wurden nach 21 Tagen adipogener Induktion viele akkumulierte runde Lipidtröpfchen, die durch Öl-Rot-O-Färbung rot gefärbt wurden, im Zytoplasma gesehen (Abbildung 4). Nach 21 Tagen chondrogener Differenzierungsinduktion können die Zellpellet-Objektträger, die knorpelartiges Gewebe mit Knorpellücke zeigen, blau gefärbt werden (Abbildung 4).

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Abbildung 1: Auswahl der Spenderstelle auf einem 3D-CT-Bild. (A) 3D-CT-Bild des Spenderunterkiefers einer 21-jährigen Patientin. (B) Chirurgische Simulation der bilateralen sagittalen Split-Ramus-Osteotomie des Unterkiefers. (C) Die Operationsplanung zeigt den Rückschlag eines gespaltenen Unterkiefers. (D) 3D-CT-Bild, das den kortikalen Knochen (den durchscheinenden Teil), den spongiösen Knochen, der reich an Knochenmark ist, und den Nervus alveolaris inferior (rot) zeigt, basierend auf unterschiedlichen CT-Werten, die den Chirurgen bei der Auswahl der Spenderstelle helfen und Nervenverletzungen vermeiden können. Spongiöse Knochenspäne wurden aus der Region im schwarzen Rechteck entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Mikroskopische Morphologie und Wachstumskurve von P3-Knochenmarkstammzellen aus dem menschlichen Unterkiefer (hmBMSCs). (A-C) Spindelförmige, plastisch adhärente und fibroblastenähnliche Morphologie von P3 hmBMSCs (Maßstabsbalken = 200 μm, 100 μm, 50 μm für A, B, C). (D) Die Zellwachstumskurve zeigte, dass die Wachstumsrate von hmBMSCs ab dem dritten Tag der Kultur rapide anstieg und sich die Anstiegsrate am sechsten Tag der Kultur verlangsamte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Die Expression von Zelloberflächenantigenen auf hmBMSCs wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass hmBMSCs negativ für CD45 (A) und CD44 (C), positiv für CD44 (B) und CD90 (D) waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierung von hmBMSCs. (A) ALP-Färbung von hmBMSCs nach 7-tägiger Kultivierung ohne osteogene Differenzierungsinduktion (Skalenbalken = 100 μm). (B) ALP-Färbung von hmBMSCs nach 7 Tagen osteogener Differenzierungsinduktion (Skalenbalken = 100 μm). (C) Quantitative Ergebnisse des positiven Bereichs der ALP-Färbung (***P < 0,001). (D) Alizarinrot-Färbung von hmBMSCs ohne osteogene Differenzierung (Skalenbalken = 100 μm). (E) Die Bildung von offensichtlichen Mineralisierungsknoten ist nach 21 Tagen osteogener Differenzierung von hmBMSCs zu sehen und kann mit Alizarinrot-Färbung rot gefärbt werden (Skalenbalken = 100 μm). (F) Quantitative Ergebnisse der Alizarinrotfärbung (***P < 0,001). (G) Ölrot-O-Färbung von hmBMSC ohne adipogene Differenzierung (Maßstabsbalken = 50 μm); (H) Nach 21 Tagen adipogener Differenzierung von hmBMSCs wurden runde Lipidtröpfchen beobachtet, und die Lipidtröpfchen wurden rot mit ölroter O-Färbung gefärbt (Skalenbalken = 50 μm). (I) Die Alcianblau-Färbung war nach 21 Tagen chondrogener Differenzierungsinduktion positiv (Skalenbalken = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

In jüngster Zeit hat sich die hMSCs-Therapie in zahlreichen klinischen Studien als vielversprechend bei der Geweberegeneration und der Behandlung vieler refraktärer Erkrankungen erwiesen, wie z. B. Immundysfunktionsstörungen, systemische hämatologische Erkrankungen, Krebs oder Traumata 1,14,15,16,17. Unter den verschiedenen Quellen für MSCs ist Knochenmark nach wie vor die am weitesten verbreitete und am leichtesten zugängliche Quelle. Wir verwendeten humane unterkieferspongiöse Knochenchips, um BMSCs erfolgreich unter Verwendung der im vorliegenden Protokoll beschriebenen Methode zur Adhärenz des gesamten Knochenmarks zu kultivieren. Bisher gibt es vier Hauptansätze zur Isolierung von Stammzellen aus Knochenmark, darunter die Adhärenzmethode des gesamten Knochenmarks, die Dichtegradientenzentrifugationsmethode, die Fluoreszenzzellsortiermethode und die magnetisch aktivierte Zellsortiermethode10. Die Methode der Adhärenz des gesamten Knochenmarks ist einfach, leicht zu bedienen, kostengünstig und kann große Mengen an adhärenten Zellen gewinnen. Die Einschränkung dieser Methode war jedoch die geringe Reinheit von primär kultivierten BMSCs, die mit hämatopoetischen Zellen und Fibroblasten gemischt wurden. Nach regelmäßiger Erneuerung des Kulturmediums der Primärzellen wurden die nicht adhärenten hämatopoetischen Zellen zusammen mit dem verworfenen Medium verworfen. Außerdem können die Fibroblasten durch Zellpassage beseitigt werden, und P3-Zellen waren hochreine BMSCs. P0- bis P2-Zellen können also nicht für die Zelltherapie verwendet werden, was bedeutet, dass zusätzliche Zeit für die Reinigung der Stammzellen benötigt wurde. Durch die Verwendung von Fluoreszenzzellsortierung und magnetisch aktivierten Zellsortiermethoden kann man mehr gereinigte BMSCCs erhalten, während die beiden Methoden teuer sind und eine lange Selektionszeit die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann11. Um zu beweisen, dass es sich bei den kultivierten Zellen um MSCs handelte, bezogen wir uns auf die Definition menschlicher MSCs, die vom Mesenchymal- und Gewebestammzellkomitee der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie vorgeschlagen wurde und die plastisch adhärenten Charakter, die positive und negative Expression bestimmter Phänotypen wie CD45, CD90 usw. und die Fähigkeit zur Differenzierung mehrerer Linien umfasste18.

In den meisten Studien waren die Femure und der Beckenkamm die Hauptquellen für BMSCs, verglichen mit den Kieferknochen wie dem Unterkiefer und dem Oberkiefer 9,16. Die ortsspezifische Merkmalstheorie von hBMSCs in neueren Studien zeigte jedoch, dass hBMSCs aus verschiedenen Knochen unterschiedliche Charaktere in Bezug auf Differenzierungsfähigkeit, proliferative Aktivität, Osteogenese und Immunität aufwiesen 6,8. Der ortsspezifische Unterschied kann mit unterschiedlichen embryologischen Ursprüngen, der Anpassung an funktionelle Anforderungen an jeder Skelettstelle, der Mikroumgebung, der lokalen Gefäßversorgung, hormonellen Effekten usw. zusammenhängen. Darüber hinaus zeigten Studien, dass transplantierter Beckenknochen innerhalb von 6 Monaten nach der Knochentransplantation einen schnelleren vertikalen Verlust aufwies als der Kieferknochen8. Ansonsten haben Studien ergeben, dass die proliferative Aktivität von MSCs aus dem Unterkiefermark der des Beckenmarks überlegen war 5,8,19,20. Und dieser proliferative Aktivitätsunterschied wurde auf die Merkmale zurückgeführt, dass der Unterkiefer eine höhere Blutversorgung und eine schnellere Knochenumsatzrate als das Darmbeinaufwies 5,6,8. Die Studien zeigten auch, dass BMSCs aus dem Unterkiefer einen höheren Spiegel an Runx-2 und OCN exprimierten als solche aus Femuren, und die osteogene Fähigkeit von BMSCs aus dem Unterkiefer war gleich oder höher als die aus Femur und Ilium 5,19,21. Die Adhärenz an der Titanfähigkeit von hmBMSCs wurde auch als stärker befunden als von BMSCs aus Femuren, was darauf hindeutet, dass hmBMSCs besser für den Einsatz in der oralen Implantologie geeignet sind5. Darüber hinaus ergab eine 3-jährige klinische Studie zur Rekonstruktion des Alveolardefekts, dass der regenerierte Knochen der MSCs aus der Zahnpulpa aus einem vollständig kompakten Knochen mit einer höheren Matrixdichte bestand, während die hm-BMSCs den schwammigen Knochen ähnlich der normalen menschlichen Alveolarknochenstruktur regenerierten22. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass hmBMSCs aufgrund des gleichen embryologischen Ursprungs und ihrer überlegenen Eigenschaften ideale therapeutische Stammzellen für die Kieferregeneration und andere Krankheiten sind.

Der Unterkiefer hat jedoch weniger Knochenmark als Femure und Darmbein, daher ist es wichtig, genügend Knochenmark und BMSCs aus dem Unterkiefer für den klinischen Einsatz zu gewinnen. Humane Beckenaspiraten können große Mengen an Knochenmark gewinnen, um MSCs zu isolieren. Die Forscher verwendeten die Unterkieferaspiraten auch zur Gewinnung von MSCs, während die anfängliche Ausbeute der MSCs aus Unterkieferaspiraten dreimal niedriger war als die von Beckenaspiraten21. Zusätzliche Schnitte waren erforderlich, um genügend Unterkiefermarkaspirate zu sammeln, was zu einem zusätzlichen chirurgischen Trauma führte. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass das proliferative Potenzial der MSCs aus Unterkieferknochenchips denen aus Unterkieferaspiraten überlegen sein könnte 8,21. Daher wurden in dieser Studie die verworfenen Unterkiefer-Spongiosa-Chips verwendet, um MSCs zu isolieren. Da beide Seiten des Unterkiefers in die sagittale Split-Ramus-Osteotomie oder die Unterkieferwinkelreduktionsplastik einbezogen wurden, können wir ohne zusätzlichen Schaden genügend Unterkiefermark von den Patienten erhalten. In jüngster Zeit ist die computergestützte Technologie in der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie weit verbreitet, um die chirurgische Wirkung zu verbessern und chirurgische Komplikationen zu reduzieren23. Um Verletzungen des Unterkiefers und des Nervs während der Knochenmarkentnahme des Unterkiefers zu vermeiden, wurde das 3D-CT-Bild des Unterkiefers des Spenders erstellt und die chirurgische Planung der Spender analysiert, um die Spenderstellen zu bestimmen und die chirurgische Simulation in der Studie zu implementieren. Somit trat keine der chirurgischen Komplikationen auf. Die Ultraschall-Osteotomklinge, eine gewebespezifische Vorrichtung, die es Chirurgen ermöglicht, präzise Osteotomien durchzuführen und gleichzeitig das benachbarte Weichgewebe24 zu schützen, wurde auch verwendet, um Weichteilverletzungen zu vermeiden und die erhaltene Knochenmarkaktivität zu erhalten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein zuverlässiges, einfaches, sicheres und kostengünstiges Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adäquater humaner Unterkiefer-MSCs beschreibt, die in Zelltherapien von Zahn- und Kiefergewebe eingesetzt werden können.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Studie wurde von der National Natural Sciences Foundation of China (Nr. 81903249) und dem Natural Science Basic Research Program der Provinz Shaanxi (Nr. 2019JQ-701, Nr. 2022JZ-50) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4% ParaformaldehydPlantChemMedPC-00005
Adipogenes DifferenzierungsmediumOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90031
Alcianblau-LösungOriCell, Cyagen BiosciencesALCB-10001
AlkoholMackline809056
Alizarinrot-FärbelösungSolarbioG1452
ALP-FärbelösungBeijing ComWin Biotech Co., Ltd.
AutoklavALP Co., Ltd., JapanCL-40L
CCK-8 LösungYeasen Biotech Co., Ltd.40203ES80
Küvettenfilter (70 μ m Porengröße)BD Biosciences352350
ZellinkubatorThermo Fisher Scientific41334177
ZentrifugeEppendorf5805ZP761456
Zentrifugenröhrchen (50 mL, 15 mL)Sangon BiotechF600888-9001
CetylpyridiniumchloridAladdinH108696
Chondrogenese DifferenzierungsmediumOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMX-90041
Reinbank/Laminar-Flow-SchrankBIOBASEBBS-DDS00030
Kulturschale (6 cm)Thermo150462
Kulturflaschen (25 cm)Thermo156367
Kulturplatten (96 Well, 6 Well)Corning-Costar352350
Sterile Einweghandschuhe und -maskenSangon BiotechF516018-9001; F516038-9001
Sterile Einwegspritze (1 mL)Shaanxi longkangxin Medical Instrument Co., Ltd1.00009E+11
Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium mit hohem Glukosegehalt (HG-DMEM)HycloneSH30022.01B
EDTASolarbioE8040-500g
Fötales Rinderserum (FBS)PlantChemMedPC-00001
DurchflusszytometerBeckman CoulterEPICS XL
Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierter monoklonaler Maus-Antikörper gegen CD34Biolegend343503
Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugierter monoklonaler Maus-Antikörper gegen CD44Biolegend338804
Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-konjugierter monoklonaler Maus-Antikörper gegen den Menschen gegen CD90Biolegend328108
HämozytometerKoraba30119480698
IceboxSangon BiotechF615002-0001
Image J SoftwareNational Institute of Mental Health
LichtmikroskopOLYMPUSIX71-2L20944
MikrozentrifugenröhrchenSangon BiotechF601620-0010
Mikrotiterplatten-SpektralphotometerBioTek-EPOCH259091
MikrotomFeica1003001
Mimics SoftwareMaterialise
Minimum essentielles Medium alpha (α-MEM)HycloneSH30265.01
Ölrot O FärbelösungSolarbioG1261
Osteogenes DifferenzierungsmediumOriCell, Cyagen BiosciencesHUXMA-90021
Penicillin und StreptomycinPlantChemMedPC-86115
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)PlantChemMedPC-00003
Phycoerythrin (PE)-konjugierter monoklonaler Anti-Human-Antikörper der Maus gegen CD45Biolegend304008
PipetteSORFA
ProPlan CMF 3.0Materialise
Schere, Pinzette und MesserShanghai Jinzhong Chirurgisches Instrument Co., LtdZJA030,YAA110,J11010
Sterile NassgazeHENAN PIAOAN GROUP Co., Ltd
TrypsinGibco17075029
Ultraschall-OsteotomklingeStryker InstrumentsTel.: 5450-815-107
CW0051S320511

Referenzen

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