Summary
経口栄養と胸腔内注射感染を含むこの方法論は、アルボウイルス感染に対する中腸および/または唾液腺バリアの影響を効果的に評価することができました。
Abstract
脊椎動物の感染性病原体である蚊媒介性ウイルス(MBV)は、多くの蚊種によって広がり、公衆衛生に深刻な脅威をもたらしています。一度摂取されると、ウイルスは蚊の中腸関門を乗り越えて血リンパに到達しなければならず、そこから唾液腺に広がる可能性があります。蚊が刺されると、これらのウイルスは新しい脊椎動物の宿主に広がります。同様に、蚊は異なるウイルスを拾うかもしれません。一般に、腸 を介して 唾液腺に侵入する可能性のあるウイルスはごくわずかです。腺へのこれらのウイルスの伝達効率は、異なる蚊種に見られる2つの物理的障壁、すなわち中腸障壁および唾液腺障壁によって影響を受ける。このプロトコルは、経口栄養および胸腔内注射感染後の ネッタイシマカの唾液腺におけるウイルス検出の方法を提示します。さらに、腸および/または唾液腺がウイルスの拡散を妨げるかどうかを判断することは、 ネッタイシマカによって伝染するMBVのリスク評価に役立ちます。
Introduction
RNAウイルスの不均一なグループである蚊媒介性ウイルス(MBV)は、蚊媒介動物に存続し、その後脊椎動物の宿主に広がる可能性があります1。臨床的に重要なMBVは、主にフラビウイルス科、トガウイルス科、レオウイルス科、ペリブニャビダ科の4つのウイルスファミリーに分布しています2,3。ここ数十年で、これらのウイルスは世界中で報告されており、公衆衛生上の問題を引き起こしています。最もよく知られているMBVの1つとして、デング熱ウイルス(DENV)は、過去20年間で100か国以上で最も一般的な新興または再出現のアルボウイルスになりました4。内陸でのジカウイルス(ZIKV)の発見以来、大陸のほぼすべての熱帯および亜熱帯の国と地域がヒトZIKV感染を報告しています5。ウイルス感染のリスクを評価するために、近年の多くの研究は、これらのウイルスに対する蚊媒介物の能力に焦点を合わせている6,7。その結果、ベクター媒介性疾患を効果的に予防および制御することが重要です。
実験室で最も飼育しやすい蚊の1つであるネッタイシマカ(Ae. aegypti)は、DENV、ZIKV、チクングニアウイルス(CHIKV)、および黄熱病ウイルス(YFV)の重要なベクターです8。長い間、Ae. aegyptiはアフリカ大陸と東南アジアでのみ発見されていましたが、近年はほぼすべての大陸に定着しています9。さらに、エジプトの世界的な存在量は継続的に増加しており、世紀末までに推定20%増加しています10。中国では2004年から2009年にかけて、日々の気温の上昇により、DENVに対するAe.エジプトベクター能力が明らかに増加しました11。病原性ベクターとしてのAe. aegyptiの地位は、中国で著しく上昇している。したがって、これらの課題に対処するには、Ae. aegyptiのウイルスを感染させるベクター能力を調査する必要があります。
血食性節足動物として、雌の蚊は脊椎動物の宿主の皮膚を突き刺し、血液を食べます。蚊は、ウイルスに感染した宿主からウイルスを取得し、そのウイルスを新しい宿主に感染させることがあります。そのように、ベクター能力を決定するために、蚊は実験室設定12の給餌システムを通してアルボウイルスを含む人工血粉を給餌される。個々の蚊は、感染後数日で頭、体、唾液分泌物に分離されます。ウイルスの感染、播種、および感染率を測定するために、定量的逆転写PCR(qRT-PCR)またはプラークアッセイによってウイルス力価が検出されています。しかし、すべての蚊が中腸感染症を発症し、血液供給後に次の宿主にウイルスを感染させる能力を発症するわけではありません。それは、病原体が体内に侵入するのを防ぎ、自然免疫において重要な役割を果たす蚊の生理学的障壁と関連しています13。中腸バリア、特に中腸感染バリア(MIB)と中腸エスケープバリア(MEB)は、ウイルスがベクターに全身的に感染できるかどうか、およびベクターが広がる効率に影響を与えます。それは、唾液腺感染および脱出障壁を示す唾液腺などの他の組織の感染の分析を妨害する13,14。ベクターにおける中腸および唾液腺の感染をよりよく特徴付けるために、Ae. aegyptiにおけるアルボウイルスの経口摂食および胸腔内接種のための詳細なプロトコルを本明細書に提示する。このプロトコルは、ネッタイシマカ属のDENVおよびZIKV感染など、さまざまな蚊媒介動物における追加のアルボウイルス感染に適用される可能性があり、実行可能な手順であることが判明する可能性があります。
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Protocol
1.ウイルスと蚊の準備
- ウイルスの準備
注:すべてのプロセスは、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の実験室で実施されました。使用されるバイオセーフティーコンタメントのレベルは、病原体のリスク評価と国や地域に固有の規制によって決定されるべきです。このプロセスは、バイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。- 1 x 106 C6/36細胞をT75培養フラスコに接種します。フラスコに、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を含む10mLのロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地を満たします。
注:リーボビッツのL-15培地(L15)またはダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を使用して、C6 / 36細胞を維持することもできます。 - 細胞を28°Cで5%CO2 で一晩維持し、細胞が80%〜90%コンフルエントになった翌日に細胞上清を除去します。
- 1 mLのウイルス希釈液(感染多重度(MOI)= 0.01)をフラスコに加え、細胞を28°Cで5%CO2 中で1時間インキュベートします。 蚊が媒介するオルトブニャウイルスであるエビヌール湖ウイルス(EBIV)15は、このプロトコルのモデルウイルスとして使用されました。
- 上清を取り除き、5 mLのPBSで細胞を3回洗浄します。フラスコに2%FBSを含む15mLの新しいRPMI培地を充填します。フラスコを28°Cで5%CO2 に維持する。
- 必要なウイルス力価に達したら、ウイルスを含む上清を収集します(使用するウイルスによっては、ほぼ5日後)。EBIVの場合、この力価値は107 プラーク形成単位(PFU)/mLであった。それらを個々の2 mLスクリューキャップ保存チューブにサブパッケージし、0.5〜1 mLのウイルスを含むチューブを-80°Cで保管します。
- 1 x 106 C6/36細胞をT75培養フラスコに接種します。フラスコに、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)を含む10mLのロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地を満たします。
- ウイルス力価の測定
注:プラークアッセイ16を通じてウイルス力価を決定します。BHK-21は、感染細胞で観察された明らかな細胞変性効果(CPE)のために、EBIVのウイルス力価を決定するために使用されました。- 1 x 105 BHK-21細胞を24ウェルプレートの各ウェルに接種します。各ウェルに10%FBSおよび1%P/Sを含む1mLのDMEM培地を充填し、細胞を37°Cで5%CO2 で一晩維持します。
- 10%FBSおよび1%P/Sを含む新鮮なDMEM培地で、ウイルス含有上清を6回連続して10倍希釈します。
- 単層BHK-21を含む24ウェルプレートの各ウェルに100 μLのウイルス希釈液を追加します。37°Cで5%CO2 中で1時間インキュベートした後にウイルス希釈液を廃棄する。 1.5%メチルセルロースを含むDMEMを500 μLずつ各ウェルに加えます。
- 細胞を5%CO2 中で37°Cで48時間培養した(EBIVについては48時間後に見かけのCPEが見出された)。750 μLの3.7%ホルムアルデヒドで細胞を一晩固定します。
- 200 μLの2%クリスタルバイオレットで15分間染色します。プラークの数を数えて、ウイルス力価を計算します。
- 実験室での蚊の繁殖
注:節足動物の封じ込めレベル1(ACL-1)実験室での後部蚊。- 脱塩素水の準備のために、20リットルのバケツに水道水を入れ、それを光なしで7-8日間放置します。ふたを覆わないでください。
- Ae. aegyptiの卵と幼虫を次の条件で蚊帳に保管してください:28 ± 1°C、12時間の明暗サイクル、相対湿度75%±5%。
- 卵が孵化した後、脱塩素水を含む浅い皿(22 cm x 15 cm x 6 cm)に約1,000匹の幼虫を維持します。小さじ1/8杯近くのマウス飼料粉末でそれらを与えます。毎日食べ物をリフレッシュし、2日ごとに水を交換してください。
- 幼虫が5〜7日後に蛹になったら、1回限りのスポイトを使用して、脱塩素水で満たされたプラスチックカップ(7オンス)に蛹を移します。
- 1つのメッシュケージ(30cm×30cm×30cm)に蛹の入ったカップ5個(1カップあたり約200個)を入れ、手順1.3.2と同じ条件でケージを昆虫インキュベーターに入れます。
- 成虫の蚊に餌を与えるために、各メッシュケージに8%(m / w)グルコース溶液を含む小さなスポンジを置きます。成虫が出た後は、蛹なしでカップを取り出します。ケージあたり約1,000匹の成虫の蚊がいるメッシュケージを同じ昆虫インキュベーターに保管してください。
2.口腔感染症の準備
- 経口感染のために女性の蚊を準備します。蚊吸収機を使用して、5〜8日齢の蚊を収集します。-20°Cで1分間麻酔をかけ、蚊がめまいがしないかどうかを確認します。そうでない場合は、-20°Cでさらに1分間麻酔をかけます。
- カップあたり約24匹の蚊(雌と雄)でプラスチックカップ(200オンス)にすばやく注ぎます。よくカットされた蚊帳で各カップをすばやく覆い、次に中央に穴(直径約6 cm)のある蓋をします。
- 経口感染の前に24時間蚊を飢えさせ、次のように感染性の血液ミールを準備します。
- BSL-2条件下でバイオセーフティキャビネット内で、-80°Cの冷凍庫からウイルスストックを取り出し、氷上で解凍します。10%FBSおよび1%P/Sを含むRPMI 1640培地でウイルスストックを2 x 106 PFU/mLの濃度に希釈し、ウイルス希釈液を等量の除脂肪馬血液と混合します。
注:プロセスは、ACL-2ラボのバイオセーフティキャビネットで実行されました。
3.口腔感染を行う
注:すべての手順はACL-2ラボで実行されました。このプロセスは、蚊が逃げるのを防ぐためにグローブボックスで実行する必要があります。
- 人工蚊給餌システムを使用して1時間人工給餌を行います。
- コラーゲン膜を適切なサイズ(直径約5 cm)に切断し、Oリングでリザーバーに固定してから、ウイルスと血液の混合物(約3 mL)をリザーバーに追加します。プラスチック製のプラグを使用してリザーバーを密閉し、漏れを防ぎます。
注意: これらの手順は、バイオセーフティキャビネットで実行されました。 - 蚊が入ったプラスチック製のカップ(24オンス)をグローブボックスに入れます。密閉されたリザーバーをFU1フィーダーにねじ込み、1つのリザーバーを1つのカップに取り付けてから、パワーユニットの電源を入れます。蚊に1時間餌をやる
- コラーゲン膜を適切なサイズ(直径約5 cm)に切断し、Oリングでリザーバーに固定してから、ウイルスと血液の混合物(約3 mL)をリザーバーに追加します。プラスチック製のプラグを使用してリザーバーを密閉し、漏れを防ぎます。
- 蚊が失神するまで数秒間CO2 で蚊を麻酔する。簡単に言えば、二酸化炭素スプレーガンを蚊の入ったカップの穴を通してネットメッシュの中央に配置し、値を開き、大量の二酸化炭素を吐き出して蚊に麻酔をかけます。
- それらを氷の上に置いたペトリ皿に注ぎ、蓋を素早く覆います。鉗子で充血した雌の蚊を選びます。識別するために、男性は羽毛状のアンテナを持ち、女性はプレーンなアンテナを持っています。カップあたり50匹の雌の蚊で新しいプラスチックカップに移します。
注:充血した雌の蚊は、摂食量がウイルス含有量に影響を与えるため、一貫性を維持するために選択されました。 - カットした蚊帳メッシュでカップを包み、中央に穴の開いた蓋で覆います。スポンジを細かく切り、カップの上に置きます。
- プラスチック製の使い捨てスポイトを使用して、スポンジに8%グルコース溶液を追加します。雌の蚊が入ったカップをインキュベーター内の27°C、湿度80%で10日間保管します。72時間ごとに新しいグルコース飽和スポンジを交換します。
4.胸腔内接種の準備
- 以下のようにマイクロインジェクション針を準備します。PUL-1000を使用して、ニードルプラープログラムで次のパラメータを使用してマイクロインジェクションニードルを作成します(図1A):熱指数= 450、力(g)= 110、距離(mm)= 1.00、および遅延(s)= 0。
- 引っ張った針の先端をピンセットで16倍の倍率で解剖顕微鏡で切ります(図1B)。先端を大きくしすぎないでください、そうでなければそれは蚊に害を及ぼすことができます。
- ステップ2.1のように雌の蚊を準備します。
注:以下のプロセスは、ACL-2ラボで実行されました。 - 次のように感染性ウイルス希釈液を調製します。
- -80°Cの冷凍庫からウイルスストックを取り出し、氷上で解凍します。10%FBSおよび1%P / Sを含むRPMI 1640培地を使用して、100〜500 PFUウイルスを含む100 nLウイルス希釈液にウイルスを希釈します。
- 使い捨ての滅菌注射器を通して鉱油で針を埋め戻します。機械の指示に従って針をインジェクターに取り付けます。
- 感染性ウイルス希釈液の入ったチューブに針を挿入します。針の先端を折らないでください。 FILL ボタンを押して、針にウイルス溶液を入れます。針内のウイルス溶液の最終容量は約4.0μLです。針がウイルスで満たされたら、触れたり損傷したりしないように注意してください。
注:手順はバイオセーフティキャビネットで実行されました。
5.解剖顕微鏡下でウイルス注射を行う
注:すべての手順はACL-2ラボで実行されました。
- 蚊を-20°Cで1分間麻酔します。それらを氷の上に置いたペトリ皿に注ぎ、蓋を素早く覆います。
- ピンセットで50匹近くのメスの蚊を選び、氷板の上に置きます。アイスプレートをインジェクターの下に置き、解剖顕微鏡下で蚊の胸腔に針を挿入します(図1C)。
- 注入量を100 nL、レートを50 nL/sに設定します。 INJECT ボタンを押して、ウイルス溶液を蚊に流入させます。注射が成功すると、腹部はわずかに膨らみます。
- 感染した蚊を氷の上に置いた新しいプラスチックカップ(24オンス)に入れます。感染した蚊の数が十分になったら、カットした蚊帳メッシュでカップを包み、蓋で覆います。
- 感染性蚊の入ったカップをインキュベーター内の27°C、湿度80%で10日間保管します。ステップ3.5のように蚊に餌をやる。
6.感染した雌の蚊の処理
注:各雌の蚊から3つの異なる組織/臓器を解剖しました:ウイルス感染率(VIR)を計算するための腸、ウイルス拡散率(VDR)を計算するためのヘッド、およびウイルス感染率(VTR)を計算するための唾液。VIRは、ウイルス陽性の腸を持つ蚊の数として定義されました。VDRは、ウイルス陽性の頭を持つ蚊の数をウイルス陽性の腸を持つ蚊の数で100で割ったものとして定義されました。VTRは、ウイルス陽性の唾液を持つ蚊の数をウイルス陽性の腸を持つ蚊の数で割ったものとして定義されました。
- 感染した雌の蚊からの唾液の収集
注意: プロセスはACL-2ラボで実行する必要があります。- ステップ3.2のように二酸化炭素麻酔によって感染した雌の蚊を麻酔します。氷の上に置いたペトリ皿にそれらを注ぎ、蓋をすばやく閉じます。
- 液浸オイルで満たされた10 μLのピペットチップをゴム泥の上に並べて置きます。
- ピンセットで雌の蚊を選び、氷板の上に置きます。ピンセットで足と翼を取り外します。各ピペットチップに1匹の蚊の口の部分を置きます。
- 蚊によって油に分泌された唾液を室温で次の45〜60分間集めます。
- 200 μLのウイルス希釈培地(10%FBSおよび1%P/Sを含むRPMI 1640培地)を含む1.5 mLチューブにピペットチップを入れます。5,000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、唾液をチューブに排出します。これらのチューブは、その後の透過率の決定のために-80°Cで保管してください。
- 感染した雌の蚊を解剖する
注意: プロセスはACL-2ラボで実行する必要があります。- ピンセットを使用して、唾液採取後に雌の蚊の頭を切ります。各ヘッドを200 μLのRPMI 1640培地を含む個々のチューブに入れます。
- ピンセットで胸部をつかみ、次に別のピンセットで腹部の最後から2番目の部分をつかみ、引き出します。腸が引き抜かれます。引き抜かれた腸から浮遊組織や臓器を取り除きます。
- 腸をPBSで洗浄し、各腸を200μLのRPMI 1640培地を含む個々のチューブに入れます。これらのチューブを-80°Cで保管して、その後のウイルス感染率と播種率を測定します。
7.データ分析
- RNA抽出
- 次のパラメータに設定された低温組織ホモジナイザー研削盤で組織を細かく粉砕します:動作周波数= 60 Hz、動作時間= 15秒、一時停止時間= 10秒、サイクル= 2、および設定温度= 4.0°C。
- サンプルを12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 装置の指示に従って、自動核酸抽出システムによって各サンプルの全RNAを抽出します。
- qRT-PCRの実行
- ワンステップRT−PCRキットを使用して、定量的PCR装置17を用いてウイルスRNAコピーを定量する。EBIV SセグメントFの検出には、次のプライマーを使用してください:ATGGCATCACCTGGGAAAGおよびR:TTCCAATGGCAAGTGGATGAAA。反応プロセスを次のように設定します:ステージ1:42°Cで5分間、95°Cで10秒間。ステージ2:95°Cで5秒、60°Cで20秒の40サイクル。
- 細胞に接種された連続10倍希釈により、細胞内の感染の最低ウイルス投与量を決定します。BHK-21細胞を使用して、ステップ1.2で説明されているように10〜7 までの希釈を使用して、EBIVの最低ウイルス用量を決定します。
- qRT-PCRにより最低ウイルス投与量のCt値を計算します。qRT-PCRによるEBIV陽性のカットオフ値を<35として使用します。次の式を使用して、各サンプルのEBIVのコピーを計算します。
y = -4.0312x + 3.384 [x = log (EBIV のコピー), y = Ct 値, R2 = 0.9905] - 次のように、感染率、拡散率、感染率を計算します。
感染率(%)=100×(ウイルス陽性蚊の腸の数/蚊の総数)
播種率(%)=100×(ウイルス陽性蚊頭数/ウイルス陽性蚊の内臓数)
感染率(%)=100×(ウイルス陽性蚊の唾液数/ウイルス陽性蚊の腸数) - 多重比較のためのノンパラメトリックKruskal-Wallis分析と、必要に応じてFisherの正確確率検定を使用して、連続変数の違いと蚊の感染率、播種率、および伝播率の違いを分析します。
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Representative Results
人工血液栄養(ウイルスの最終力価は6.4 x 106 PFU/mL)および胸腔内注射(ウイルス量は340 PFU)による感染蚊のEBIV分布を調べるために、感染後10日(dpi)の蚊の唾液、頭部、腸中のウイルスRNAを測定しました。
Ae. aegyptiの場合、胸腔内接種された雌蚊の腸、頭部、唾液中のEBIVのウイルス力価は、口腔に感染した雌蚊よりもはるかに高かった(図2A-C)。胸腔内接種雌蚊の感染率は100%であったが、口腔内感染雌蚊の感染率は70%、播種率は38.1%であった(図2D、E)。胸腔内接種された雌蚊の感染率は最大90%に達したが、口腔に感染した雌蚊の感染率はわずか4.8%であった。それは、Ae. aegyptiの腸がウイルス感染に対して強い抑制効果を持っていることを示しました。
図1:マイクロピペットチップと胸腔内注射の概略図。 (A)チップを壊す前にマイクロピペットチップを引っ張った。(B)胸腔内接種に適したマイクロピペットチップを適切に調製する。(C)蚊の胸腔内注射の概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:経口摂食と胸腔内接種による成虫蚊のベクター能力。 感染した雌蚊を28°Cで10日間インキュベートした。0.05≤ p 値は統計的に有意であると考えられた。ノンパラメトリッククラスカル-ウォリス分析は、多重比較と必要に応じてフィッシャーの正確確率検定に使用されました。この図は、Xiaらによる研究から修正されています18。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法の目的は、経口栄養と胸腔内接種によるベクター能力を評価することにより、1つの蚊媒介性ウイルスの包括的なリスク評価を提供することでした。
経口摂食実験では、充血した蚊を摘み取って新しい容器に移す必要があり、オペレーターに深刻なリスクをもたらします。この理由は、感染していない蚊を含むすべての蚊が感染源である可能性があるためです19。したがって、プロトコルで指定されているように、最初に蚊を麻酔し、次にフォローアップ手順を実行する必要があります。充血した蚊を選択して移すことは、密封されたグローブボックス内で行うべきであることに注意することが重要です。箱の中に自由に動く蚊がいない限り、プロセス中はグローブボックスを閉じたままにしてください。
感染実験では、2人が協力し、2人が同時に逃げる蚊がないことを確認した後、グローブボックスを開けて感染した蚊が逃げるのを防ぐことができます。脱出が行われた場合、それらの蚊を殺すか、再捕獲する必要があります。感染した蚊を素手で殺すことはお勧めできません。オペレーターの感染リスクは、真空吸引器または他の適切なツール(鉗子、絵筆、手袋をはめた手など)を使用することで減らすことができます。実験後、グローブボックスの内側と作業台の表面を通常の消毒剤で消毒します。
蚊媒介性ウイルスに対する蚊媒介能に関する研究の大部分は、口腔感染にのみ焦点を当てています20,21。口腔感染症の場合、ウイルスは唾液に放出されるために中腸と唾液腺に関連するいくつかの組織障壁を克服する必要があります14。蚊の媒介能力に対する中腸腺と唾液腺の影響は、この実験では実証されませんでした。経口栄養と胸腔内注射を組み合わせると、さまざまな組織バリアを徹底的に評価できます。この手順の結果によると、Ae. aegyptiの腸はウイルスのベクター能力において支配的な役割を果たしており、唾液腺バリアは存在しない可能性があります(図2)。このため、私たちのプロトコルは、アルボウイルス感染に対する中腸または唾液腺の障壁の存在を確認するのに有益です。
方法論によれば、ウイルスRNAのみがサンプル中に同定された。さまざまなサンプル中の感染性ウイルスを確認するには、透過型電子顕微鏡でビリオンを見る、プラークアッセイを使用して感染を確認する、免疫蛍光アッセイでウイルスタンパク質を検出するなど、他の調査が必要です。この方法論は、広範囲の蚊媒介動物に関心のある追加のウイルスを接種するために修正および使用され得る。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、武漢科学技術計画プロジェクト(2018201261638501)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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