Methodenartikel

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

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DOI:

10.3791/63816

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28. April 2022

 ,  , 
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Zusammenfassung

Proteinaceous fibrilläre Einschlüsse sind wichtige pathologische Kennzeichen mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen. In den frühen Stadien der Alzheimer-Krankheit (AD) bilden Amyloid-Beta-Peptide Protofibrillen im extrazellulären Raum, die als Samen fungieren, die allmählich wachsen und zu großen Amyloid-Plaques reifen. Trotz dieses grundlegenden Verständnisses ist das derzeitige Wissen über die Struktur, Zusammensetzung und Ablagerungsmuster von Amyloidfibrillen im Gehirn begrenzt. Eine Hauptbarriere war die Unfähigkeit, hochgereinigte Amyloidfibrillen aus Gehirnextrakten zu isolieren. Affinitätsreinigungs- und Lasereinfang-Mikrodissektions-basierte Ansätze wurden bisher zur Isolierung von Amyloiden verwendet, sind jedoch durch die geringe Menge an Material, die zurückgewonnen werden kann, begrenzt. Dieses neuartige, robuste Protokoll beschreibt die biochemische Reinigung von Amyloid-Plaquekernen unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat (SDS) -Solubilisierung mit Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und Ultraschall und liefert hochreine Fibrillen von AD-Patienten und AD-Modell-Hirngeweben. Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende proteomische Bottom-up-Proteomanalyse des gereinigten Materials stellt eine robuste Strategie zur Identifizierung fast aller primären Proteinkomponenten von Amyloidfibrillen dar. Frühere proteomische Studien von Proteinen in der Amyloidkorone haben eine unerwartet große und funktionell vielfältige Sammlung von Proteinen ergeben. Insbesondere wurde nach der Verfeinerung der Reinigungsstrategie die Anzahl der mitreinigenden Proteine um mehr als das 10-fache reduziert, was auf die hohe Reinheit des isolierten unlöslichen SDS-Materials hinweist. Negative Färbung und Immun-Gold-Elektronenmikroskopie ermöglichten die Bestätigung der Reinheit dieser Präparate. Weitere Studien sind erforderlich, um die räumlichen und biologischen Eigenschaften zu verstehen, die zur Ablagerung dieser Proteine in Amyloideinschlüsse beitragen. Zusammengenommen ist diese analytische Strategie gut positioniert, um das Verständnis der Amyloidbiologie zu verbessern.

Einleitung

Amyloid ist eine extrem stabile supramolekulare Anordnung, die in einer Vielzahl von Proteinen vorkommt, von denen einige zu pathologischen Veränderungen führen1. Die Akkumulation von intra- oder extrazellulären Amyloidaggregaten wird bei mehreren neurodegenerativen Erkrankungenbeobachtet 2. Amyloid-Aggregate sind heterogen und mit einer Vielzahl von Proteinen und Lipiden angereichert3. In den letzten Jahren hat das Interesse am Amyloid-Proteom bei grundlegenden und translationalen Neurowissenschaftlern ein erhebliches Interesse geweckt. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um Amyloidaggregate aus Maus- und postmortalem menschlichem Hirngewebe zu extrahieren und zu reinigen. Laser-Capture-Mikrodissektion, Immunpräzipitation, Dezellularisierung und biochemische Isolierung von Amyloid-Aggregaten sind weit verbreitete Methoden zur Extraktion und Reinigung von Amyloid-Plaques, Fibrillen und Oligomeren 4,5,6,7. Viele dieser Studien haben sich darauf konzentriert, die Proteinzusammensetzung dieser dicht gepackten fibrillären Ablagerungen unter Verwendung von semiquantitativer MS zu bestimmen. Die verfügbaren Ergebnisse sind jedoch inkonsistent, und die überraschend große Anzahl von Co-Cleanifying-Proteinen, die zuvor berichtet wurden, sind schwierig zu interpretieren.

Die primäre Einschränkung der bestehenden Literatur, die das Amyloidkernproteom in AD- und AD-Mausmodellgehirnen beschreibt, besteht darin, dass das gereinigte Material eine unüberschaubare Anzahl von mitreinigenden Proteinen enthält. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, diese Einschränkung zu überwinden und eine robuste biochemische Reinigung zur Isolierung von Amyloidfibrillenkernen zu entwickeln. Diese Strategie verwendet eine zuvor beschriebene auf Succharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende biochemische Methode zur Isolierung von SDS-unlöslichen angereicherten Amyloidfraktionen aus postmortalem AD-Hirngewebevon Menschen und Mäusen 8,9. Diese Methode baut auf der vorhandenen Literatur auf, geht aber mit Ultraschall und SDS-Waschungen weiter, um die meisten der lose gebundenen Amyloid-assoziierten Proteine zu entfernen, was zur Isolierung von hochgereinigten Amyloidfibrillen führt (Abbildung 1). Die durch dieses Protokoll gereinigten Fibrillen überwinden mehrere bestehende Herausforderungen, die häufig in Strukturstudien von Amyloidfibrillen auftreten, die aus Gehirnextrakten isoliert wurden. Die Visualisierung dieser Fibrillen mit der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt die Integrität und Reinheit des gereinigten Materials (Abbildung 2). In dieser Studie werden die isolierten Fibrillen mit Trypsin gelöst und zu Peptiden verdaut, und eine markierungsfreie MS-Analyse kann die Identität der Proteine, die den Fibrillenkern bilden, leicht aufdecken. Insbesondere haben einige dieser Proteine eine inhärente Tendenz, supramolekulare Anordnungen in nicht membrangebundenen Organellen zu bilden. Darüber hinaus sind viele der Proteine, die bei der Analyse von Amyloid-Beta (Aβ)-Fibrillen identifiziert wurden, auch mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert, was darauf hindeutet, dass diese Proteine eine Schlüsselrolle bei multiplen Proteinopathien spielen können.

Es ist unwahrscheinlich, dass diese SDS / Ultraschallmethode die Struktur der Fibrillenkerne verändert oder stört. Das gereinigte Material eignet sich auch für eine Vielzahl von Top-down- und Bottom-up-Proteomanalyseansätzen und zusätzlichen MS-basierten Strukturanalysestrategien, wie chemische Vernetzung oder Wasserstoff-Deuterium-Austausch. Die Gesamtausbeute mit dieser Methode ist relativ hoch und eignet sich daher für detaillierte Strukturuntersuchungen, die Mikrogramm bis Milligramm des gereinigten Materials erfordern. Das gereinigte Material eignet sich auch für Strukturuntersuchungen mittels KryoEM und Rasterkraftmikroskopie. Dieses Protokoll kann in Kombination mit der stabilen Isotopenmarkierung von Säugetieren Festkörper-Kernspinresonanzuntersuchungen (NMR) derAmyloidstruktur 10 erleichtern.

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Protokoll

Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von menschlichem oder wirbeltierischem Hirngewebe. Die gesamte Forschung wurde in Übereinstimmung mit den genehmigten institutionellen Richtlinien der Northwestern University durchgeführt. Der aktuelle Workflow wird mit APP-knock in (App NL-G-F/NL-G-F) Mouse brain cortikical und hippocampal brain region extracts11 standardisiert. Dieses Protokoll wurde für Gehirnextrakte von Mäusen im Alter von 6-9 Monaten optimiert und kann Amyloide sowohl von männlichen als auch von weiblichen Tieren effektiv reinigen.

HINWEIS: Ein besseres Verständnis des gesamten experimentellen Verfahrens finden Sie in Abbildung 1 für einen Schaltplan des Workflows.

1. Gewebeentnahme und Amyloidreinigung

HINWEIS: Idealerweise sollten Amyloidfibrillen aus frisch sezierten Hirnregionen isoliert werden. Diese Methode funktioniert jedoch auch gut mit schnapp- oder schockgefrorenem Hirngewebe. Im Folgenden finden Sie einen kurzen Überblick über das Einfrieren von Hirngewebe zum Aufbewahren zur späteren Verwendung.

  1. Gewinnung und Lagerung von Hirngewebe: Sezieren Sie Mäusegehirne und ernten Sie schnell die mit Amyloiden beladenen Regionen (d. H. Kortex und Hippocampus), gefolgt von einem Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder einem Trockeneisalkoholbad.
    HINWEIS: Das Einfrieren von Schnappschüssen hilft, die strukturellen Eigenschaften der Gewebebestandteile zu erhalten. Die Mäuse werden durch Isofluran und zervikale Dislokation eingeschläfert12,13. Es wird empfohlen, die Verwendung von CO2 zu vermeiden, da dies die Integrität des Gehirnproteoms beeinträchtigen kann.
  2. Nach der Dissektion schneiden und lagern Sie frisches Gewebe in kleinen Blöcken (z. B. 5 mm x 5 mm), da dies eine effizientere Homogenisierung vor der Amyloidextraktion ermöglicht. Übertragen Sie das Gewebe in die sterile kryogene Durchstechflasche, ziehen Sie ihre Kappe fest und tauchen Sie schnell ein.
  3. Halten Sie das Gewebe unter ultrakalten Bedingungen (d. h. -80 ° C oder flüssigem Stickstoff) gefroren. Wenn die Extraktion einige Tage später durchgeführt werden soll, lagern Sie das Gewebe bei -20 °C und vermeiden Sie Gefrier- und Tauzyklen. Tauen Sie das gefrorene Gewebe auf nassem Eis auf, wenn es zur Extraktion und Reinigung bereit ist.
    HINWEIS: Der direkte Kontakt der Gewebe mit flüssigem Stickstoff kann zu Gewebe- und Proteinschäden führen. Beachten Sie, dass ein Alkoholbad Permanentmarker von den Tubenetiketten entfernen kann.

2. Anreicherung von unlöslichem SDS-Material

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis und Zentrifuge bei 4 °C durch, sofern nicht anders angegeben. Einzelheiten zu allen Puffern und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendet werden, finden Sie in der Zusatzdatei 1. Hersteller und Katalognummern von Chemikalien und Instrumenten sind in der Materialtabelle angegeben.

  1. Beginnen Sie mit frisch sezierten oder schockgefrorenen Hirngeweberegionen (aufgetaut auf Eis), die in ein 2-ml-Röhrchen mit 6-8 Keramikperlen und frisch zubereitetem eiskaltem Homogenisierungspuffer (1 ml für 0,25-1 g nasse Gewebemasse) gegeben werden.
  2. Übertragen Sie die Rohre in den Homogenisator der Rührwerksmühle und mahlen Sie den Gewebeinhalt bei 4000 U / min mit zwei Zyklen von je 30 s und einem Abstand von 30 s dazwischen.
    HINWEIS: Alternativ können motorisierte Rührer- oder Homogenisatorsysteme verwendet werden, um das Gewebe zu mahlen und zu homogenisieren.
  3. Fügen Sie 9 ml eiskalten Homogenisierungspuffer zu dem 1 ml Gehirn-Ganzgewebehomogenat in 15 ml-Röhrchen hinzu, versiegeln Sie es mit Laborwachsfilmstreifen und drehen Sie es über Nacht bei 4 ° C, um eine robuste Solubilisierung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Um unerwünschte große Zelltrümmer und Lipide zu entfernen, drehen Sie am nächsten Morgen die Röhrchen bei 800 x g bei 4 ° C für 10 Minuten und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen. Das restliche Pellet in 2 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer resuspendieren, gut mischen, 10 min bei 4 °C erneut drehen und die beiden Überstände kombinieren.
  4. Langsam feste Saccharose in die Gewebeextraktsuspension bis zu einer Endkonzentration von 1,2 M geben, gut mischen und bei 250.000 x g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren.
  5. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Resuspendiert das Pellet in 2 ml Homogenisierungspuffer mit 1,9 m Saccharose durch Triturating, gefolgt von Zentrifugation bei 125.000 x g für 45 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Das Puffervolumen kann basierend auf der Menge des aus dem vorherigen Schritt zurückgewonnenen Materials angepasst werden. Im Allgemeinen sind 10 Volumina Homogenisierungspuffer (V/V) ideal für diesen Schritt.
  6. Sammeln Sie die oberste weiße feste Schicht mit einer Pipette, geben Sie sie in ein frisches Rohr und lösen Sie sie in 1 ml eiskaltem Waschpuffer, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen einzuführen.
  7. Neben der obersten Schicht ist das Pellet auch mit Amyloidfibrillen angereichert. Für eine höhere Ausbeute kombinieren Sie die beiden Fraktionen und fahren Sie fort. Entfernen Sie vorsichtig die mittlere wässrige Schicht mit einer Pipette und entsorgen Sie sie.
  8. Die kombinierten Fraktionen bei 8000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand.
  9. 1 ml eiskalten Aufschlusspuffer in das gewaschene Pellet geben, resuspendieren und bei Raumtemperatur (RT) für 3 h inkubieren.
  10. Bei 8000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
  11. Das verdaute Pellet zweimal in 1 ml eiskaltem Tris-Puffer aussetzen und waschen (wie in Schritt 2.8).
  12. Resuspendiert das gewaschene Pellet in 1 ml Lösungsmittelpuffer mit 1% SDS und 1,3 m Saccharose durch Pipettieren nach oben und unten. Zentrifugieren Sie schnell bei 200.000 x g für 60 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Obwohl die Amyloidfibrillen sehr resistent gegen Detergenzien und Denaturierungsmittel sind, können sehr lange Expositionen gegenüber dem Reinigungsmittel (1% SDS) die Integrität der Fibrillen beeinträchtigen oder die fest gebundenen Proteine entfernen, was nachfolgende Analysen beeinträchtigt. Fahren Sie daher unmittelbar nach der erneuten Aussetzung der Pellets mit der Zentrifugation fort.
  13. Speichern Sie das Pellet und erhöhen Sie das Volumen des verbleibenden Überstands, indem Sie 50 mM Tris-Puffer (im Verhältnis 1:0,3) hinzufügen, um die Saccharosekonzentration von 1,3 auf 1 M zu reduzieren, und zentrifugieren Sie es noch einmal bei 200.000 x g für 45 min bei 4 °C.
  14. Die beiden Pellets werden in 100 μL Tris-Puffer mit 0,5% SDS und Pool zur Amyloidreinigung gelöst. Sichtbare Pellets sind klein und sollten undurchsichtig und cremefarben erscheinen (siehe Abbildung 2A).

3. Amyloid-Reinigung

HINWEIS: Kombinieren Sie die beiden Pellets, lösen Sie sie durch Pipettieren, bis Sie eine gleichmäßige Lösung erhalten, und fahren Sie mit den folgenden Schritten der Amyloidreinigung fort.

  1. Zur vollständigen Solubilisierung des in Pellets vorhandenen amyloidreichen Materials wird das Rohr einer mechanischen Scherung unterzogen, die durch Ultraschallwellen in einem Badbeschallungsgerät erzeugt wird, das 30 s ON und 30 s OFF bei einer mittleren Frequenz für 20 Zyklen läuft.
  2. Zentrigrieren Sie das Material sofort bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μL 0,5% SDS Tris-Puffer.
  3. Wiederholen Sie Schritt 3.1. und Schritt 3.2. viermal für insgesamt fünf Wäschen. Die Anzahl der Waschungen kann erhöht werden, um die Reinheit zu verbessern.
    HINWEIS: Ultraschall- und Waschschritte werden bei 0,5% SDS optimiert, da höhere Konzentrationen die Struktur, Integrität oder Proteinzusammensetzung der Fibrillen beeinträchtigen können. Eine Erhöhung der SDS-Konzentration in diesem Schritt wird nicht empfohlen.
  4. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt waschen Sie das Pellet in 200 μL Reinstwasser und zentrifugieren Sie bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C, um das verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen. Das gewaschene Pellet mit gereinigten Amyloidfibrillen erscheint halbtransparent in der Farbe und ist manchmal schwer zu sehen.
  5. Das letzte Pellet mit gereinigten Amyloidfibrillen wird in 100 μL Reinstwasser gelöst. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt für die nachgelagerte Verarbeitung fort oder speichern Sie die Fibrillensuspension bei -20 °C zur weiteren Analyse. Wenn gefroren, tauen Sie auf Eis, bevor Sie mit dem Niederschlag beginnen.

4. Methanol-Chloroform-Fällung

HINWEIS: Wenn das Endziel darin besteht, eine Proteinanalyse durchzuführen, wird empfohlen, zusätzliche nicht proteinhaltige Verunreinigungen zu entsalzen und zu entfernen.

  1. Fügen Sie 400 μL Methanol zu den gereinigten 100 μL Amyloidfibrillen in einem 1,5-ml-Rohr und einer Wirbelvertiefung hinzu.
  2. Fügen Sie 100 μL Chloroform in die Röhre und Wirbelvertiefung hinzu.
  3. Fügen Sie 300 μL Reinstwasser hinzu und wirbeln Sie gründlich ein. Dadurch wird die Mischung durch Proteinausfällung trüb.
  4. Zentrifuge bei 12.000 x g für 2 min bei RT.
  5. Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Schicht (d. h. die Oberseite), ohne die Grenzflächenschicht zu stören, die die Proteinflocke enthält.
  6. Fügen Sie das gleiche Volumen Methanol erneut hinzu und zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 2 min bei RT.
  7. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und trocknen Sie das Pellet bei RT an der Luft. Die Amyloidfraktion ist bei Übertrocknung schwer wieder aufzulösen.

5. Trypsin-Verdauung

  1. Lösen Sie das Pellet in 50 μL Guanidinhydrochlorid (GuHCl) Puffer auf. In einem eiskalten Wasserbad beschallen und bei Bedarf 5 min bei 95 °C erhitzen.
  2. Vortex gründlich bei RT für 45 min bis 1 h, um es vollständig aufzulösen. Das Pellet ist nach diesem Schritt nicht mehr sichtbar und die Lösung sieht klar aus.
  3. Fügen Sie das gleiche Volumen von 0,2% Tensidlösung hinzu. Solubilisieren Sie bei RT mit Vortexing für 60 min. Dieser Schritt erhöht die enzymatische Aktivität von Trypsin.
  4. Fügen Sie 1 μL Tris-2-carboxyethylphosphin (TCEP) aus der 500 mM Stammlösung hinzu. 60 min inkubieren
  5. 2 μL 500 mM Iodacetamid (IAA) hinzufügen und 20 min im Dunkeln inkubieren.
  6. Abschrecken Sie die IAA mit 5 μL TCEP-Lösung für 15 min.
  7. Geben Sie das erforderliche Volumen von 50 mM Ammoniumbicarbonatlösung in das Röhrchen, um die Guanidinkonzentration auf 1,5 M zu reduzieren.
  8. 1%ige Tensidlösung in die Tube geben (1 μL/50 μg Protein).
  9. Trypsin (1 μg/100 μg Protein) zugeben und die Röhrchenmischung über Nacht bei 37 °C belassen.

6. Peptid-Reinigung

  1. Am nächsten Morgen die verdaute Peptidlösung ansäuern, indem Sie den pH-Wert durch Zugabe von Ameisensäure auf 2,0 senken.
  2. Aktivieren Sie die C18-Spinsäule (n-Octadecyl) in einem 2-ml-Empfängerröhrchen, indem Sie 200 μL 50% Methanollösung hinzufügen, und drehen Sie bei 1500 x g für 2 min bei RT. Wiederholen Sie den Aktivierungsschritt.
  3. Gleichen Sie die C18-Säulenharzbetten aus, indem Sie 200 μL Gleichgewichtspuffer hinzufügen und 2 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen drehen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
  4. Laden Sie die angesäuerte Peptidlösung auf die C18-Säule und zentrifugieren Sie sie bei 1500 x g für 2 min bei RT. Sammeln Sie den Durchfluss und laden Sie ihn noch einmal neu. Verwerfen Sie den zweiten Durchfluss.
  5. Waschen Sie die an das C18-Harz gebundenen Peptide mit dem Waschpuffer 2x, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Verwenden Sie den gleichen Gleichgewichtspuffer zum Waschen der Säule.
  6. Eluieren Sie die Peptide durch Zugabe von 40 μL Elutionspuffer, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1500 x g, für 2 min bei RT. Wiederholen Sie den Elutionsschritt dreimal, um die Ausbeute der gewonnenen Peptide zu erhöhen.
  7. Trocknen Sie die Peptide in einem Geschwindigkeits-Vakuumkonzentrator, indem Sie die wässrige Lösung verdampfen. Trockenpellets können vor der MS-Analyse einige Wochen bei -20 °C gelagert werden.

7. Aufbau eines Massenspektrometers für die Peptidanalyse

HINWEIS: Informationen zu MS-Parametern finden Sie in der Zusatzdatei 1 (angepasst an eine frühere Veröffentlichung aus dem Labor)14.

  1. Bevor Sie die Peptidproben für die MS-Analyse laden, lösen Sie die trockenen Peptidpellets in 20 μL Probenladepuffer auf und führen Sie Mikro-BCA durch, um die Konzentration der gewonnenen Peptide zu quantifizieren.
  2. Übertragen Sie die gelösten Peptide in einem Glasfläschchen und beladen Sie 3 μg (quantifiziert aus Mikro-BCA) von Peptiden in den UPLC-System-Autosampler.
  3. Laden Sie die Proben auf eine belüftete Fallensäule (C18 HPLC-Säule, 0,075 mm x 20 mm) mit einer Durchflussrate von 250 nL/min.
  4. Ordnen Sie die Fallensäule in einer Linie mit einer analytischen Säule (0,075 μm x 500 mm) an und montieren Sie eine Emitterspitze an der Elektrosprühionisationsquelle (ESI), die einer Sprühspannung von 2000 V ausgesetzt ist.
    HINWEIS: In dieser Studie wird ESI durchgeführt, bei dem die mobile Phase einer Hochspannungsionisation in die Gasphase unterzogen wird. Das dadurch erzeugte Spray wird durch eine beheizte Kapillare in die Vakuumkammer der MS geleitet. Unter Vakuum erfolgt die Entsolvation von Tröpfchen und der Ausstoß von Ionen in Gegenwart von Wärme und Spannung. Danach werden die Ionen in Gegenwart einer Hochspannungsumgebung in Richtung des Massenanalysators beschleunigt.
  5. Analysieren Sie die Proben mit 2 h Erfassungsläufen. Diese Studie wird unter Verwendung einer datenabhängigen Erfassung mit dem intensivsten Top-20-Vorläufer-Ionenauswahlparadigma durchgeführt.
    HINWEIS: Bei der datenabhängigen Erfassung wird eine begrenzte Anzahl von Vorläuferpeptiden im MS1-Scan nachgewiesen und für die MS2-Analyse einer Fragmentierung unterzogen. Der dynamische Ausschluss ist hier jedoch problematisch, da hochreichlich vorkommende Aβ-Peptide zur Fragmentierung weggelassen werden und zu einer Unterschätzung ihrer Menge führen.
  6. Zur absoluten Quantifizierung von Aβ-Peptiden führen Sie dieselben Proben noch einmal mit der anvisierten MS/MS-Methode durch. Für diese Studie wird eine erschöpfende Liste aller m/z-Verhältnisse für verschiedene mögliche tryptische Aβ-Peptide für die APP-Knock-in-Mausmodelle erstellt (siehe Ergänzende Tabelle 1). Andere Gruppen sollten eine ähnliche Liste in Übereinstimmung mit dem verfügbaren Mausmodell und den möglichen Peptiden, die aus dem interessierenden Protein erzeugt werden (z. B. Aβ für AD), erstellen.
    HINWEIS: Um den Ausschluss von hochreichlich vorhandenen Peptiden zu beheben, verwenden Sie einen gezielten Ansatz, indem Sie eine Liste ausgewählter m / z-Werte bereitstellen, die den tryptischen Peptiden von Aβ entsprechen. Dieser Ansatz adressiert das Problem des datenabhängigen Ausschlusses von Aβ-Peptiden und kann die absoluten Mengen verschiedener Monomere (Aβ38-, 40- und 42-Peptide) mit hoher Auflösung quantifizieren.
  7. Das Massenspektrometer erzeugt MS-Spektren der Peptidproben und speichert Rohdatendateien im Zielverzeichnis. Verwenden Sie diese Datei, um einen Spektralabgleich mit etablierten statistischen und bioinformatischen Werkzeugen durchzuführen. Es stehen mehrere Online- und Offline-Tools für die Datenbanksuche und -analyse zur Verfügung.

8. MS-Datenanalyse

  1. Extrahieren Sie die MS1- und MS2-Dateien mit dem Offline-Rawconverter-Tool (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. Führen Sie Identifikations-, Quantifizierungs- und detaillierte Analysen der Daten in einer webbasierten MS-Datensuchmaschine durch. In dieser Studie wurde Integrated Proteomics Pipeline - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/) verwendet.
    HINWEIS: Mehrere andere Online- und Offline-MS-Datenanalyse-Tools sind verfügbar und können ebenfalls verwendet werden, z. B. MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. Wählen Sie nach dem Hochladen der MS1- und MS2-Dateien eine aktualisierte Mausproteomdatenbank aus. Hier wird eine aktualisierte Mausdatenbank ausgewählt, die zusätzliche App-Knock-in-spezifische Mutationen für die Identifizierung von Peptiden mit den ProLuCId- und SEQUEST-Algorithmen11 enthält.
  4. Wählen Sie im IP2-Analysesystem die Standardparameter aus und ändern Sie sie entsprechend den experimentellen Anforderungen. In dieser Studie wird eine Peptidmassentoleranz von 50 ppm für Vorläufer und 600 ppm für Fragmente verwendet (siehe Ergänzende Datei 1 für andere Parameter, die in IP2 verwendet werden).
    HINWEIS: Forscher können die Suchparameter in Übereinstimmung mit den experimentellen Zielen ändern. Um beispielsweise posttranslationale Modifikationen zu identifizieren, fügen Sie differentielle Modifikationswerte für verschiedene PTMs hinzu (z. B. Ubiquitinierung, SUMOylierung, Phosphorylierung).

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Ergebnisse

Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Amyloidfibrillen unter Verwendung eines modifizierten Saccharosedichtegradienten-Ultrazentrifugationsreinigungsverfahrens zusammengefasst (siehe Abbildung 1). Die Innovation bei dieser Methode ist die Einbeziehung von Schritten des ultraschallbasierten Waschens mit einem Wasserbadbeschallungssystem, gefolgt von einer SDS-Solubilisierung, die viele lose assoziierte Proteine aus den Amyloidfibrillen entfernt, die mit den ho...

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Diskussion

Die Entwicklung eines klaren Verständnisses der Struktur und Zusammensetzung von Amyloiden ist für Strukturbiologen und Biochemiker aufgrund der biologischen Komplexität und der experimentellen Einschränkungen bei der Extraktion gereinigter Fibrillen aus AD-Hirngewebeneine Herausforderung 16,17. Amyloidfibrillen sind auf molekularer Ebene polymorph und zeigen eine heterogene Population unterschiedlicher Länge und Komplexität18,19

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01AG061865 an R.J.V. und J.N.S. unterstützt. Die Autoren danken Vassar und den Mitgliedern der Savas-Forschungsgruppe an der Northwestern University für ihre nachdenklichen Diskussionen. Wir danken auch herzlich Dr. s. Ansgar Seimer und Ralf Langen von der University of South California für ihren entscheidenden Input. Wir danken Dr. Farida Korabova für die Probenvorbereitung und die Bildgebung negativer Färbeelektronenmikroskopie am Northwestern University Center for Advanced Microscopy.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC-Säule 0,075 mm x 20 mm mmThermo Scientific164535Alternative Instrumente, Chemikalien und Antikörper anderer Hersteller können verwendet werden
AmmoniumbicarbonatSigma-Aldrich9830
Anti-Amyloid Beta (1-16) 6E10 AntikörperBiolegend803001
Anti-Amyloid Beta (17-24) 4G8 AntikörperBiolegend800701
Anti-Amyloid Beta (N terminus 82E1) AntikörperIBL America10323
Anti-Amyloidfibrillen LOC Antikörper  EMD MilliporeAB2287
BCA KitThermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
CalciumchloridSigma-Aldrich  C1016
KollagenaseSigma-AldrichC0130
Komplett  Protease-Inhibitor-CocktailSigma-Aldrich11697498001
Dnase IThermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
GuanidinhydrochloridSigma-AldrichG4505
HyperSep C18 KartuschenThermo Fisher Scientific60108-302
Integrierte Proteomik-Pipeline - IP2 http://www.integratedproteomics.com/
Iodacetamid (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 Gewebe-Homogenisierungssystem MotorCole ParmerGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
Micro BCA KitThermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 μ m x 50  cmThermo Scientific164942
Optima L-90K UltrazentrifugeBeckman CoulterBR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMassenspektrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin SäulenThermo Fisher Scientific89870
Precellys 24 GewebehomogenisatorBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Tensid Trypsin EnhancerPromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
NatriumazidVWR97064-646
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-Aldrich74255
Sorvall Legend Micro 21R MikrozentrifugeThermo Fisher Scientific
Speed VakuumkonzentratorLabconco7315021
Tris-2-carboxyethylphosphin (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
Trypsin Gold-Mass Spec GradePromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano SystemThermo Scientific
75002446ULTIM3000RSLCNANO

Referenzen

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
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