Summary
Denna metod, som inkluderade oral utfodring och intratorakal injektionsinfektion, kunde effektivt bedöma påverkan av midgut och / eller spottkörtelbarriärer på arbovirusinfektion.
Abstract
Myggburna virus (MBV), som är infektiösa patogener för ryggradsdjur, sprids av många myggarter och utgör ett allvarligt hot mot folkhälsan. När de väl har intagits måste virusen övervinna myggmidgutbarriären för att nå hemolymfen, varifrån de potentiellt kan spridas till spottkörtlarna. När en mygga biter sprids dessa virus till nya ryggradsdjurvärdar. På samma sätt kan myggan plocka upp olika virus. I allmänhet kan endast en liten del av virus komma in i spottkörtlarna via tarmen. Överföringseffektiviteten hos dessa virus till körtlarna påverkas av de två fysiska barriärerna som finns i olika myggarter: midgutbarriärer och spottkörtlar barriärer. Detta protokoll presenterar en metod för virusdetektion i spottkörtlar av Aedes aegyptis efter oral utfodring och intratorakal injektionsinfektion. Dessutom kan bestämning av om tarmarna och / eller spottkörtlarna hindrar viral spridning hjälpa till vid riskbedömningar av MBV som överförs av Aedes aegypti.
Introduction
Myggburna virus (MBV), en heterogen grupp av RNA-virus, kan kvarstå i myggvektorer och därefter spridas till ryggradsdjurvärdar 1. De kliniskt viktiga MBV:erna är huvudsakligen fördelade i fyra virusfamiljer, nämligen Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae och Peribunyavividae 2,3. Under de senaste decennierna har dessa virus rapporterats över hela världen och orsakat folkhälsoproblem. Som en av de mest kända MBV: erna har Dengue-virus (DENV) blivit det vanligaste framväxande eller återuppväxande arboviruset i över 100 länder under de senaste 20 åren4. Sedan upptäckten av Zika-virus (ZIKV) inåt landet har nästan alla tropiska och subtropiska länder och territorier på kontinenten rapporterat humana ZIKV-infektioner5. För att bedöma risken för virusöverföring har många studier de senaste åren fokuserat på myggvektorkompetens för dessa virus 6,7. Som ett resultat är det viktigt att effektivt förebygga och kontrollera vektorburna sjukdomar.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), en av de lättast uppfödda myggorna i laboratoriet, är en viktig vektor av DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) och gulfebervirus (YFV)8. Under lång tid hittades Ae. aegypti enbart på den afrikanska kontinenten och i Sydostasien, men de senaste åren har den koloniserat nästan alla kontinenter9. Dessutom har det globala överflödet av Ae. aegypti ökat kontinuerligt, med en uppskattad ökning med 20% i slutet av seklet10. Från 2004 till 2009 i Kina fanns det en tydlig ökning av Ae. aegypti vektorkompetens för DENV på grund av högre dagliga temperaturer11. Statusen för Ae. aegypti som den patogena vektorn har ökat avsevärt i Kina. För att ta itu med dessa utmaningar är det därför nödvändigt att undersöka vektorkompetensen hos Ae. aegypti att överföra virus.
Som en hematofagisk leddjur genomtränger den kvinnliga myggan huden hos en ryggradsdjur värd och matar på blodet. Myggor förvärvar ibland virus från virusinfekterade värdar och överför sedan virusen till en ny värd. Som sådan, för att bestämma vektorkompetens, matas myggor ett konstgjort blodmjöl innehållande arbovirus genom ett matningssystem i laboratorieinställningen12. Enskilda myggor separeras i huvuden, kroppar och salivsekretioner flera dagar efter infektion. För att mäta virusinfektion, spridning och överföringshastigheter har virustitrar detekterats genom kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT-PCR) eller plackanalys. Men inte alla myggor utvecklar midgutinfektioner och förmågan att överföra ett virus till nästa värd efter blodmatning. Det är kopplat till myggans fysiologiska barriärer, som hindrar patogener från att tränga in i kroppen och spelar en viktig roll i deras medfödda immunitet13. Midgutbarriärerna, särskilt midgut infection barrier (MIB) och midgut escape barrier (MEB), påverkar om viruset kan infektera vektorn systemiskt och effektiviteten med vilken den sprids. Det hindrar analysen av andra vävnaders infektion, såsom spottkörtlar som också uppvisar spottkörtelinfektion och undgår hinder13,14. För att bättre karakterisera infektionen av midguts och spottkörtlar i vektorn, presenteras ett detaljerat protokoll för oral utfodring och intratorakal inokulering av arbovirus i Ae. aegypti häri. Detta protokoll kan tillämpas på ytterligare arbovirusinfektioner i en mängd olika myggvektorer, såsom DENV- och ZIKV-infektion i Aedes spp., och kan visa sig vara ett praktiskt förfarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av virus och myggor
- Framställning av virus
OBS: Alla processer utfördes i ett biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) laboratorium. Nivån på biosäkerhetskontaminering som används bör bestämmas av patogenens riskbedömning och bestämmelser som är specifika för nationer och regioner. Processen måste utföras i ett biosäkerhetsskåp.- Inokulera 1 x 106 C6/36-celler i en T75-odlingskolv. Fyll kolven med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (P/S).
OBS: Leibovitz L-15-medium (L15) eller Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kan också användas för att underhålla C6/36-celler. - Håll cellerna i 5% CO2 vid 28 ° C över natten och ta bort cellsupernatanten nästa dag när cellerna är 80% -90% sammanflytande.
- Tillsätt 1 ml virusutspädning (Multiplicity of Infection (MOI) = 0,01) i kolven och inkubera cellerna i 1 timme i 5 %CO2 vid 28 °C. Ebinur Lake virus (EBIV)15, ett myggburet orthobunyavirus, användes som modellvirus för detta protokoll.
- Ta bort supernatanten och tvätta cellerna 3x med 5 ml PBS. Fyll kolven med 15 ml nytt RPMI-medium med 2% FBS. Håll kolven i 5 %CO2 vid 28 °C.
- Samla upp det supernatantinnehållande viruset när erforderlig virustiter har uppnåtts (efter nästan 5 dagar, beroende på vilket virus som används). För EBIV var detta titervärde 107 plackbildande enheter (PFU)/ml. Förpacka dem i individuella 2 ml förvaringsrör med skruvlock och förvara rören som innehåller 0,5-1 ml virus vid -80 °C.
- Inokulera 1 x 106 C6/36-celler i en T75-odlingskolv. Fyll kolven med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin (P/S).
- Bestämning av viral titer
OBS: Bestäm viral titer genom plackanalyserna16. BHK-21 användes för att bestämma viral titer av EBIV, på grund av den uppenbara cytopatiska effekten (CPE) observerad i infekterade celler.- Inokulera 1 x 105 BHK-21-celler i varje brunn med 24-brunnsplattor. Fyll varje brunn med 1 ml DMEM-medium innehållande 10% FBS och 1% P/S. Håll cellerna i 5% CO2 vid 37 °C över natten.
- Gör sex (10-6) på varandra följande 10-faldiga utspädningar av virusinnehållande supernatant med färskt DMEM-medium innehållande 10% FBS och 1% P/S.
- Tillsätt 100 μL virusspädningsvätska i varje brunn med 24 brunnsplattor innehållande monolagret BHK-21. Kassera virusspädningsmedlet efter inkubation i 1 timme i 5 %CO2 vid 37 °C. Tillsätt 500 μL DMEM innehållande 1,5% metylcellulosa till varje brunn.
- Odlingsceller i 5 %CO2 vid 37 °C i 48 timmar (skenbar CPE sågs efter 48 timmar för EBIV). Fixera cellerna över natten med 750 μL 3,7% formaldehyd.
- Färga dem med 200 μL 2% kristallviolett i 15 minuter. Räkna antalet plack för att beräkna virustitern.
- Mygguppfödning i labbet
OBS: Bakre myggor i ett laboratorium för arthropod containment level 1 (ACL-1).- För beredning av det deklorerade vattnet fyller du en 20 L hink med kranvatten och låter den stå i 7-8 dagar utan ljus. Täck inte över locket.
- Förvara ägg och larver av Ae. aegypti i ett myggrum med följande villkor: 28 ± 1 °C med en ljus/mörk cykel på 12 timmar och en relativ luftfuktighet på 75 % ± 5 %.
- Håll nästan 1 000 larver i en grund skål (22 cm x 15 cm x 6 cm) som innehåller deklorerat vatten efter att äggen kläckts. Mata dem med nästan 1/8 tesked möss foderpulver. Uppdatera maten dagligen och byt vatten var 2: e dag.
- När larverna förpuppas efter 5-7 dagar, använd en engångsdroppare för att överföra puppar till en plastkopp (7 oz) fylld med deklorerat vatten.
- Lägg fem koppar innehållande puppor (ca 200 per kopp) i en nätbur (30 cm x 30 cm x 30 cm) och håll burarna i insektsinkubatorn med samma förhållanden som i steg 1.3.2.
- Lägg en liten svamp som innehåller en 8% (m / w) glukoslösning på varje nätbur för att mata vuxna myggor. Efter vuxen uppkomst, ta ut kopparna utan puppar. Håll nätburarna med cirka 1 000 vuxna myggor per bur i samma insektsinkubator.
2. Förberedelse för oral infektion
- Förbered kvinnliga myggor för oral infektion. Använd myggabsorberande maskin för att samla 5-8 dagar gamla myggor. Bedöva dem vid -20 ° C i 1 min och kontrollera om myggorna är yr. Om inte, bedöva dem i ytterligare en minut vid -20 °C.
- Häll dem snabbt i plastkopparna (24 oz) vid cirka 200 myggor (kvinnliga och manliga) per kopp. Täck varje kopp snabbt med ett välklippt myggnät, följt av ett lock med ett hål (ca 6 cm i diameter) i mitten.
- Svälta myggorna i 24 timmar före den orala infektionen och förbered smittsam blodmåltid enligt följande.
- I ett biosäkerhetsskåp under BSL-2-förhållanden, ta ut viruslagret från frysen -80 °C och tina dem på is. Späd virusstammen till en koncentration på 2 x 106 PFU/ml med RPMI 1640-medium innehållande 10 % FBS och 1 % P/S. Blanda virusspädningen med en lika stor volym defibererat hästblod.
OBS: Processerna utfördes i ett biosäkerhetsskåp i ett ACL-2-laboratorium.
3. Utför oral infektion
OBS: Alla steg utfördes i ett ACL-2-laboratorium. Processen måste utföras i handskfacket för att förhindra att myggor flyr.
- Utför konstgjord utfodring genom att använda det konstgjorda myggmatningssystemet i 1 timme.
- Skär kollagenmembranen till lämplig storlek (ca 5 cm i diameter), säkra dem till behållarna med o-ringar och tillsätt sedan virus-blodblandningen (ca 3 ml) till behållarna. Använd plastproppar för att täta behållare och förhindra läckage.
OBS: Dessa steg utfördes i ett biosäkerhetsskåp. - Lägg plastkopparna (24 oz) som innehåller myggor i handskfacket. Skruva fast de förseglade behållarna på FU1-mataren och sätt en behållare på en kopp och slå sedan på strömenheten. Foder myggorna i 1 h
- Skär kollagenmembranen till lämplig storlek (ca 5 cm i diameter), säkra dem till behållarna med o-ringar och tillsätt sedan virus-blodblandningen (ca 3 ml) till behållarna. Använd plastproppar för att täta behållare och förhindra läckage.
- Bedövar myggor med CO2 i flera sekunder tills de svimmar. Kort sagt, placera koldioxidsprutpistolen i mitten av nätnätet genom hålet på koppen som innehåller myggor, öppna värdet och låt enorma mängder koldioxid sprutas ut för att bedöva myggor.
- Häll dem i en petriskål placerad på is och täck locket snabbt. Plocka ut de engorged kvinnliga myggorna med pincett. För att identifiera har män fjäderantenner och kvinnor har vanliga antenner. Överför dem till nya plastkoppar med 50 kvinnliga myggor per kopp.
OBS: De engorged kvinnliga myggorna plockades för att upprätthålla konsistens eftersom utfodringsmängden påverkar virusinnehållet. - Vik in koppen med ett skuret myggnät och täck det sedan med ett lock med ett hål i mitten. Skär svampen i en liten bit och lägg den på koppen.
- Tillsätt 8% glukoslösning på svampen med en engångsdroppare av plast. Förvara kopparna som innehåller kvinnliga myggor i inkubatorn vid 27 ° C vid 80% fuktighet i 10 dagar. Byt ut en ny glukosmättad svamp var 72: e timme.
4. Förberedelse för intratorakal inokulering
- Förbered mikroinjektionsnålarna enligt följande. Använd en PUL-1000 för att göra mikroinjektionsnålar (figur 1A) med följande parametrar i nåldragningsprogrammet: Värmeindex = 450, kraft (g) = 110, avstånd (mm) = 1,00 och fördröjning (s) = 0.
- Skär spetsen på en dragen nål med pincett under dissekeringsmikroskopet vid 16x förstoring (figur 1B). Gör inte spetsen för stor, annars kan det skada myggorna.
- Förbered kvinnliga myggor som i steg 2.1.
OBS: Följande processer utfördes i ett ACL-2-laboratorium. - Bered den infektiösa virusutspädningen enligt följande:
- Ta ut virusbuljongen från frysen -80 °C och tina dem på is. Späd viruset till en 100 nL virusutspädning innehållande 100-500 PFU-virus med RPMI 1640-medium innehållande 10% FBS och 1% P/S. Håll virusutspädningen på is.
- Återfyll nålen med mineralolja genom en steril engångsspruta. Sätt fast nålen i injektorn enligt anvisningarna på maskinen.
- För in nålen i ett rör som innehåller den infektiösa virusutspädningen. Bryt inte nålspetsen. Tryck på knappen FILL för att fylla nålen med viruslösning. Den slutliga volymen av viruslösningen i nålen är cirka 4,0 μl. När nålen är fylld med viruset, var försiktig så att du inte rör och skadar den.
OBS: Stegen utfördes i ett biosäkerhetsskåp.
5. Utför viral injektion under ett dissekerande mikroskop
OBS: Alla steg utfördes i ett ACL-2-laboratorium.
- Bedöva myggor vid -20 °C i 1 min. Häll dem i en petriskål placerad på is och täck locket snabbt.
- Plocka ut nästan 50 kvinnliga myggor med pincett och lägg dem på isplattan. Placera isplattan under injektorn och sätt in nålen i myggans brösthålighet under dissekeringsmikroskopet (figur 1C).
- Ställ in injektionsvolymen på 100 nL och hastigheten på 50 nL/s. Tryck på INJECT-knappen för att låta viruslösningen rinna in i myggan. Om framgångsrik injektion inträffar kommer buken att böja något.
- Sätt den infekterade myggan i en ny plastkopp (24 oz) placerad på is. När antalet infekterade myggor är tillräckligt, linda koppen med ett skuret myggnät och täck det sedan med locket.
- Håll koppen som innehåller smittsamma myggor i inkubatorn vid 27 ° C vid 80% fuktighet i 10 dagar. Mata myggorna som i steg 3.5.
6. Bearbetning av de infekterade kvinnliga myggorna
OBS: Tre olika vävnader / organ dissekerades från varje kvinnlig mygga: tarmen för beräkning av virusinfektionshastigheten (VIR), huvudet för beräkning av virusspridningshastigheten (VDR) och saliv för beräkning av virusöverföringshastigheten (VTR). VIR definierades som antalet myggor med viruspositiva tarmar. VDR definierades som antalet myggor med viruspositiva huvuden dividerat med antalet myggor med viruspositiva tarmar med 100. VTR definierades som antalet myggor med viruspositiv saliv dividerat med antalet myggor med viruspositiva tarmar med 100.
- Samling av saliv från de infekterade kvinnliga myggorna
OBS: Processerna måste utföras i ett ACL-2-laboratorium.- Bedöva de infekterade kvinnliga myggorna genom koldioxidbedövning som i steg 3.2. Häll dem i en petriskål placerad på is och stäng locket snabbt.
- Placera 10 μL pipettspetsar fyllda med nedsänkningsolja sida vid sida på gummislammet.
- Plocka ut kvinnliga myggor med pincett och lägg dem på en isplatta. Ta bort benen och vingarna med pincett. Placera munstycket på en mygga på varje pipettspets.
- Samla saliven som utsöndras i oljan av myggorna under de närmaste 45-60 minuterna vid rumstemperatur.
- Placera pipettspetsarna i 1,5 ml rör som innehåller 200 μL virusspädningsmedium (RPMI 1640-medium innehållande 10% FBS och 1% P/S). Centrifugera dem vid 5 000 x g i 5 minuter vid 4 °C för att driva ut saliv i rör. Förvara dessa rör vid -80 °C för efterföljande bestämning av överföringshastigheter.
- Dissekera de infekterade kvinnliga myggorna
OBS: Processerna måste utföras i ett ACL-2-laboratorium.- Använd pincett för att skära huvudet på kvinnliga myggor efter salivuppsamling. Placera varje huvud i ett enskilt rör som innehåller 200 μL RPMI 1640-medium.
- Ta tag i bröstkorgen med en pincett, sedan det näst sista segmentet av buken med en annan pincett och dra ut den. Tarmen kommer att dras ut. Rengör den utdragna tarmen från eventuell herrelös vävnad och organ.
- Tvätta tarmen med PBS och placera varje tarm i ett individuellt rör som innehåller 200 μL RPMI 1640-medium. Förvara dessa rör vid -80 °C för efterföljande bestämning av virusinfektionshastighet och spridningshastighet.
7. Analys av data
- RNA-extraktion
- Mal vävnaderna i bitar med en malmaskin för lågtemperaturmjukhomogenisator inställd på följande parametrar: driftsfrekvens = 60 Hz, driftstid = 15 s, paustid = 10 s, cykler = 2 och inställningstemperatur = 4,0 °C.
- Centrifugera proverna vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Extrahera totalt RNA för varje prov genom automatiserat nukleinsyraextraktionssystem enligt instrumentinstruktionerna.
- Utföra qRT-PCR
- Använd RT-PCR-satsen i ett steg för att kvantifiera virala RNA-kopior med hjälp av ett kvantitativt PCR-instrument17. Använd följande primers för detektion av EBIV S-segment F: ATGGCATCACCTGGGAAAG och R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Ställ in reaktionsprocessen som: steg 1: 42 °C i 5 minuter, 95 °C i 10 sekunder; Steg 2: 40 cykler på 95 °C i 5 s och 60 °C i 20 s.
- Bestäm den lägsta virusdosen för infektionen i cellerna genom de seriella 10-faldiga utspädningarna inokulerade på celler. Använd BHK-21-cellerna för att bestämma den lägsta virusdosen av EBIV, med spädningar till 10-7 som beskrivs i steg 1.2.
- Beräkna Ct-värdet för den lägsta virusdosen med qRT-PCR. Använd brytpunkten för EBIV-positiv med qRT-PCR som < 35. Använd följande ekvation för att beräkna kopiorna av EBIV i varje prov:
y = -4,0312x + 3,384 [x = logg (kopiorna av EBIV), y = Ct-värde, R2 = 0,9905] - Beräkna infektionshastighet, spridningshastighet och överföringshastighet enligt följande:
Infektionshastighet (%) = 100 x (antalet viruspositiva myggtarmar / antalet totala myggor)
Spridningsgrad (%) = 100 x (antalet viruspositiva mygghuvuden / antalet viruspositiva myggtarmar)
Överföringshastighet (%) = 100 x (antalet viruspositiva myggsaliv / antalet viruspositiva myggtarmar) - Analysera skillnaderna i kontinuerliga variabler och skillnader i mygginfektionshastigheter, spridningshastigheter och överföringshastigheter genom att använda den icke-parametriska Kruskal-Wallis-analysen för flera jämförelser och Fishers exakta test där det är lämpligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att undersöka EBIV-fördelningen i de infekterade myggorna via artificiell blodmatning (den virala slutliga titern var 6,4 x 106 PFU/ml) och intratorakal injektion (virusdosen var 340 PFU) bestämdes virala RNA i saliv, huvuden och myggtarmar 10 dagar efter infektion (dpi).
För Ae. aegypti var virustiter av EBIV i tarmar, huvuden och saliv hos de intratorakiskt inokulerade kvinnliga myggorna mycket högre än hos de oralt infekterade kvinnliga myggorna (figur 2A-C). Infektionshastighet och spridningshastighet för de intratorakalt inokulerade kvinnliga myggorna var 100%, men för de oralt infekterade kvinnliga myggorna var 70% respektive 38,1% (figur 2D, E). Överföringshastigheten för de intratorakiskt inokulerade kvinnliga myggorna nådde upp till 90%, men för de oralinfekterade kvinnliga myggorna var endast 4,8%. Det indikerade att tarmen av Ae. aegypti hade en stark hämmande effekt för virusöverföring.
Figur 1: Skiss över mikropipettspetsen och intratorakal injektion . (A) Dra mikropipettspetsen innan spetsen bryts. (B) Korrekt preparerad mikropipettspets lämplig för inokulering i bröstkorgen. (C) Schematisk bild av intratorakal injektion för myggorna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Vektorkompetens hos vuxna myggor genom oral utfodring och intratorakal inokulering. De infekterade honmyggorna inkuberades vid 28 °C i 10 dagar. P-värdet ≤ 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Den icke-parametriska Kruskal-Wallis-analysen användes för flera jämförelser och Fishers exakta test där så var lämpligt. Denna siffra har modifierats från studie av Xia et al.18. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denna metod var att tillhandahålla en omfattande riskbedömning av ett myggburet virus genom att utvärdera vektorkompetens genom oral utfodring och intratorakal inokulering.
I det orala utfodringsexperimentet måste engorged-myggor plockas ut och överföras till en ny behållare, vilket utgör en allvarlig risk för operatörerna. Anledningen till detta är att någon mygga, inklusive oinfekterade myggor, kan vara en källa till infektion19. Följaktligen måste myggor bedövas först, enligt vad som anges i protokollet, och sedan bör uppföljningsstegen utföras. Det är viktigt att notera att val av engorged myggor och överföring av dem ska utföras i en förseglad handskfack. Håll handskfacket stängt under processen om det inte finns några fritt rörliga myggor i lådan.
I infektionsexperimentet är det bättre för två individer att arbeta tillsammans, och efter att de två personerna bekräftat att det inte finns några undflyende myggor samtidigt kan de öppna handskfacket för att förhindra att infekterade myggor flyr. Om en flykt äger rum måste dessa myggor dödas eller återfångas. Det rekommenderas inte att döda smittade myggor med bara händer. Operatörernas infektionsrisk kan minskas genom att använda vakuumsugare eller andra lämpliga verktyg (t.ex. pincett, penslar, handskar). Efter experimentet, desinficera insidan av handskfacket och arbetsbänkens yta med ett konventionellt desinfektionsmedel.
Majoriteten av forskningen om myggvektorkompetens för myggburna virus har enbart fokuserat på oral infektion20,21. För oral infektion måste virus övervinna flera vävnadsbarriärer associerade med midgut och spottkörtlar för att släppas ut i saliv14. Effekten av midgutkörtel och spottkörtel på myggvektorkapacitet visades inte i detta experiment. När oral matning och intratorakal injektion kombineras kan de olika vävnadsbarriärerna utvärderas noggrant. Enligt resultaten av denna procedur spelar tarmen av Ae. aegypti en dominerande roll i vektorkompetensen för viruset och spottkörtelbarriären kanske inte är närvarande (figur 2). För detta är vårt protokoll fördelaktigt för att bekräfta förekomsten av midgut eller spottkörtelbarriärer mot arbovirusinfektion.
Enligt metoden identifierades endast viralt RNA i proverna. Andra undersökningar, såsom att se virionen med ett transmissionselektronmikroskop, bekräfta infektionen med hjälp av plackanalyser eller detektera viralt protein med en immunofluorescensanalys, krävs för att bekräfta de infektiösa virusen i de olika proverna. Denna metod kan modifieras och användas för att inokulera ytterligare virus av intresse i ett brett spektrum av myggvektorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al.
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
