Optisches Einfangen plasmonischer Nanopartikel für In-situ-oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie-Charakterisierungen

Die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) ist eine empfindliche Analysetechnik zum direkten Nachweis der chemischen Struktur von Zielmolekülen bei extrem niedrigen Konzentrationen oder sogar auf Einzelmolekülebene 1,2,3,4. Die Laserbestrahlung induziert eine lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz in metallischen Nanostrukturen, die als SERS-Substrate verwendet werden, um die Raman-Signale von Zielmolekülen zu verstärken. Salzinduzierte Nanopartikelaggregate sind die weit verbreiteten SERS-Substrate, die spontan eine Brownsche Bewegung in kolloidalen Suspensionsflüssigkeiten ^5,6 durchlaufen. Eine weitere Trocknung ermöglicht stabile SERS-Messungen; Es kann jedoch zu Verunreinigungskonzentrationen kommen, die Hintergrundgeräusche verursachen und irreversible Schäden an biologischen Proben verursachen⁷. Daher ist es wichtig, salzfreie Nanopartikelaggregationen zu entwickeln, ihre Bewegung in Lösung zu kontrollieren und die Biokompatibilität unter Beibehaltung der Messeffizienz zu verbessern.

Optisches Trapping wurde eingesetzt, um verschiedene metallische Substrate zu kontrollieren und SERS-Detektionen^{zu erleichtern} 8,9,10,11,12,13,14. Eine optische Falle wird erzeugt, indem ein Laserstrahl eng fokussiert wird, um ein optisches Kraftfeld zu erzeugen, das kleine Objekte in den Bereich mit der höchsten Intensität um den Fokus^15,16 zieht. In jüngster Zeit wurden optische Fallen verwendet, um reproduzierbare und empfindliche plasmonische Sensorplattformen für verschiedene Anwendungen zu entwickeln, die ihre einzigartigen Vorteile bei der Lokalisierung und Kontrolle der Position von SERS-aktiven metallischen Nanostrukturen in Lösungen 17,18,19,20,21,22,23,24 . Das vorliegende Protokoll führt einen Ansatz ein, um optische Pinzette und Raman-Spektromikroskopie zu kombinieren, um Silbernanopartikel (AgNPs) dynamisch zusammenzusetzen und sie gegen Brownsche Bewegung in Lösung für effiziente SERS-Messungen zu stabilisieren. Im AgNP-Assemblierungsbereich kann das Signal des 3,3'-Dithiobis[6-nitrobenzoesäure]-bis(succinimid)-esters (DSNB), Analytmoleküle, die auf der Oberfläche von AgNPs beschichtet sind, um etwa das 50-fache verstärkt werden. Dieser Ansatz eignet sich zur Analyse empfindlicher Biomoleküle, die mit den chemischen Verschließmitteln^25,26,27 nicht kompatibel sind. Darüber hinaus bietet es räumliche und zeitliche Steuerung zur Erzeugung der SERS-aktiven AgNP-Assembly. Dies ermöglicht die In-situ-Detektion in wässrigen Umgebungen, was den Einsatz von AgNPs verringern und Störungen für die In-vivo-Analyse minimieren könnte^28,29,30. Darüber hinaus ist die optische Traping-induzierte AgNP-Anordnung stabil, reproduzierbar und reversibel^31,32. Daher ist es eine vielversprechende Plattform für den Nachweis von Analytmolekülen in Lösungen und unter physiologischen Bedingungen, unter denen die salzinduzierte Aggregation nicht anwendbar ist.

In der vorliegenden Studie sind ein 1064-nm-Fanglaser, ein Kraftdetektionsmodul und eine Hellfeld-Beleuchtungsquelle in das optische Pinzettenmikroskopiesystem zur optischen Manipulation und Visualisierung von Partikeln integriert. Ein 532 nm Raman-Sondenlaser wurde ebenfalls in das Mikroskop integriert und mit dem Fanglaser in der Probenkammer ausgerichtet. Für die spektrale Erfassung wurde rückgestreutes Licht gesammelt und in ein Spektrometer umgeleitet (Abbildung 1).

1. Optischer Aufbau

1. Richten Sie einen 532 nm Laserstrahl (Raman-Anregungsquelle) in den Flexport des optischen Pinzettenmikroskops (siehe Materialtabelle).
2. Richten Sie den 532-nm-Laserstrahl mit einem dichroitischen 750-nm-Langpassspiegel in die Stereo-Doppelschichtbahnen des optischen Pinzettenmikroskops aus, um ihn mit den ursprünglichen Fanglaserstrahlen zu kombinieren, um auf die Probenkammer zu fokussieren.
3. Das rückgestreute Licht aus der Probenkammer wird mit einem dichroitischen 750-nm-Langpassspiegel gesammelt und in ein Spektrometer umgeleitet, das eine CCD-Kamera (Flüssigstickstoff-gekühltes ladungsgekoppeltes Gerät) enthält (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie vor der spektralen Erfassung einen 532-nm-Kerbfilter vor dem Eingangsschlitz des Spektrometers.
   HINWEIS: Augenschutz muss verwendet werden, wenn der Laser eingeschaltet ist, und der Laserstrahl muss sich in einem sicheren Bereich befinden.

2. Herstellung von AgNPs

1. 50 mL 1 mM wässrige Lösung von 1 mM AgNO₃ werden während des Kochens in einem Rundkolben erhitzt.
2. 1,0 ml 0,1 M Trinatriumcitratlösung werden tropfenweise in die gekochte wässrige_{AgNO3-Lösung} gegeben.
3. Lassen Sie die Mischung 16 min unter ständigem Rühren kochen.
4. Kühlen Sie die Mischung auf Raumtemperatur ab. Gelbliche Farbe wird beobachtet.
5. Die AgNP-Kolloide bei 2000 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und dann den Überstand mit einer Pipette entfernen.
6. Resuspendieren Sie die AgNP-Kolloide mit 1 mL entionisiertem Wasser (spezifischer Widerstand von 18,2 MΩ cm).
7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 dreimal, um das restliche Reduktionsmittel zu entfernen.
8. Charakterisierung der Größenverteilung der AgNPs mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS)³³ , um die Gleichmäßigkeit der AgNPs zu bestätigen (Abbildung 2). Die AgNP-Konzentration wurde durch UV-Absorption auf 0,1 nM geschätzt³⁴.
   ANMERKUNGEN: Aufgrund der geringen Konzentration kann die AgNP-Stammlösung ohne Clusterbildung für 2-3 Wochen aufrechterhalten werden. Es werden keine Stabilisierungsmittel benötigt. Wenn ein Niederschlag in der AgNP-Stammlösung beobachtet wurde, wurde eine neue AgNP-Lösung nach dem obigen Protokoll hergestellt.

3. Wechselwirkung des DSNB-Analytmoleküls und AgNP

1. 200 μL 2 mM DSNB (siehe Materialtabelle) zu 1 mL AgNP-Kolloid geben und bei Raumtemperatur für 3 h inkubieren, um eine Schicht DSNB auf der Oberfläche von AgNP durch Bildung der Ag-S-Bindung zwischen AgNP und DSNB³⁵ zu beschichten. Eine schematische Darstellung dieser Interaktion ist in Abbildung 3 dargestellt.
2. Zentrifugieren Sie den AgNP bei 2.000 × g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand.
3. Resuspendieren Sie das AgNP-DSNB mit 1 mL entionisiertem Wasser.
4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 und 3.3 dreimal, um überschüssiges DSNB zu entfernen.
5. Zeichnen Sie die UV-sichtbaren Spektren des AgNP-Kolloids und der AgNP-DSNB-Lösung auf.
   HINWEIS: Diese Spektren zeigen eine Absorptionsspitzenverschiebung von etwa 420 nm auf 450 nm, was auf die erfolgreiche Beschichtung von DSNB auf der Oberfläche von AgNP hinweist (Abbildung 3).

4. Vorbereitung der Probenkammer und Erzeugung der AgNP-Baugruppe für die SERS-Messung

1. Glasobjektträger und Deckglas mit Wasser und Ethanol reinigen.
2. Befestigen Sie das Rahmenband (0,25 mm Dicke, siehe Materialtabelle) am Objektträger, um eine Kammer (1,0 cm Länge × 1,0 cm Breite × 0,25 mm Höhe) zu schaffen.
3. Einige Tropfen der AgNP-DSNB-Lösung (ca. 25 μL) in den Rahmen geben.
4. Legen Sie das Deckglas auf das Rahmenband, und verschließen Sie es (Abbildung 4).
5. Geben Sie flüssigen Stickstoff in den Behälter der flüssigstickstoffgekühlten CCD-Kamera, bis die Temperatur -120 °C erreicht.
6. Blockieren Sie den Strahlweg der Raman-Sonde mit einem magnetischen Laserschutzschirm (siehe Materialtabelle) und schalten Sie dann den 532-nm-Raman-Anregungsquellenlaser ein.
7. Befestigen Sie die Probenkammer mit der AgNP-DSNB-Lösung auf dem Kammerhalter. Fügen Sie Wasser in das in Wasser eingetauchte Objektiv hinzu (60-fache Vergrößerung mit einer numerischen Apertur A von 1,2 von 1,2), wie in Abbildung 1 dargestellt. Platzieren Sie dann den Kammerhalter sofort auf der Mikrobühne über dem Objektiv.
8. Tropfen Sie Immersionsöl auf das Deckglas und positionieren Sie den in Öl getauchten Kondensator, um Partikel auf der Mikroskopkamera sichtbar zu machen.
9. Stellen Sie die Z-Position des Objektivs ein, indem Sie den Knopf des Mikroskops drehen, bis der 532-nm-Raman-Sondenstrahl auf die untere Glasoberfläche der Kammer fokussiert ist und einen weißen Fleck auf der Mikroskopkamera zeigt (Abbildung 5).
   1. Passen Sie die X- und Y-Positionen der Mikrostufe an, um die Kammer so zu bewegen, dass der zentrale Bereich der Kammer am weißen Punkt platziert wird. Öffnen Sie die optische Pinzettensteuerungssoftware (siehe Materialtabelle), und verwenden Sie die ausgestattete Joystick-Steuerung, um den 1064-nm-Fanglaser (im optischen Pinzettensystem durch einen roten Kreis gekennzeichnet) so zu bewegen, dass er mit dem weißen Punkt überlappt (Abbildung 5).
   2. Als nächstes stimmen Sie den Knopf des Mikroskops ab, um die Z-Position des Objektivs nach oben zu bewegen.
      HINWEIS: Das Verschwinden des weißen Flecks im Bild der Mikroskopkamera zeigt an, dass der 532 nm Raman-Sondenstrahl innerhalb der Kammer fokussiert ist.
10. Schalten Sie den 1064-nm-Fanglaser ein, um AgNPs in der Probenkammer anzuziehen und eine plasmonische AgNP-Baugruppe zu erstellen.
    HINWEIS: Die Sammlung von AgNPs führt zu einem dunklen Fleck in der Probenkammer (Abbildung 6B).
    1. Drehen Sie den Fanglaserstrahl herunter, um bei Bedarf eine Überhitzung oder Blasenbildung zu vermeiden.
       HINWEIS: Erhöhen Sie die Catching-Laserleistung und die Bestrahlungszeit, wenn keine AgNP-Baugruppe erkennbar ist.
11. Passen Sie die Position der Probenmikrostufe an, um den dunklen Fleck der plasmonischen AgNP-Baugruppe für spektroskopische Messungen unter den Fokus des 532-nm-Raman-Sondenstrahls zu stellen.
12. Platzieren Sie die Neutraldichtefilter (ND) vor dem 532-nm-Raman-Laserauslass, um die Leistung auf 10 mW einzustellen. Geben Sie die Aufnahmezeit (10 s für die vorliegende Studie, Abbildung 6) in das Einstellungsfenster der Spektrumsoftware ein (siehe Materialtabelle) und klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen, um die spektrale Erfassung zu starten.
    HINWEIS: Dies erzeugt das SERS-Spektrum der Analytmoleküle (DSNB im repräsentativen Ergebnis und Abbildung 6).

Als Proof of Concept wurde DSNB als Analytmolekül ausgewählt und auf die Oberfläche von AgNPs aufgetragen. Die typischen SERS-Spektren von DSNB, verstärkt durch die plasmonische AgNP-Anordnung und dispergierte AgNP, sind in Abbildung 6 dargestellt. Ohne den Fanglaser erzeugten die dispergierten AgNPs in der Probenkammer bei Anregung durch den Raman-Sondenlaser ein schwarzes Spektrum (Abbildung 6A). Ein schwaches und breites SERS-Signal wurde bei etwa 1380-1450 cm-1 beobachtet, dem charakteristischen Peak von DSNB aus seiner symmetrischen NO2-Ausdehnung, die mit Literaturberichten 35,36 übereinstimmt. Da die dispergierten AgNPs unter Brownscher Bewegung standen, waren die Interpartikelübergänge groß und instabil, wie in Abbildung 6C dargestellt. Daher war die SERS-Signalverstärkung von DSNB für die dispergierten AgNPs gering.

AgNPs werden gesammelt, um eine plasmonische AgNP-Anordnung zu bilden, wenn der Fanglaser eingeschaltet ist. Die Erhöhung der Leistung und die Verlängerung der Bestrahlungszeit des Fanglasers könnte mehr AgNPs anziehen und einen dunklen Fleck erzeugen, wie in Abbildung 6B gezeigt. Hier haben wir eine Catching-Laserleistung von 700 mM und eine Bestrahlungszeit von 20 s angewendet, um eine plasmonische AgNP-Baugruppe in einer 0,05 nM DSNB-beschichteten AgNP-Lösung an einem bestimmten Ort und zu einem bestimmten Zeitpunkt zu erzeugen. Das SERS-Spektrum von DSNB wurde im Bereich der plasmonischen AgNP-Anordnung erhalten (Abbildung 6A, rot). Das starke Raman-Band bei 930 cm-1 wird der Nitro-Scherenschwingung zugeordnet, und die großen Bänder bei 1078 cm-1, 1152 cm-1 und 1191 cm-1 entsprechen wahrscheinlich der Succinimidyl-N-C-O-Dehnung, die sich mit den aromatischen Ringmoden von DSNB 35,37 überlappt. Die Merkmalsbänder bei 1385 cm-1 und 1444 cm-1 entstehen aus der symmetrischen Nitrodehnung von DSNB und sind durch die Reaktion mit der Oberfläche von AgNP35,37 deutlich verstärkt und leicht verschoben. Basierend auf den zuvor berichteten SERS-Fingerabdrücken von DSNB35,36,37 wurde die Bande bei 1579 cm-1 dem aromatischen Ringmodus von DSNB zugeordnet. Die Gesamtintensitäten von DSNB in der plasmonischen AgNP-Anordnung waren höher als die des dispergierten AgNP. Unter Berücksichtigung der Intensität des charakteristischen Peaks bei 1444 cm-1 kann die plasmonische AgNP-Anordnung eine etwa 50-fache Verstärkung des SERS-Signals von DSNB im Vergleich zu dem des dispergierten AgNP liefern. Wie in Abbildung 7 gezeigt, wurden die SERS-Spektren von DSNB wiederholt (20 Mal) für die AgNP-Assemblierung im Experiment aufgezeichnet und zeigten identische Schwingungsmerkmale. Die Intensitäten der charakteristischen Peaks von DSNB bei 1152 cm−1, 1444 cm−1 und 1579 cm−1 über diese 20 SERS-Spektren wurden als Histogramme mit relativen Standardabweichungen (RSD) von 6,88%, 6,59% bzw. 5,48% aufgetragen. Dies bestätigte die Reproduzierbarkeit und Stabilität. Daher ist dieser Ansatz zuverlässig für die Manipulation plasmonischer Nanopartikel und die SERS-Detektion von Analytmolekülen in Lösung.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der optischen pinzettengekoppelten Raman-spektroskopischen Plattform. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Vorbereitung von AgNP für die SERS-Messung. (A) REM-Bild von AgNP. (B) Größenverteilung von AgNP durch DLS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Wechselwirkung von AgNP und DSNB. (A) Schematische Darstellung der Beschichtung von DSNB auf der Oberfläche von AgNP. (B) UV-sichtbare Spektren von AgNP und AgNP-DSNB. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Probenkammervorbereitung. (A) Prozess der Probenkammervorbereitung. (B) Vorbereitete Probenkammer. Maßstabsbalken = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Positionsüberlappung des 532 nm Raman-Lasers und des 1064-nm-Fanglasers. (A) Position des 532-nm-Raman-Lasers durch weißen Fleck angezeigt. (B) Position des 1064-nm-Fanglasers, der durch einen roten Kreis angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Typische SERS-Spektren der Analytmoleküle, verstärkt durch die plasmonische AgNP-Anordnung. (A) SERS-Spektren von DSNB an der plasmonischen AgNP-Anordnung (rot) und dem dispergierten AgNP (schwarz). (B) Die plasmonische AgNP-Anordnung, wenn der Fanglaser eingeschaltet ist, zeigt einen dunklen Fleck unter mikroskopischer Visualisierung. (C) Der dispergierte AgNP, wenn der Fanglaser ausgeschaltet ist. (D) Illustration des Mechanismus der Bildung von AgNP-Anordnungen. (E) Konzentrationsabhängige SERS-Intensität in Abwesenheit des Fanglasers. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Reproduzierbarkeit des SERS-Signals von DSNB. (A) 20 SERS-Spektren von DSNB an der plasmonischen AgNP-Anordnung, die wiederholt im Experiment aufgezeichnet wurden. (B) Histogramme der Intensitäten der charakteristischen DSNB-Spitzenwerte liegen bei 1152 cm-1 (RSD = 6,88%), 1444 cm-1 (RSD = 6,59%) und 1579 cm-1 (RSD = 5,48%). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: AgNP-Baugruppe, die unter verschiedenen experimentellen Parametern erzeugt wurde. (A) Unterschiedliche Fanglaserleistung; Bestrahlungszeit 20 s und AgNP-Konzentration 0,05 nM. (B) unterschiedliche Bestrahlungszeit; Fanglaserleistung 700 mW und AgNP-Konzentration 0,05 nM. (C) unterschiedliche AgNP-Konzentration; Bestrahlungszeit 20 s und Einfanglaserleistung 700 mW. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Die Mikroskopkamerabilder der AgNP-Montage in Zeitreihen, wenn der Fanglaser ausgeschaltet wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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