Summary
경구 수유 및 흉강내 주사 감염을 포함하는 이 방법론은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 및/또는 침샘 장벽의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다.
Abstract
척추동물에 대한 감염성 병원체인 모기 매개 바이러스(MBV)는 많은 모기 종에 의해 전파되어 공중 보건에 심각한 위협이 됩니다. 일단 섭취되면 바이러스는 모기 중장 장벽을 극복하여 체액림프에 도달해야 하며, 그곳에서 잠재적으로 침샘으로 퍼질 수 있습니다. 모기에 물리면 이 바이러스는 새로운 척추동물 숙주에게 퍼집니다. 마찬가지로 모기는 다른 바이러스를 집어 올릴 수 있습니다. 일반적으로 바이러스의 아주 작은 부분만이 장을 통해 침샘으로 들어갈 수 있습니다. 땀샘으로의 이러한 바이러스의 전염 효율은 다른 모기 종에서 발견되는 두 가지 물리적 장벽, 즉 중장 장벽과 침샘 장벽의 영향을 받습니다. 이 프로토콜은 이집트숲모기의 경구 수유 및 흉강내 주사 감염 후 타액선에서 바이러스 검출 방법을 제시합니다. 또한, 내장 및/또는 침샘이 바이러스 확산을 방해하는지 여부를 결정하면 이집트숲모기에 의해 전염되는 MBV의 위험 평가에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
모기 매개 바이러스(Mosquito-borne virus, MBVs)는 이질적인 RNA 바이러스 그룹으로, 모기 매개체에서 잔류하다가 척추동물 숙주로 퍼질 수 있다1. 임상적으로 중요한 MBV는 주로 Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae 및 Peribunyavividae 2,3의 4가지 바이러스 계열에 분포합니다. 최근 수십 년 동안 이러한 바이러스는 전 세계적으로 보고되어 공중 보건 문제를 일으켰습니다. 가장 잘 알려진 MBV 중 하나인 뎅기열 바이러스(DENV)는 지난 20년 동안 100개 이상의 국가에서 가장 널리 퍼진 신종 또는 재출현 아르보 바이러스가 되었습니다4. 내륙에서 지카 바이러스(Zika virus, ZIKV)가 발견된 이후, 아프리카 대륙의 거의 모든 열대 및 아열대 국가와 영토에서 인간 ZIKV 감염이 보고되었다5. 바이러스 전파 위험을 평가하기 위해 최근 몇 년 동안 많은 연구가 이러한 바이러스에 대한 모기 벡터 능력에 초점을 맞추었습니다 6,7. 따라서 매개체 매개 질병을 효과적으로 예방하고 통제하는 것이 중요합니다.
이집트숲모기(Ae. aegypti)는 실험실에서 가장 쉽게 사육되는 모기 중 하나로, DENV, ZIKV, 치쿤구니야 바이러스(CHIKV) 및 황열병 바이러스(YFV)의 중요한 매개체입니다8. 오랫동안 Ae. aegypti는 아프리카 대륙과 동남아시아에서만 발견되었지만 최근 몇 년 동안 거의 모든 대륙을 식민지화했습니다9. 또한, Ae. 이집트는 지속적으로 성장하고 있으며, 10 세기 말까지20 % 증가 할 것으로 예상됩니다. 2004년부터 2009년까지 중국에서는 Ae가 뚜렷하게 증가했습니다. 더 높은 일일 온도로 인한 DENV에 대한 이집트 벡터 역량11. 병원성 매개체로서의 이집트의 지위는 중국에서 크게 상승했다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해서는 Ae의 벡터 능력을 조사할 필요가 있습니다. 이집트는 바이러스를 전염시킵니다.
haematophagous 절지 동물로서, 암컷 모기는 척추 동물 숙주의 피부를 관통하고 혈액을 먹습니다. 모기는 때때로 바이러스에 감염된 숙주로부터 바이러스를 얻은 다음 바이러스를 새로운 숙주로 옮깁니다. 이와 같이, 벡터 능력을 결정하기 위해, 모기는 실험실 설정12에서 공급 시스템을 통해 아르보 바이러스를 함유하는 인공 혈액 식사를 공급받는다. 개별 모기는 감염 후 며칠 후에 머리, 몸통, 타액 분비물로 분리됩니다. 바이러스 감염, 전파 및 전파 속도를 측정하기 위해 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR) 또는 플라크 분석을 통해 바이러스 역가를 검출했습니다. 그러나 모든 모기가 중장 감염을 일으키는 것은 아니며 혈액 공급 후 다음 숙주에게 바이러스를 옮길 수 있는 능력이 있습니다. 이는 모기의 생리적 장벽과 관련이 있어 병원체가 체내로 침투하는 것을 방지하고 모기의 선천성 면역에 중요한 역할을 한다13. 중장 장벽, 특히 중장 감염 장벽(MIB) 및 중장 탈출 장벽(MEB)은 바이러스가 벡터를 전신적으로 감염시킬 수 있는지 여부와 확산 효율성에 영향을 미칩니다. 그것은 또한 침샘 감염을 나타내고 장벽을 탈출하는 타액선과 같은 다른 조직의 감염 분석을 방해합니다13,14. 벡터에서 중장 및 침샘의 감염을 더 잘 특성화하기 위해, Ae에서 아르보바이러스의 경구 수유 및 흉강내 접종을 위한 상세한 프로토콜. 이집트가 본원에 제시되어 있다. 이 프로토콜은 Aedes spp.의 DENV 및 ZIKV 감염과 같은 다양한 모기 매개체의 추가 아르보 바이러스 감염에 적용될 수 있으며 실행 가능한 절차로 판명될 수 있습니다.
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Protocol
1. 바이러스 및 모기의 준비
- 바이러스의 준비
참고: 모든 공정은 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행되었습니다. 사용되는 생물 안전성 관리 수준은 병원체의 위험 평가 및 국가 및 지역에 특정한 규정에 따라 결정되어야 합니다. 이 과정은 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.- 1 x 106 C6/36 세포를 T75 배양 플라스크에 접종합니다. 10% 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 포함된 1640 배지 10mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1를 플라스크에 채웁니다.
참고: Leibovitz의 L-15 배지(L15) 또는 Dulbecco의 변형 Eagle's 배지(DMEM)도 C6/36 세포를 유지하는 데 사용할 수 있습니다. - 세포를 28°C에서 5%CO2 로 밤새 유지하고, 다음날 세포가 80%-90% 합류할 때 세포 상청액을 제거한다.
- 플라스크에 바이러스 희석액(Multiplicity of Infection(MOI) = 0.01) 1mL를 넣고 28°C에서 5%CO2 에서 1시간 동안 세포를 배양합니다. 모기 매개 오르토부냐바이러스인 에비누르 호수 바이러스(EBIV)15가 이 프로토콜의 모델 바이러스로 사용되었습니다.
- 상층액을 제거하고 5mL의 PBS로 세포를 3배 세척합니다. 플라스크에 2% FBS가 포함된 15mL의 새 RPMI 배지를 채웁니다. 플라스크를 28°C에서 5%CO2 로 유지한다.
- 필요한 바이러스 역가에 도달하면 바이러스가 포함된 상청액을 수집합니다(사용된 바이러스에 따라 거의 5일 후). EBIV의 경우 이 역가 값은 107 플라크 형성 단위(PFU)/mL였습니다. 개별 2mL 스크류 캡 보관 튜브에 하위 포장하고 0.5-1mL의 바이러스가 들어 있는 튜브를 -80°C에서 보관합니다.
- 1 x 106 C6/36 세포를 T75 배양 플라스크에 접종합니다. 10% 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 포함된 1640 배지 10mL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1를 플라스크에 채웁니다.
- 바이러스 역가의 결정
참고: 플라크 분석16을 통해 바이러스 역가를 결정합니다. BHK-21은 감염된 세포에서 관찰된 명백한 세포변성 효과(CPE)로 인해 EBIV의 바이러스 역가를 측정하는 데 사용되었습니다.- 1 x 105 BHK-21 세포를 24웰 플레이트의 각 웰에 접종합니다. 각 웰을 10% FBS 및 1% P/S를 함유하는 1mL의 DMEM 배지로 채우고, 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 5%CO2 로 유지한다.
- 10% FBS 및 1% P/S를 포함하는 새로운 DMEM 배지를 사용하여 바이러스 함유 상층액을 6배 연속 10배 희석합니다.
- 단층 BHK-21이 들어 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 바이러스 희석제를 추가합니다. 37°C에서 5%CO2 에서 1시간 동안 배양한 후 바이러스 희석제를 버린다. 1.5% 메틸셀룰로스를 함유하는 DMEM 500μL를 각 웰에 추가합니다.
- 세포를 37°C에서 5%CO2 중에서 48시간 동안 배양하였다(명백한 CPE는 EBIV에 대해 48시간 후에 발견되었다). 750 μL의 3.7 % 포름 알데히드로 밤새 세포를 고정하십시오.
- 200μL의 2% 크리스탈 바이올렛으로 15분 동안 염색합니다. 바이러스 역가를 계산하기 위해 플라크의 수를 세십시오.
- 실험실에서 모기 번식
참고: 절지동물 격리 등급 1(ACL-1) 실험실의 후방 모기.- 탈염수를 준비하려면 20L 양동이에 수돗물을 채우고 빛없이 7-8 일 동안 그대로 두십시오. 뚜껑을 덮지 마십시오.
- Ae의 알과 애벌레를 보관하십시오 . 이집트는 다음과 같은 조건의 모기 방에서 이집트를 사육합니다 : 28 ± 1 ° C, 12 시간의 명암 주기, 상대 습도 75 % ± 5 %.
- 알이 부화한 후 탈염소수가 들어 있는 얕은 접시(22cm x 15cm x 6cm)에 거의 1,000마리의 유충을 유지하십시오. 거의 1/8 티스푼의 생쥐 사료 분말을 먹이십시오. 매일 음식을 새로 고치고 2 일마다 물을 바꿔줍니다.
- 유충이 5-7일 후에 번데기를 낳으면 일회용 스포이드를 사용하여 번데기를 탈염소 처리된 물로 채워진 플라스틱 컵(7oz)으로 옮깁니다.
- 번데기가 들어있는 5 컵 (컵 당 약 200 개)을 하나의 메쉬 케이지 (30cm x 30cm x 30cm)에 넣고 1.3.2 단계와 동일한 조건으로 곤충 인큐베이터에 케이지를 보관하십시오.
- 8%(m/w) 포도당 용액이 들어 있는 작은 스폰지를 각 메쉬 케이지에 넣어 성충 모기에게 먹이를 줍니다. 성인이 출현 한 후 번데기없이 컵을 꺼내십시오. 동일한 곤충 인큐베이터에서 케이지 당 약 1,000 마리의 성인 모기가있는 메쉬 케이지를 보관하십시오.
2. 구강 감염 대비
- 구강 감염을 위해 암컷 모기를 준비하십시오. 모기 흡수기를 사용하여 5-8 일 된 모기를 수집하십시오. -20°C에서 1분 동안 마취시키고 모기가 어지러운지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 -20°C에서 1분 더 마취합니다.
- 컵당 약 24마리의 모기(암컷과 수컷)로 플라스틱 컵(200oz)에 빠르게 붓습니다. 잘 자른 모기장으로 각 컵을 빠르게 덮은 다음 중간에 구멍 (직경 약 6cm)이있는 뚜껑을 덮습니다.
- 구강 감염 전 24 시간 동안 모기를 굶어 죽이고 다음과 같이 전염성 혈액 식사를 준비하십시오.
- BSL-2 조건의 생물 안전 캐비닛에서 -80°C 냉동고에서 바이러스 스톡을 꺼내 얼음에서 해동합니다. 10% FBS 및 1% P/S를 포함하는 RPMI 1640 배지를 사용하여 바이러스 스톡을 2 x 106 PFU/mL의 농도로 희석합니다.
참고: 이 과정은 ACL-2 실험실의 생물 안전 캐비닛에서 수행되었습니다.
3. 구강 감염 수행
참고: 모든 단계는 ACL-2 실험실에서 수행되었습니다. 이 과정은 모기가 빠져 나가는 것을 방지하기 위해 글로브 박스에서 수행해야합니다.
- 인공 모기 먹이 시스템을 사용하여 1 시간 동안 인공 먹이를 수행하십시오.
- 콜라겐 멤브레인을 적절한 크기(직경 약 5cm)로 자르고 O-링으로 저장소에 고정한 다음 바이러스-혈액 혼합물(약 3mL)을 저장소에 추가합니다. 플라스틱 플러그를 사용하여 저장소를 밀봉하고 누출을 방지하십시오.
참고: 이 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행되었습니다. - 모기가 들어 있는 플라스틱 컵(24oz)을 글러브 박스에 넣습니다. 밀봉된 물통을 FU1 피더에 나사로 고정하고 하나의 물통을 한 컵에 담은 다음 전원 장치를 켭니다. 모기에게 1 시간 동안 먹이를주십시오.
- 콜라겐 멤브레인을 적절한 크기(직경 약 5cm)로 자르고 O-링으로 저장소에 고정한 다음 바이러스-혈액 혼합물(약 3mL)을 저장소에 추가합니다. 플라스틱 플러그를 사용하여 저장소를 밀봉하고 누출을 방지하십시오.
- 모기가 기절할 때까지 몇 초 동안 CO2 로 모기를 마취합니다. 간단히 말해서, 모기가 들어있는 컵의 구멍을 통해 그물 메쉬 중앙에 이산화탄소 스프레이 건을 놓고 값을 열고 모기를 마취시키기 위해 엄청난 양의 이산화탄소를 분출합니다.
- 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 빨리 덮으십시오. 집게로 충혈 된 암컷 모기를 골라냅니다. 식별하기 위해 수컷은 깃털 더듬이를 가지고 있고 암컷은 일반 더듬이를 가지고 있습니다. 컵 당 50 마리의 암컷 모기로 새 플라스틱 컵에 옮깁니다.
참고: 충혈된 암컷 모기는 먹이의 양이 바이러스 함량에 영향을 미치기 때문에 일관성을 유지하기 위해 선택되었습니다. - 자른 모기장 메쉬로 컵을 감싼 다음 중간에 구멍이있는 뚜껑으로 덮으십시오. 스폰지를 작은 조각으로 자르고 컵에 올려 놓으십시오.
- 플라스틱 일회용 스포이드를 사용하여 스폰지에 8% 포도당 용액을 추가합니다. 암컷 모기가 들어있는 컵을 인큐베이터에서 27°C, 습도 80%에서 10일 동안 보관한다. 72시간마다 새 포도당 포화 스폰지를 교체하십시오.
4. 흉강내 접종 준비
- 다음과 같이 미세 주입 바늘을 준비합니다. PUL-1000을 사용하여 바늘 풀러 프로그램에서 열 지수 = 450, 힘(g) = 110, 거리(mm) = 1.00 및 지연(s) = 0 매개변수로 미세 주입 바늘(그림 1A)을 만듭니다.
- 해부 현미경으로 핀셋으로 당겨진 바늘 끝을 16배 배율로 자릅니다(그림 1B). 팁을 너무 크게 만들지 마십시오, 그렇지 않으면 모기에 해를 끼칠 수 있습니다.
- 2.1 단계에서와 같이 암컷 모기를 준비하십시오.
참고: 다음 프로세스는 ACL-2 실험실에서 수행되었습니다. - 다음과 같이 감염성 바이러스 희석액을 준비하십시오.
- -80°C 냉동고에서 바이러스 스톡을 꺼내 얼음에 해동합니다. 100% FBS 및 1% P/S를 포함하는 RPMI 1640 배지와 함께 100-500 PFU 바이러스를 포함하는 100nL 바이러스 희석액으로 바이러스를 희석합니다.
- 일회용 멸균 주사기를 통해 바늘에 미네랄 오일을 다시 채웁니다. 기계의 지시에 따라 바늘을 인젝터에 부착하십시오.
- 감염성 바이러스 희석액이 들어있는 튜브에 바늘을 삽입하십시오. 바늘 끝을 부러 뜨리지 마십시오. FILL 버튼을 눌러 바늘에 바이러스 용액을 채웁니다. 바늘에서 바이러스 용액의 최종 부피는 약 4.0 μL입니다. 바늘에 바이러스가 채워지면 만지거나 손상되지 않도록 주의하십시오.
참고: 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행되었습니다.
5. 해부 현미경으로 바이러스 주입 수행
참고: 모든 단계는 ACL-2 실험실에서 수행되었습니다.
- 모기를 -20°C에서 1분 동안 마취시킵니다. 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 빨리 덮으십시오.
- 핀셋으로 거의 50 마리의 암컷 모기를 골라 얼음 접시에 올려 놓으십시오. 인젝터 아래에 얼음판을 놓고 해부 현미경으로 모기의 흉강에 바늘을 삽입합니다(그림 1C).
- 주입량을 100nL로 설정하고 속도를 50nL/s로 설정합니다. INJECT 버튼을 눌러 바이러스 용액이 모기로 흐르도록 합니다. 주사가 성공하면 복부가 약간 부풀어 오릅니다.
- 감염된 모기를 얼음 위에 놓인 새 플라스틱 컵(24oz)에 넣습니다. 감염된 모기의 수가 충분하면 컵을 자른 모기장 메쉬로 싸서 뚜껑으로 덮으십시오.
- 감염성 모기가 들어 있는 컵을 인큐베이터에 27°C, 습도 80%에서 10일 동안 보관한다. 3.5 단계에서와 같이 모기에게 먹이를주십시오.
6. 감염된 암컷 모기의 처리
참고: 각 암컷 모기에서 바이러스 감염률(VIR)을 계산하기 위한 장, 바이러스 전파율(VDR)을 계산하기 위한 머리, 바이러스 전파율(VTR)을 계산하기 위한 타액의 세 가지 다른 조직/기관을 해부했습니다. VIR은 바이러스 양성 내장을 가진 모기의 수로 정의되었습니다. VDR은 바이러스 양성 머리를 가진 모기의 수를 바이러스 양성 내장을 가진 모기의 수를 100으로 나눈 값으로 정의되었습니다. VTR은 바이러스 양성 타액을 가진 모기의 수를 바이러스 양성 내장을 가진 모기의 수를 100으로 나눈 값으로 정의되었습니다.
- 감염된 암컷 모기의 타액 수집
알림: 프로세스는 ACL-2 실험실에서 수행해야 합니다.- 감염된 암컷 모기를 단계 3.2에서와 같이 이산화탄소 마취로 마취시킨다. 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 붓고 뚜껑을 빨리 닫으십시오.
- 침지 오일로 채워진 10μL 피펫 팁을 고무 진흙 위에 나란히 놓습니다.
- 핀셋으로 암컷 모기를 골라 얼음 접시에 올려 놓으십시오. 핀셋으로 다리와 날개를 제거하십시오. 각 피펫 팁에 모기 한 마리의 입 부분을 놓습니다.
- 모기에 의해 기름으로 분비된 타액을 실온에서 다음 45-60분 동안 수집합니다.
- 200μL의 바이러스 희석제 배지(10% FBS 및 1% P/S를 함유한 RPMI 1640 배지)가 들어 있는 1.5mL 튜브에 피펫 팁을 넣습니다. 5,000 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 타액을 튜브로 배출합니다. 이 튜브를 -80 °C에서 보관하여 전송 속도를 측정하십시오.
- 감염된 암컷 모기를 해부합니다.
알림: 프로세스는 ACL-2 실험실에서 수행해야 합니다.- 타액 수집 후 암컷 모기의 머리를 자르기 위해 핀셋을 사용하십시오. 각 헤드를 200 μL의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 개별 튜브에 넣습니다.
- 핀셋으로 흉부를 잡은 다음 다른 핀셋으로 복부의 끝에서 두 번째 부분을 잡아 당겨 빼냅니다. 내장이 빠져 나옵니다. 흩어진 조직과 장기의 빼낸 내장을 청소하십시오.
- PBS로 장을 세척하고 각 장을 200μL의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 개별 튜브에 넣습니다. 바이러스 감염률 및 전파율의 후속 측정을 위해 이 튜브를 -80°C에서 보관하십시오.
7. 데이터 분석
- RNA 추출
- 작동 주파수 = 60Hz, 작동 시간 = 15초, 일시 중지 시간 = 10초, 사이클 = 2, 설정 온도 = 4.0°C로 설정된 저온 조직 균질화 분쇄기로 조직을 조각으로 분쇄합니다.
- 샘플을 4°C에서 10분 동안 12,000 x g 로 원심분리합니다. 기기 지침에 따라 자동 핵산 추출 시스템으로 각 샘플의 총 RNA를 추출합니다.
- qRT-PCR 수행
- 1단계 RT-PCR 키트를 사용하여 정량적 PCR 기기17을 사용하여 바이러스 RNA 카피를 정량화한다. EBIV S 세그먼트 F의 검출을 위해 ATGGCATCACCTGGGAAAG 및 R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA 프라이머를 사용하십시오. 반응 공정을 다음과 같이 설정한다: 단계 1: 42°C에서 5분, 95°C에서 10초; 2단계: 95°C에서 5초, 60°C에서 20초 동안 40회 사이클.
- 세포에 접종된 일련의 10배 희석액을 통해 세포 내 감염에 대한 최저 바이러스 용량을 결정합니다. BHK-21 세포를 사용하여 1.2 단계에 설명 된대로 10-7 까지 희석하여 EBIV의 최저 바이러스 용량을 결정하십시오.
- qRT-PCR로 가장 낮은 바이러스 용량의 Ct 값을 계산합니다. qRT-PCR에 의한 EBIV 양성에 대한 컷오프 값을 < 35로 사용합니다. 다음 방정식을 사용하여 각 표본에서 EBIV의 사본을 계산합니다.
y = -4.0312x + 3.384 [x = 로그 (EBIV의 사본), y = Ct 값, R2 = 0.9905] - 감염률, 전파율 및 전파율을 다음과 같이 계산합니다.
감염률(%) = 100 x (바이러스 양성 모기 내장 수 / 전체 모기 수)
전파율(%) = 100 x (바이러스 양성 모기 머리 수 / 바이러스 양성 모기 내장 수)
투과율(%) = 100 x (바이러스 양성 모기 타액의 수 / 바이러스 양성 모기 내장의 수) - 다중 비교를 위한 비모수 Kruskal-Wallis 분석과 적절한 경우 Fisher의 정확 검정을 사용하여 연속 변수의 차이와 모기 감염률, 전파율 및 전염률의 차이를 분석합니다.
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Representative Results
인공 혈액 공급(바이러스 최종 역가는 6.4 x 106 PFU/mL) 및 흉부 내 주사(바이러스 용량은 340 PFU)를 통해 감염된 모기의 EBIV 분포를 조사하기 위해 감염 후 10일(dpi)에 모기의 타액, 머리 및 내장에 있는 바이러스 RNA를 결정했습니다.
Ae. aegypti의 경우, 흉부내 접종된 암컷 모기의 내장, 머리 및 타액에서 EBIV의 바이러스 역가는 경구에 감염된 암컷 모기보다 훨씬 높았습니다(그림 2A-C). 흉부내 접종된 암컷 모기의 감염률 및 파종률은 100%였으나, 경구에 감염된 암컷 모기의 경우 각각 70% 및 38.1%였다(도 2D, E). 흉부 내 접종을 받은 암컷 모기의 전염률은 최대 90%에 달했지만 경구에 감염된 암컷 모기의 전염률은 4.8%에 불과했습니다. 그것은 Ae. aegypti의 내장이 바이러스 전파에 대한 강력한 억제 효과가 있음을 나타냅니다.
그림 1: 마이크로피펫 팁과 흉강내 주사의 개략도. (A) 팁을 부러뜨리기 전에 마이크로피펫 팁을 당겼습니다. (B) 흉부 내 접종에 적합한 적절하게 준비된 마이크로피펫 팁. (C) 모기에 대한 흉부 내 주사의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 경구 수유 및 흉부 내 접종을 통한 성충 모기의 벡터 능력. 감염된 암컷 모기를 28°C에서 10일 동안 배양하였다. 0.05≤ p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 비모수적 Kruskal-Wallis 분석은 다중 비교 및 적절한 경우 Fisher의 정확 검정에 사용되었습니다. 이 수치는 Xia et al.18의 연구에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법의 목표는 경구 수유 및 흉부 내 접종을 통해 벡터 능력을 평가하여 모기 매개 바이러스에 대한 포괄적인 위험 평가를 제공하는 것이었습니다.
구강 수유 실험에서 충혈 된 모기를 골라내어 새 용기로 옮겨야하므로 작업자에게 심각한 위험을 초래할 수 있습니다. 그 이유는 감염되지 않은 모기를 포함한 모든 모기가 감염원이 될 수 있기 때문이다19. 결과적으로, 모기는 프로토콜에 명시된대로 먼저 마취되어야하며, 그 다음에 후속 단계를 수행해야합니다. 충혈 된 모기를 골라내어 옮기는 것은 밀폐 된 글러브 박스에서 수행되어야한다는 점에 유의해야합니다. 상자에 자유롭게 움직이는 모기가 없는 한 이 과정에서 글러브 박스를 닫아 두십시오.
감염 실험에서는 두 사람이 함께 작업하는 것이 좋으며, 두 사람이 동시에 탈출하는 모기가 없음을 확인한 후 글로브 박스를 열어 감염된 모기가 탈출하는 것을 방지할 수 있습니다. 탈출이 발생하면 모기를 죽이거나 다시 잡아야 합니다. 맨손으로 감염된 모기를 죽이는 것은 권장하지 않습니다. 작업자의 감염 위험은 진공 흡입기 또는 기타 적절한 도구(예: 집게, 페인트 브러시, 장갑 낀 손)를 사용하여 줄일 수 있습니다. 실험 후 글로브 박스 내부와 작업대 표면을 기존의 소독제로 소독합니다.
모기 매개 바이러스에 대한 모기 벡터 능력에 대한 대부분의 연구는 구강 감염에만 초점을 맞추고 있습니다20,21. 구강 감염의 경우, 바이러스는 침으로 방출되기 위해 중장 및 침샘과 관련된 여러 조직 장벽을 극복해야 한다14. 모기 벡터 용량에 대한 중장샘과 침샘의 효과는 이 실험에서 입증되지 않았습니다. 경구 수유와 흉부 내 주사를 병용하면 서로 다른 조직 장벽을 철저히 평가할 수 있습니다. 이 절차의 결과에 따르면, Ae. aegypti는 바이러스에 대한 벡터 능력에서 지배적인 역할을 하며 침샘 장벽이 존재하지 않을 수 있습니다(그림 2). 이를 위해 우리의 프로토콜은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 또는 침샘 장벽의 존재를 확인하는 데 유용합니다.
방법론에 따르면, 바이러스 RNA만이 샘플에서 확인되었다. 투과 전자 현미경으로 비리 온을 보거나, 플라크 분석을 사용하여 감염을 확인하거나, 면역 형광 분석으로 바이러스 단백질을 검출하는 것과 같은 다른 조사는 다양한 샘플에서 감염성 바이러스를 확인하는 데 필요합니다. 이 방법론은 수정되어 관심있는 추가 바이러스를 광범위한 모기 벡터에 접종하는 데 사용될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 우한 과학 기술 계획 프로젝트 (2018201261638501)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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