Umfassendes Verständnis der inaktivitätsinduzierten Gangveränderung bei Nagetieren

Mangelnde körperliche Aktivität oder Nichtgebrauch führt zur Verschlechterung der motorischen Effektoren, wie Muskelschwund und Knochenschwund¹ und Ganzkörperdekonditionierung². Darüber hinaus wurde kürzlich festgestellt, dass Inaktivität nicht nur strukturelle Aspekte der Muskel-Skelett-Komponenten, sondern auch qualitative Aspekte der Bewegung betrifft. Zum Beispiel unterschieden sich die Gliedmaßenpositionen von Ratten, die einer simulierten Mikrogravitationsumgebung ausgesetzt waren, von denen intakter Tiere auch 1 Monat nach Ende der Intervention ^3,4. Dennoch wurde wenig über Bewegungsdefizite berichtet, die durch Inaktivität verursacht werden. Auch die umfassenden Bewegungsmerkmale der Verschlechterungen sind nicht vollständig bestimmt.

Das aktuelle Protokoll demonstriert und diskutiert die Anwendung der kinematischen Auswertung zur Visualisierung von Bewegungsänderungen unter Bezugnahme auf Gangbewegungsdefizite, die durch Nichtanwendung bei Ratten hervorgerufen werden, die einer Entladung der Hinterbeine unterzogen wurden.

Es wurde gezeigt, dass Hyperextensionen von Gliedmaßen beim Gehen nach einer simulierten Mikrogravitationsumgebung sowohl bei Menschen⁵ als auch bei Tieren^{beobachtet werden 4,6,7,8}. Aus Gründen der Universalität haben wir uns daher in dieser Studie auf allgemeine Parameter konzentriert: Winkel der Knie- und Sprunggelenke und vertikaler Abstand zwischen Metatarsophalangealgelenk und Hüfte (entspricht in etwa der Höhe der Hüfte) am Mittelpunkt der Standphase (Mitte). Darüber hinaus werden in der Diskussion mögliche Anwendungen der videokinematischen Auswertung vorgeschlagen.

Eine Reihe von kinematischen Analysen kann eine wirksame Maßnahme sein, um funktionelle Aspekte der neuronalen Kontrolle zu bewerten. Obwohl Bewegungsanalysen von der Fußabdruckbeobachtung oder einfachen Messung des aufgenommenen Videos^9,10 bis hin zu mehreren Kamerasystemen^11,12 entwickelt wurden^, müssen universelle Methoden und Parameter noch etabliert werden. Die Methode in dieser Studie soll diese Gelenkbewegungsanalyse mit umfassenden Parametern versorgen.

In der vorherigen Arbeit¹³ haben wir versucht, Gangveränderungen bei Nervenläsionsmodellratten mit umfassender Videoanalyse zu illustrieren. Im Allgemeinen sind die potenziellen Ergebnisse von Bewegungsanalysen jedoch häufig auf vorgegebene Variablen beschränkt, die in den Analyserahmen bereitgestellt werden. Aus diesem Grund wird in der vorliegenden Studie detailliert beschrieben, wie benutzerdefinierte Parameter integriert werden können, die breit anwendbar sind. Kinematische Auswertungen mittels Videoanalysen können bei Implementierung geeigneter Parameter von weiterem Nutzen sein.

Die vorliegende Studie wurde vom Kyoto University Animal Experimental Committee (Med Kyo 14033) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institute of Health (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th Edition) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 7 Wochen alte männliche Wistar-Ratten verwendet. Ein Schema, das die Abfolge der Verfahren darstellt, ist in der Zusatzdatei 1 enthalten.

1. Ratten mit dem Laufbandlaufen vertraut machen

HINWEIS: Einzelheiten zum Verfahren entnehmen Sie bitte dem zuvor veröffentlichten Bericht¹³ .

1. Setzen Sie die Ratte auf ein Laufband für Nagetiere (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Tier in der ersten Sitzung das Laufband erkunden, um sich an die Umgebung zu gewöhnen.
   HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ca. 5 Min.
2. Erhöhen Sie allmählich die Geschwindigkeit des Gürtels auf das gewünschte Niveau (20 cm / s) und gehen Sie mit der Ratte. Verwenden Sie bei Bedarf einen elektrischen Schlag am Ende des Laufbandes¹⁴.
   HINWEIS: Eine Wanderung dauert ca. 10-20 min.
3. Wiederholen Sie diesen Vorgang jeden zweiten Tag für 1 Woche oder häufiger, falls erforderlich^15,16,17.
   HINWEIS: Beginnen Sie die Einarbeitungszeit 1 Woche vor Schritt 2.
4. Halten Sie die Ratten in Gruppen in Käfigen (2-3 Ratten in jedem Käfig) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Stellen Sie Nahrung und Wasser ad libitum zur Verfügung.

2. Anwendung der Entladung der Hinterbeine bei den Ratten und Setzen von Gelenkmarkern

ANMERKUNG: Heben Sie die Hinterbeine der Ratte mit Faden und Klebeband an, die am Schwanz befestigt sind, wie in früheren Berichten^18,19,20 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass der Faden und das Klebeband an der Basis des Schwanzes befestigt sind, um ein Verrutschen der Schwanzhaut zu verhindern. Überwachen Sie die Tiere gründlich und passen Sie bei Bedarf die Entladehöhe oder Dichtheit des Bandes an.

1. Unter 2-5% Isofluran-Inhalation mit einer Anästhesiemaske die erste Hälfte eines 30 cm langen Klebebandstreifens um den proximalen Teil des Rattenschwanzes wickeln.
2. Falten Sie einen 1 m langen Baumwollfaden (Küchengarn aus Baumwolle, ca. 1 mm Durchmesser) zur Hälfte. Machen Sie eine Schlaufe, indem Sie einen Knoten an der gefalteten 50 cm Mitte binden. Der Knoten muss ca. 5 cm von der Spitze entfernt sein, um eine 10 cm Umfangsschlaufe zu hinterlassen.
3. Lassen Sie die restlichen 15 cm des Klebebandes einmal durch die Fadenschlaufe passieren, um das Band zu sichern. Wickeln Sie das verbleibende Band um den distalen Teil des Schwanzes.
4. Befestigen Sie die andere Spitze des Fadens auf der Überkopfplattform des Käfigs. Halten Sie die Tiere in einem Käfig, der hoch genug ist, um ihre Hinterbeine am Schwanz anzuheben. Stellen Sie neben dem Entladen die gleiche Umgebung wie für die Strrl-Gruppe bereit, z. B. Lebensmittel, Wasser und Bodenbettwäsche.
5. Richten Sie die Verbindungsmarker und die Software ein (siehe Materialtabelle), indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Schritt finden Sie in Wang et ^al.13.
   1. Unter 2-5% Isofluran-Inhalation farbige halbkugelförmige Marker (3 mm Durchmesser) auf der rasierten Haut befestigen, die knöchernen Landmarken entsprechen. Halten Sie den Isofluranspiegel so niedrig wie möglich, um eine sehr tiefe Anästhesie zu vermeiden.
   2. Stellen Sie sicher, dass die Orientierungspunkte die vordere obere Beckenwirbelsäule (ASIS), Trochanter major (Hüftgelenk), Kniegelenk (Knie), lateraler Malleolus (Knöchel) und fünftes Metatarsophalangealgelenk (MTP) ^sind21.
      HINWEIS: Malen Sie die Zehenspitze, wenn der Winkel der Zehe benötigt wird. Verwenden Sie einen Farbmarker auf Ölbasis (siehe Materialtabelle). Flüssigkleber ist für Klebstoff vorzuziehen, da die flüssige Form schneller trocknet.

3. Marker-Tracking mit aufgenommenen Videos

1. Öffnen Sie die MotionRecorder-App (siehe Materialtabelle) und schalten Sie das Laufband ein. Legen Sie die Ratte auf den Laufbandgürtel.
   HINWEIS: Die vier Kameras für die Videoaufnahme (siehe Materialtabelle) sind entlang der langen Kanten des Laufbandes angeordnet: zwei Kameras an jeder Kante, ca. 50 cm x 50 cm voneinander entfernt, in der Mitte des Laufbandbereichs.
2. Erhöhen Sie die Bandgeschwindigkeit auf bis zu 20 cm/s. Wenn die Ratte normal mit der gewünschten Geschwindigkeit zu laufen beginnt, klicken Sie auf das Aufnahmesymbol , um die Videoaufnahme zu starten. Sobald genügend Schritte (5 aufeinanderfolgende Schritte, vorzugsweise 10 Schritte) erreicht sind, stoppen Sie die Aufnahme, indem Sie erneut auf das Aufnahmesymbol klicken.
   HINWEIS: Erfassen Sie Daten über mehrere Tiere in einem Experiment. Versuchen Sie es bis zu fünf Mal für jede Ratte. Wenn eine Ratte nicht läuft, fangen Sie eine andere und versuchen Sie die erste später. Die Aufnahmerate der Kamera betrug 120 Bilder/s.
3. Öffnen Sie die 3DCalculator-App (siehe Materialtabelle) und die zu analysierende Videodatei.
4. Schneiden Sie das Video zu, indem Sie den horizontalen Schieberegler oben so anpassen, dass er eine ausreichende Anzahl aufeinanderfolgender Schritte enthält. Aufgenommene Bildänderungen durch Ziehen der Endspitzensymbole des gelben Schiebereglers.
5. Um die Marker zu erfassen, wählen Sie die Markerlegenden aus, indem Sie auf die Markerlegenden auf dem Stickbildmodell klicken, sie auf die entsprechende Markierung auf dem aufgenommenen Video ziehen und die Schaltfläche loslassen. Dieser Prozess ordnet die Farbe des Markers der Markerlegende im Stickbild zu. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Marker, der verfolgt werden soll.
6. Klicken Sie auf das Symbol Automatische Ablaufverfolgung . Wenn das System Marker nicht genau verfolgt oder der Tracking-Prozess aufgrund von Markerverlust anhält, wechseln Sie in den manuellen Modus.
   HINWEIS: Dieser automatische Prozess wird nicht angehalten, es sei denn, die Marker werden übersehen. Wenn Stopps häufiger als alle paar Frames auftreten, sollten Sie die verlorenen Marker neu positionieren.
7. Wenn der manuelle Modus erforderlich ist, klicken Sie auf das Symbol Manuell , um zu wechseln. Klicken Sie auf die fehlende Markerlegende auf dem Stickbild und die entsprechende Markierung auf dem Video. Das Video wird mit einem Frame für jeden Klick im manuellen Modus fortgesetzt.
   HINWEIS: Verwenden Sie frei verfügbare Apps, die das automatische Klicken ermöglichen, um Ermüdung derjenigen zu verhindern, die die Marker verfolgen (digitalisieren) (siehe Materialtabelle).

4. Berechnung der gewünschten Parameter

1. Öffnen Sie die KineAnalyzer-App (siehe Materialtabelle) und laden Sie die Datei.
2. Wechseln Sie zum Menü Ansicht > Markermaster bearbeiten . Es öffnet sich das Fenster "Marker Master Edit".
   HINWEIS: Erfasste Marker haben einfache Nummern, bis sie beschriftet sind.
3. Klicken Sie auf dem Marker-Tab auf das gewünschte Label (Landmark) und dann auf die gewünschte Farbe. Bei diesem Prozess wird jeder Marker einem bestimmten Orientierungspunkt zugeordnet.
4. Wechseln Sie zur Registerkarte Link . Erstellen Sie Linien, indem Sie nacheinander auf zwei Markierungen klicken. Dieser Prozess erstellt Linien, die jedem Glied mit beschrifteten Markern entsprechen.
5. Weisen Sie den erstellten Linien Farben zu, indem Sie die gewünschte Farbe in der Spalte Farbe auswählen.
6. Definieren Sie Winkel, indem Sie Referenz-/Bewegungslinien und Richtungen der Winkel zuweisen. Gehen Sie zur Registerkarte Winkel . Nachdem Sie den Winkel benannt haben, weisen Sie Vektor A (Referenzlinie) und Vektor B (bewegliche Linie) zu, indem Sie auf die Markierungen klicken, die jedem Orientierungspunkt entsprechen. Definieren Sie dann die Richtung des Winkels mit einem Wert im Bedienabschnitt auf derselben Registerkarte.
   HINWEIS: Für die vorliegende Studie konzentrierten sich die hauptsächlich fokussierten Parameter in der Mitte der Standphase (Midstance): KSt (Kniewinkel), ASt (Knöchelwinkel), MHD (Metatarso-Hüftabstand: entspricht der Höhe der Hüfte, siehe nächster Abschnitt). Kniewinkel und Knöchelwinkel wurden definiert als der Winkel zwischen Femur und Tibia bzw. Tibia bzw. fünftem Mittelfußknochen. Ein Winkel von 0° bedeutet, dass das Gelenk vollständig gebeugt wurde.
7. Definieren Sie auf der Registerkarte Abstand den Entfernungsparameter (MHD). Wählen Sie im Abschnitt "Entfernungseinstellung " zwei entsprechende Markierungen aus. Gelenktrajektorien als Funktion des normalisierten Schrittzyklus werden ebenfalls verfügbar sein.
   HINWEIS: Das Definieren von Winkeln/Parametern muss nur einmal durchgeführt werden. Die Einstellungen der Parameter stehen nach Abschluss dieses Definitionsprozesses für spätere Auswertungen zur Verfügung.

12 Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip einer von zwei Gruppen zugeordnet: der Entladegruppe (UL, n = 6) oder der Kontrollgruppe (Strg, n = 6). Bei der UL-Gruppe wurden die Hinterbeine der Tiere 2 Wochen lang am Schwanz entladen (UL-Periode), während die Tiere der Ctrl-Gruppe frei gelassen wurden. 2 Wochen nach dem Entladen zeigte die UL-Gruppe ein deutliches Gangmuster im Vergleich zur Ctrl-Gruppe. Abbildung 1 zeigt normalisierte Gelenkverläufe repräsentativer Probanden. Während der Standphase zeigte die UL-Gruppe weitere Verlängerungen im Knie und Knöchel (d.h. Plantarflexion für den Knöchel) als die Strrl-Gruppe, die als "Zehengehen" bezeichnet wird3,16. Ziel dieser Studie war es, die umfassenden Merkmale dieser Bewegungsverschlechterungen zu bestimmen. Um quantitative Messungen aus diesen Gesamtergebnissen zu verdeutlichen, wurden drei Parameter wie oben angegeben implementiert: KSt, Kniewinkel in der Mitte; ASt, Knöchelwinkel; MHD, Metatarso-Hüftabstand (vertikaler Abstand zwischen fünftem Metatarsophalangealgelenk und Hüftgelenk), der praktisch der Höhe des Hüftgelenks in der Mitte entspricht.

Nach 2 Wochen (2 Wochen nach dem Entladen) waren sowohl KSt als auch ASt der UL-Gruppe signifikant größer als die der Ctrl-Gruppe (Abbildung 2A,B, ungepaarter t-Test: p < 0,01). Darüber hinaus war MHD in der UL-Gruppe deutlich höher (Abbildung 3, ungepaarter t-Test: p < 0,01). Die Pfotenposition während des Mittelstandes ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.

Weniger Aktivität durch Entladen kann neuronale Veränderungen verursachen22,23,24,25. Diese Veränderungen könnten zu einer Verschlechterung der funktionellen Merkmale des Bewegungsapparates 3,4 und der muskuloskelettalen Merkmale führen. Signifikante Veränderungen der oben beschriebenen Parameter können auf diese neuronalen Veränderungen zurückgeführt werden.

Abbildung 1: Normalisierte Gelenkverläufe der repräsentativen Probanden. Die Ordinate wird so angepasst, dass die Trajektorien im Diagramm ungefähr in der Mitte erscheinen. (A) Knie- und (B) Sprunggelenke in der Entladegruppe zeigten während der Standphase eine weitere Streckung (Plantarflexion für den Sprunggelenk) als die Kontrollgruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Gelenkwinkel von Knie und Knöchel in der Mitte. Die Entladegruppe zeigte sowohl in (A) KSt (Knie) als auch in (B) Ast (Knöchel) signifikant größere Winkel als die Kontrollgruppe (ungepaarter t-Test: p < 0,01). Der Fehlerbalken stellt das Konfidenzintervall von 95 % dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Höhe des Hüftgelenks in der Mitte. Der Metatarso-Hüftabstand der Entladegruppe war signifikant höher als der der Kontrollgruppe (ungepaarter t-Test: p < 0,01). Der Fehlerbalken stellt das Konfidenzintervall von 95 % dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zusatzdatei 1: Ein Schema, das die Abfolge der Verfahren darstellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Die Pfotenposition der Ratte in der Mitte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 1: Schrittverfolgung von unten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Auswertung von Reichweitenbewegungen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.