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Biology

Induction et divers indicateurs d’évaluation de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/63866
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Putuo People's Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

Le présent protocole décrit l’induction d’une encéphalomyélite auto-immune expérimentale dans un modèle murin utilisant la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline et la surveillance du processus de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique. Les symptômes expérimentaux liés à l’encéphalomyélite auto-immune sont analysés à l’aide d’une micro-tomodensitométrie du fémur de souris et d’un test en plein champ pour évaluer le processus de la maladie de manière exhaustive.

Abstract

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune typique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une infiltration inflammatoire, une démyélinisation et des lésions axonales. À l’heure actuelle, il n’existe aucune mesure pour guérir complètement la SP, mais de multiples traitements modificateurs de la maladie (DMT) sont disponibles pour contrôler et atténuer la progression de la maladie. Il existe des similitudes significatives entre les caractéristiques pathologiques du SNC des patients atteints d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et de SEP. L’EAE a été largement utilisée comme modèle représentatif pour déterminer l’efficacité des médicaments contre la SP et explorer la mise au point de nouveaux traitements contre la SP. L’induction active de l’EAE chez la souris a un effet stable et reproductible et est particulièrement adaptée à l’étude des effets des médicaments ou des gènes sur la neuroinflammation auto-immune. La méthode d’immunisation des souris C57BL/6J avec la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG35-55) et l’évaluation quotidienne des symptômes de la maladie à l’aide d’un système de notation clinique sont principalement partagées. Compte tenu de l’étiologie complexe de la SEP avec diverses manifestations cliniques, le système de notation clinique existant ne peut pas satisfaire l’évaluation du traitement de la maladie. Pour éviter les lacunes d’une seule intervention, de nouveaux indicateurs permettant d’évaluer l’EAE en fonction des manifestations cliniques d’humeurs anxieuses et d’ostéoporose chez les patients atteints de SEP sont créés afin de fournir une évaluation plus complète du traitement de la SEP.

Introduction

Les maladies auto-immunes sont un spectre de troubles causés par la réponse immunitaire du système immunitaire à ses propres antigènes entraînant des lésions tissulaires ou un dysfonctionnement1. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune chronique de polyneuropathie du système nerveux central (SNC), caractérisée par une infiltration inflammatoire, une démyélinisation et une dégénérescence axonale neuronale 2,3. À l’heure actuelle, la SEP a touché jusqu’à 2,5 millions de personnes dans le monde, principalement des jeunes et des personnes d’âge moyen âgées de 20 à 40 ans, qui sont souvent l’épine dorsale de leur famille et de la société. Cela a eu un impact et un préjudice considérables pour les familles et la société 2,4.

La SEP est une maladie multifactorielle aux manifestations cliniques diverses et complexes. En plus des troubles neurologiques classiques caractérisés par une infiltration inflammatoire et une démyélinisation, la SEP présente souvent une déficience visuelle, une dyskinésie des membres et des troubles cognitifs et émotionnels 5,6,7. Si les patients atteints de SEP ne reçoivent pas le traitement approprié et correct, la moitié d’entre eux vivront dans des fauteuils roulants après 20 ans, et près de la moitié d’entre eux éprouveront des symptômes dépressifs et anxieux, conduisant à des niveaux beaucoup plus élevés d’idées suicidaires que la population générale 8,9.

Malgré une longue période de recherche, l’étiologie de la SP reste insaisissable et la pathogenèse de la SEP n’a pas encore été élucidée. Les modèles animaux de SP ont permis de servir d’outils de test pour explorer le développement de maladies et de nouvelles approches thérapeutiques, malgré les différences significatives entre les systèmes immunitaire des rongeurs et humains, tout en partageant certains principes de base. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est actuellement le modèle animal idéal pour étudier la SEP, qui utilise l’immunité autoantigénique des protéines de myéline pour induire une auto-immunité aux composants du SNC chez les souris sensibles, avec l’ajout d’adjuvant de Freund complet (CFA) et de toxine de la coqueluche (PTX) pour améliorer la réponse immunitaire humorale. Selon le bagage génétique et les antigènes immunitaires, différents processus pathogènes, y compris aigus, récurrents-rémittents ou chroniques, sont obtenus pour imiter diverses formes cliniques de SEP10,11,12. Les immunogènes pertinents couramment utilisés dans la construction des modèles EAE proviennent de protéines auto-SNC, telles que la protéine basique de myéline (MBP), la protéine protéolipide (PLP) ou la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG). Les souris SJL/L immunisées par MBP ou PLP développent une évolution cyclique récurrente-rémittente et le MOG déclenche une EAE progressive chronique chez les souris C57BL/611,12,13.

L’objectif principal du traitement modificateur de la maladie (DMT) est de minimiser les symptômes de la maladie et d’améliorer la fonction6. Plusieurs médicaments sont utilisés cliniquement pour soulager la SEP, mais aucun médicament n’a encore été utilisé pour la guérir complètement, révélant la nécessité d’un traitement synergique. Les souris C57BL / 6 sont actuellement les plus couramment utilisées pour construire des souris transgéniques, et dans ce travail, un modèle EAE induit par MOG35-55 chez les souris C57BL / 6J avec une échelle de 5 points a été utilisé pour surveiller la progression de la maladie. Les modèles EAE souffrent également d’humeurs anxieuses et de perte osseuse, ainsi que des lésions démyélinisantes largement connues. Ici, la méthode pour évaluer les symptômes de l’EAE à partir de perspectives multiples à l’aide d’un test en plein champ et d’une analyse de micro-tomodensitométrie (Micro-CT) est également décrite.

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Protocol

Le Comité de protection des animaux de l’Université de Tongji a approuvé le présent travail et toutes les directives en matière de soins aux animaux ont été suivies. Des souris C57BL / 6J mâles ou femelles âgées de 8 à 12 semaines ont été utilisées pour les expériences. On s’est assuré que l’âge et le sexe étaient les mêmes dans les groupes expérimentaux; sinon, la susceptibilité à la maladie a été affectée. Les souris ont été logées dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes avec des cycles alternés de lumière et d’obscurité de 12 h dans des conditions constantes (température ambiante 23 ± 1 °C, humidité 50% ± 10%), avec libre accès à la nourriture et à l’eau des souris.

1. Préparation de l’émulsion MOG35-55

  1. Ajouter Mycobacterium tuberculosis lyophilisé inactivé par la chaleur (MTB, H37Ra) pour compléter l’adjuvant de Freund (lui-même contenant 1 mg/mL de MTB inactivé par la chaleur, H37Ra), ce qui donne une concentration finale de MTB de 5 mg/mL (voir le tableau des matières).
    NOTE: Toute l’opération doit être terminée dans l’enceinte de biosécurité; N’ouvrez pas l’air soufflé.
  2. Dissoudre le peptide MOG35-55 lyophilisé (voir le tableau des matières) avec du phosphate tamponné salin (PBS) prérefroidi stérile (sans ions calcium et magnésium, pH 7,4) pour préparer la solution antigénique à la concentration de 2 mg/mL.
  3. Prenez un tube microcentrifuge propre de 2 ml et ajoutez une bille d’acier stérilisée de 5 mm (voir le tableau des matériaux) à chaque tube.
  4. Ajouter 500 μL d’adjuvant de Freund complet contenant 5 mg/mL de MTB et 500 μL de solution d’antigène MOG35-55 au tube microcentrifuge ci-dessus contenant une bille d’acier.
  5. Osciller le tube ci-dessus sur un TissueLyser (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min, refroidir sur de la glace pendant 10 min, et répéter quatre fois pour bien mélanger et finalement former une solution visqueuse blanche.
    REMARQUE: Une bonne émulsification est une étape clé dans la préparation de l’émulsion MOG35-55 , un mélange minutieux est donc nécessaire. Le TissueLyser est réglé sur une vitesse de 28 Hz.

2. Préparation de la toxine coqueluche (PTX)

  1. Préparer PTX avec ddH2O à une concentration de 100 μg/mL et conserver à 4 °C.
  2. Diluer la solution mère PTX 50 fois avec 1x PBS stérile (sans ions calcium et magnésium, pH 7,4) pour obtenir une solution de 200 ng/100 μL à utiliser.

3. Mise en place d’un modèle animal EAE

  1. Construire le modèle EAE en utilisant les souris C57BL/6J mâles ou femelles âgées de 8 à 12 semaines. S’assurer que les souris sont adéquatement acclimatées à l’environnement d’alimentation avant l’immunisation.
  2. Centrifuger l’émulsion MOG35-55 préparée (étape 1) à 4 °C pendant 2-3 s en appuyant sur le bouton Pulse de l’équipement (voir tableau des matériaux) pour précipiter toutes les émulsions au fond du tube.
    REMARQUE: L’émulsion MOG35-55 peut être conservée à -20 °C pendant plusieurs jours. Pour éviter l’échec du médicament, il est recommandé de l’utiliser dès que possible.
  3. Fixez une aiguille de 22 G à un baril de seringue de 1 mL, aspirez l’émulsion MOG 35-55 et transférez l’émulsion MOG35-55 dans un nouveau corps de seringue de 1 mL. Fixez la connexion entre le corps de la seringue de 1 mL et une aiguille de 26 G avec un film d’étanchéité (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: Évitez les bulles d’air lors du chargement de l’émulsion MOG35-55 dans des barils de seringue de 1 mL.
  4. Essuyez et désinfectez le site d’injection avec de l’éthanol à 70%.
  5. Injecter l’émulsion MOG35-55 par voie sous-cutanée de chaque côté de l’épine dorsale des souris, 100 μL de chaque côté. Observez la formation automatique de masses bulbeuses sous la peau du dos des souris une fois l’opération d’injection terminée.
    REMARQUE : Assurez-vous que des expérimentateurs expérimentés effectuent le processus d’immunisation et que l’injection se fait doucement et lentement pour minimiser la pression sur les souris.
  6. Injectez les souris ci-dessus par voie intrapéritonéale avec 100 μL de PTX (étape 2).
    REMARQUE : Le jour de la vaccination est le jour 0. Assurez-vous également que les souris peuvent être identifiées avec précision pour une évaluation quotidienne ultérieure, comme l’utilisation d’un marqueur de couleur sur la queue des souris.
  7. Injectez la même dose de PTX le jour 2 après la vaccination.
  8. Préparer un groupe de souris non immunisées en tant que souris de type sauvage (WT).

4. Surveillance clinique des souris

  1. Enregistrez quotidiennement le poids corporel des souris EAE et WT.
    REMARQUE: La gravité de l’EAE est positivement corrélée avec la perte de poids des souris, de sorte que le poids corporel est également un indice de surveillance très important.
  2. Surveiller l’état des souris de 0 à 21 jours après l’immunisation à l’aide du système de notation de 0 à 5 indiqué au tableau 1.
    REMARQUE: Les symptômes entre les deux sont comptés comme plus ou moins 0,5 points.

5. Test en champ ouvert

REMARQUE : Les animaux de laboratoire sélectionnés pour cette étape sont des souris EAE dans les périodes d’apparition précoce, de pic et de rémission. En outre, des souris WT ont été utilisées comme témoin. Il est à noter que toutes les souris ont été testées pour un comportement anxieux avant la modélisation afin d’exclure les souris souffrant de troubles anxieux pour la modélisation EAE. De plus, les souris EAE en période de pointe et de rémission avec incapacité motrice complète ont été exclues du test.

  1. Préparer une chambre de réaction en champ ouvert de 40 × 40 × 40 cm3 et un système d’analyse vidéo de l’activité de locomotion (champ ouvert) (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE: La caméra est installée dans une position qui recouvre complètement la boîte, la salle de réaction est uniformément éclairée et la salle de test doit être une zone calme.
  2. Placer les souris d’essai dans la salle d’essai pour l’habituation 1 h avant de commencer l’expérience.
  3. Vaporisez toute la zone avec de l’éthanol à 70% et essuyez avec une serviette en papier propre pour vous assurer que la chambre de réaction est propre avant de commencer le test.
  4. Retirez chaque souris individuellement de sa cage et placez-la dans le même coin de l’arène avant de commencer à explorer.
    REMARQUE: Le bas de la boîte est divisé en 16 grilles, dont la zone des quatre grilles du milieu est la zone centrale et la zone environnante est la zone périphérique.
  5. Cliquez sur le bouton Démarrer la capture dans la barre de menu du système d’analyse vidéo, enregistrez le temps et commencez la prise de vue.
  6. Restez silencieux dans la salle de test.
  7. Laissez la souris se déplacer librement pendant 5 minutes pendant le processus d’enregistrement.
  8. Arrêtez le système d’acquisition et enregistrez la vidéo.
  9. Sortez la souris de l’arène, remettez-la dans la cage et passez à la souris suivante.
    REMARQUE : Nettoyez la zone d’essai avec de l’éthanol à 70 % entre les cycles pour éliminer les odeurs et autres substances.
  10. Analysez les résultats à l’aide du système d’analyse vidéo.

6. Analyse du phénotype osseux

  1. Euthanasier les souris EAE et WT par luxation cervicale le 21e jour.
    REMARQUE : Le personnel qui effectue les opérations de luxation cervicale doit être bien formé pour minimiser la douleur endurée lors de la mort de l’animal.
  2. Faites reposer la souris à plat dans un plateau de dissection et fixez les extrémités.
  3. Tenez la peau du membre postérieur de la souris avec une pince et ouvrez la peau et le tissu musculaire de la souris avec des ciseaux.
  4. Séparez soigneusement le fémur du tibia et de l’os de la hanche avec des ciseaux.
  5. Enlevez le muscle adhérant au fémur avec des ciseaux et placez le fémur dans de l’éthanol à 70% à température ambiante.
  6. Scanner le fémur distal à l’aide d’un système micro-CT (voir le tableau des matériaux) avec une taille de voxel isotrope de 10 μm, avec une tension maximale du tube radiogène de 70 kV et une intensité de rayons X de 0,114 mA.
    REMARQUE: Un filtre gaussien 3D permet le débruitage d’images de seuil 2D.
  7. Analyser les 100 tranches scannées à partir de la tige fémorale moyenne pour mesurer les paramètres du fémur, y compris le volume osseux, le volume tissu, la densité minérale osseuse, la séparation trabéculaire, le nombre trabéculaire, la densité de connexion trabéculaire et l’épaisseur trabéculaire et corticale.
    NOTE: À partir de l’extrémité proximale de la plaque de croissance distale du fémur chez la souris, des sections complètement dépourvues de structures de calotte épiphysaire ont été trouvées et ont continué à s’étendre sur 100 tranches vers le fémur proximal, qui ont été tracées manuellement à plusieurs voxels de la surface corticale interne pour identifier les trabécules épiphysaires.
  8. Créez les reconstructions 3D en empilant des images 2D de seuil à partir de régions de contour dans le système micro-CT.

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Representative Results

Après immunisation des souris, le poids corporel des souris est enregistré quotidiennement et leurs symptômes cliniques sont évalués selon le protocole décrit ci-dessus (étape 4). Chez les souris C57BL / 6J immunisées avec le peptide MOG, parce que l’emplacement de la lésion est principalement confiné à la moelle épinière, la pathogenèse des souris EAE se propage de l’extrémité de la queue à la tête. Au début de la maladie, les souris EAE présentent une faiblesse et un affaissement de la queue, suivis d’une faiblesse des membres postérieurs, de mouvements non coordonnés et d’une paralysie. Au fur et à mesure que la maladie s’aggrave, elle se développe progressivement vers la faiblesse des membres antérieurs, la paralysie et, dans les cas graves, entraîne des difficultés à déplacer les souris et même près de la mort. Comme le montre la figure 1A, le diagramme d’état des souris présentant différents degrés de pathologie EAE représente une image exemplaire d’un groupe de souris passant de symptômes asymptomatiques à des symptômes EAE à score élevé (score 4). Il a également été mentionné précédemment que le poids corporel des souris EAE est corrélé avec les symptômes cliniques. Par rapport aux souris WT, la perte de poids chez les souris EAE peut commencer à se produire dans les premiers jours après la vaccination, tandis que les symptômes cliniques des souris EAE commencent généralement le jour 6-9 après la vaccination et atteindront un pic le jour 14-16. Après cela, les symptômes des souris EAE se rétablissent généralement partiellement et, en même temps, la perte de poids des souris sera atténuée (Figure 1B, C). Ainsi, l’évolution de l’apparition de l’EAE est généralement divisée en périodes d’apparition précoce, de pointe et de rémission, et la prédiction de ces points temporels est importante pour évaluer les paramètres de résultat. En général, pour analyser la production de cellules immunitaires et de cytokines sur le site des lésions EAE, les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière des souris EAE au pic de la maladie peuvent être isolées et traitées ultérieurement, ce qui peut être analysé par cytométrieen flux 14,15. Le tissu de la moelle épinière au plus haut niveau est également le plus approprié pour préparer la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) et la coloration bleue rapide Luxol pour étudier plus avant l’infiltration cellulaire inflammatoire et la démyélinisation de la moelle épinière14,16. Pour surveiller les changements dans le système immunitaire à différents moments d’apparition de l’EAE, la rate et les ganglions lymphatiques à un début précoce sont également des options essentielles17,18. De plus, les cellules de la rate ou des ganglions lymphatiques de souris EAE immunisées par MOG sont couramment utilisées pour construire des modèles de transfert, qui sont transférés à des souris receveuses après restimulation in vitro de MOG pour induire une immunisation passive des souris EAE18.

La SEP est une lésion démyélinisante inflammatoire auto-immune du système nerveux central caractérisée par une démyélinisation inflammatoire et une perte neuronale 2,3. Cette maladie s’accompagne généralement de comorbidités psychiatriques, telles que les troubles affectifs, dont le trouble anxieux est très fréquent chez les patients atteints de SEP, avec jusqu’à 30% des patients atteints de SEP souffrant d’anxiété 9,19. Le trouble anxieux est une anomalie psychiatrique caractérisée par un stress émotionnel excessif et de l’inquiétude. Le test en champ ouvert est souvent utilisé pour analyser les comportements anxieux chez les rongeurs20,21. Avec l’aide de l’analyse des comportements d’exploration des souris EAE dans des tests en plein champ pendant les périodes d’apparition précoce, de pic et de rémission, il a été constaté que les souris EAE avaient également des comportements anxieux similaires à ceux des patients atteints de SEP (Figure 2A). Dans le test en plein champ, les rongeurs anxieux ont tendance à avoir une activité réduite et un comportement stéréotypé accru, y compris une préférence pour être plus près des coins, un biais vers le domaine périphérique et un manque de désir d’explorer la zone centrale. Par rapport aux souris WT, les souris EAE avaient une distance de marche et un temps de mouvement significativement plus faibles au cours des trois périodes de la maladie, même au début de la maladie, lorsque les souris EAE n’avaient pas encore de déficience motrice (Figure 2B, C). De plus, les souris EAE passent beaucoup moins de distance et restent moins dans la zone centrale que les souris normales, et ne se déplacent même que dans la zone périphérique, montrant une humeur anxieuse évidente (Figure 2D,E). Les souris EAE présentent toujours une forte humeur anxieuse lorsque l’apparition est légère, c’est-à-dire une coordination motrice. Certaines études suggèrent que cela peut être attribué à une neuroinflammation légère, qui affecte en outre la sécrétion de neurotransmetteurs22,23. Des tests en plein champ surveillant les déclencheurs d’humeur anxiogènes chez les souris EAE pourraient aider les chercheurs à comprendre et à traiter les comorbidités psychiatriques liées à la SP.

Avec la progression de la maladie, la SEP finit essentiellement par se manifester par une dyskinésie. Des études ont montré que les patients atteints de SEP ont une plus grande susceptibilité à l’ostéoporose et aux fractures, principalement en raison de la perte de masse osseuse, et que la gravité de la dyskinésie est fortement corrélée à la densité osseuse du patient24,25. Un phénomène similaire peut être observé par analyse Micro-CT à l’aide du modèle animal EAE (Figure 3A,H). D’après les données d’analyse trabéculaire du fémur chez la souris, les souris EAE ont subi une diminution significative de la densité minérale osseuse (DMO) par rapport aux souris WT, ce qui est un indicateur important de la réponse à la solidité osseuse et une base importante pour le diagnostic de l’ostéoporose (Figure 3B). Une analyse plus approfondie a montré que la perte osseuse trabéculaire se produisait de manière significative chez les souris EAE par rapport aux souris WT saines et s’accompagnait d’une réduction de la densité de connexion trabéculaire, du nombre de trabéculaires et de l’épaisseur trabéculaire. Toutes ces caractéristiques sont caractéristiques de la réduction de la masse osseuse, ce qui suggère que l’EAE provoque également une perte osseuse trabéculaire dans le fémur des souris (Figure 3C-F). Dans le même temps, la morphologie structurelle des trabécules osseuses a changé et l’espacement des trabécules a considérablement augmenté; plus l’espacement est grand, plus l’os est ostéoporotique (Figure 3G). Cela est cohérent avec la notion selon laquelle les patients atteints de SEP sont sujets à l’ostéoporose. Dans les os corticaux de la diaphyse du fémur, l’épaisseur de l’os cortical dans le modèle EAE était significativement inférieure à celle des souris normales (Figure 3I). Dans la SEP, la diminution de la motilité et l’augmentation de la dystrophie musculaire sont fortement associées à l’ostéoporose, aux fractures et à l’augmentation de la résorption osseuse due à la réduction des forces mécaniques, ce qui diminue progressivement l’intégrité osseuse, augmentant ainsi le risque d’ostéoporose et de fracture26. L’analyse micro-CT du fémur chez les souris EAE peut bien surveiller la santé des os, et l’intervention est bénéfique pour contrôler l’état de l’EAE.

Figure 1
Figure 1 : Surveillance des symptômes cliniques de l’EAE. (A) L’image exemplaire des souris présentant différents degrés de pathologie EAE. (B) Changement de poids chez les souris WT et EAE. (C) Score clinique chez les souris WT et EAE. Les données sont données sous forme de moyenne ± MEB (n = 5), ***p < 0,001 par rapport aux souris WT, test ANOVA bidirectionnel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Comportement anxieux des souris EAE dans l’essai en plein champ. (A) Tracés représentatifs de l’essai en plein champ. Distance de déplacement (B), durée de l’activité (C), distance de déplacement au centre (D) et temps passé au centre (E) des souris WT et EAE dans les périodes d’apparition précoce, de pointe et de rémission. Les données sont des moyennes ± MEB (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 par rapport aux souris WT, test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyse micro-CT de la santé osseuse chez les souris EAE. (A) Images 3D représentatives de l’architecture trabéculaire fémorale (barres d’échelle, 100 μm). La densité minérale osseuse (B), le rapport volume osseux/volume tissulaire (C), la densité de connexion (D), le nombre (E), l’épaisseur (F) et la séparation (G) du trabéculaire fémoral ont été déterminés par analyse micro-CT. (H) Images 3D représentatives de l’os cortical (barres d’échelle, 100 μm). (I) Épaisseur corticale obtenue à partir de données de microtomodensitométrie. Les données sont des moyennes ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 par rapport aux souris WT, test t de Student. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Score Signe clinique
0 Aucun signe clinique
0.5 Faiblesse de la queue, chute de l’avant de la queue
1 Queue complètement paralysée
2 Paralysie légère des membres postérieurs (faiblesse des deux membres postérieurs ou paralysie unilatérale, marche non coordonnée, réponse au pincement)
3 Paralysie complète des membres postérieurs, des membres postérieurs qui traînent et marchent, des membres postérieurs qui ne répondent pas au pincement
4 Paralysie des membres postérieurs et faiblesse des membres antérieurs
5 Proche de la mort ou mourant

Tableau 1 : Système de notation clinique.

Antigène Filtrer Caractéristique Application Limitation
PLP SJL/J34 EAE cyclique Etude des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans la rechute clinique Limité aux réponses spécifiques aux lymphocytes T; L’étude de gènes et de voies spécifiques dans la souche SJL/J est un défi
Le SJL/J35 Paralysie récurrente suivie chez les receveurs partiels ou totaux après guérison d’une paralysie aiguë Étude de la neuroinflammation et de l’activation du système immunitaire Limité aux réponses spécifiques aux lymphocytes T; L’étude de gènes et de voies spécifiques dans la souche SJL/J est un défi
MOG35-55 C57BL/631 EAE progressive primaire; EAE chronique progressive Étude des mécanismes de lésions axonales; Étude des mécanismes moléculaires de la maladie dans des modèles transgéniques et knockout Les études de démyélinisation primaire et de régénération de la myéline sont d’une valeur limitée
Homogénat de moelle épinière Biozzi ABH36 EAE cyclique Étude de la régénération de la myéline et du traitement neuroprotecteur de la SP Non cliniquement progressif, avec accumulation de déficits neurologiques au fil du temps; Limité aux réponses spécifiques des lymphocytes T CD4
Virus de l’encéphalomyélite murine de Theiler Plusieurs souches de souris sont très sensibles, y compris SJL/J, SWR, PL/J12,31 Modèles viraux de démyélinisation inflammatoire Étude des lésions axonales et de la démyélinisation induite par l’inflammation Aucune infection virale spécifique à la SP n’a été identifiée; La régénération de la myéline est difficile à évaluer, la démyélinisation et la régénération de la myéline se produisent simultanément
Cuprizone Largement utilisé chez les souris C57BL/6, tandis que d’autres souches, telles que la souche CD1, sont moins sensibles aux dommages induits par la cuprizone de cuivre37,38 Modèle toxique de démyélinisation et de remyélinisation Étude de la démyélinisation indépendante des lymphocytes T, en particulier la régénération de la myéline et les processus de réparation de base de la myéline Une régénération spontanée importante de la myéline se produit après l’arrêt de la lésion toxique; La démyélinisation est spécifique à une région du cerveau et n’est pas utile pour étudier la démyélinisation de la moelle épinière
Lysolécithine SJL/J12, C57BL/639, etc. Modèle toxique de démyélinisation et de remyélinisation Étude de la démyélinisation indépendante des lymphocytes T, en particulier la régénération de la myéline et les processus de réparation de base de la myéline Absence de réponse immunitaire observée pendant la SEP
Bromure d’éthidium C57BL/640, etc. Modèle toxique de démyélinisation et de remyélinisation Etude des lésions démyélinisantes focales et prédiction de la cinétique de la démyélinisation et de la régénération de la myéline Le bromure d’éthidium endommage toutes les cellules contenant des nucléoles; Corrélation limitée avec la SEP

Tableau 2 : Différents modèles murins de SEP.

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Discussion

La SEP est une maladie inflammatoire démyélinisante du SNC et est l’un des troubles neurologiques les plus courants causant une invalidité chronique chez les jeunes, imposant un fardeau énorme aux familles et à la société 3,4. La SEP a toujours été classée comme une maladie auto-immune à médiation par les lymphocytes T spécifiques aux organes, incitant le système auto-immun à éroder lentement le SNC, ce qui impliquera plusieurs systèmes dans tout le corps27. Les symptômes cliniques typiques comprennent une déficience visuelle, des troubles moteurs, des troubles cognitifs et émotionnels, etc. 6,7. La SEP est une maladie dévastatrice qui s’aggravera progressivement si elle n’est pas traitée correctement, entraînant une cécité et une paralysie graves28. La pathogenèse de la SEP n’est pas encore entièrement comprise, car ses manifestations cliniques et sa progression pathologique sont hétérogènes, et les modèles animaux sont donc essentiels pour la recherche et le développement du traitement de la SEP.

Le modèle animal le plus fréquemment étudié pour la SEP est l’EAE, qui repose principalement sur deux méthodes de modélisation : l’immunisation active et l’immunisation passive29. Le premier est largement adopté en raison de sa simplicité, de son absence d’irradiation de souris et de son temps de cycle court. Le modèle immunitaire actif EAE induit des réponses auto-immunes dans le SNC en immunisant les rongeurs avec des antigènes d’auto-myéline ou leurs peptides ultérieurs, se manifestant généralement par une faiblesse de la queue et une paralysie des membres13. Plus précisément, le modèle EAE induit par MOG 35-55 chez les souris C57BL / 6J est caractérisé par des cycles alternés de rémission-rechute, accompagnés d’inflammation du SNC, de démyélinisation et de lésions axonales, ce qui fait de l’EAE induite par MOG35-55 le modèle préféré11,12. L’EAE peut être bien induite chez les souris sensibilisées par injection sous-cutanée de peptide MOG 35-55, émulsionnées avec un immunopotentialisateur CFA enrichi en MTB, et recevant une injection intrapéritonéale de PTX avec effet perturbateur de la barrière hémato-encéphalique aux jours0-2 30. Le plus grand défi du modèle EAE est la faible incidence des symptômes faibles, et plusieurs facteurs d’influence sont essentiels au déroulement de l’expérience. (1) L’âge et l’environnement des souris affecteront la sensibilité à l’EAE. Par conséquent, des souris du même âge doivent être sélectionnées avant l’expérience. Les souris doivent être pondérées et regroupées au hasard avant l’attribution de la cage, et le poids de chaque groupe doit être maintenu proche. Assurez-vous également que les conditions environnementales entre les expériences indépendantes sont comparables. (2) La concentration de PTX: Le rôle principal du PTX est d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, ce qui permet aux cellules T pathogènes d’entrer dans le SNC pour sécréter des cytokines pertinentes et favoriser la réponse inflammatoire, conduisant finalement à l’hydrolyse des protéines de myéline enveloppées dans la couche externe des axones nerveux. L’apparition de la maladie chez les souris EAE a été retardée avec la diminution de la concentration d’administration de PTX, et la gravité de la maladie serait affaiblie si le PTX diminuait de plus de 60%. (3) La dissolution de l’antigène MOG 35-55: Pour éviter la congélation et la décongélation, il est recommandé de se procurer l’antigène MOG35-55 lyophilisé dans des emballages séparés, 4 mg / tube, pour éviter la congélation et la décongélation. En outre, PTX est utilisé pour la dissolution au lieu de l’eau stérile car il est préférable d’émulsionner avec CFA en utilisant PTX. (4) L’antigène MOG35-55 et le CFA doivent être suffisamment émulsionnés en oscillant pour former une structure eau dans huile, et les gouttelettes d’émulsion ne se dispersent pas longtemps à la surface de l’eau, ce qui indique une bonne émulsification. (5) L’injection en deux points a été utilisée pour la modélisation de l’EAE chez la souris. Le site d’injection est de préférence situé au-dessus de la taille et au-dessous du cou, près de la colonne vertébrale, pour éviter que les souris ne léchent et ne mordent la peau, entraînant le déversement d’émulsion MOG35-55.

Cependant, le modèle EAE induit par l’antigène MOG35-55 présente encore certaines limites. En tant que modèle d’encéphalopathie inflammatoire de lésion axonale primaire médiée par les lymphocytes T CD4, la lésion principale est une dégénérescence axonale massive avec démyélinisation secondaire et moins de démyélinisation primaire, ce qui est différent de la pathologie de la SEP31,32,33. Le modèle EAE induit par MOG35-55 reflète principalement la réponse immunitaire entraînée par les lymphocytes T CD4, tandis que d’autres cellules immunitaires telles que les lymphocytes T CD8 et B n’ont pas un fort sentiment de participation à ce modèle31. Un autre facteur limitant est que l’EAE induite par MOG35-55 a un certain biais en faveur de la composante immunologique de la physiopathologie de la SEP, et d’autres modèles animaux peuvent être pris en compte lors de l’examen d’études axées sur les pathologies du SNC, telles que l’étude des processus de démyélinisation et de régénération de la myéline 34,35,36,37,38,39,40, comme décrit dans le tableau 2 .

L’EAE est un prédicteur efficace pour imiter les propriétés auto-immunes de la SEP, ainsi que son mécanisme d’inflammation et de démyélinisation12, ce qui rend de nombreux chercheurs désireux d’étudier ses mécanismes immunomodulateurs, ignorant les autres symptômes cliniques de la SEP. Des études ont montré que l’anxiété associée à la SEP est attribuée à des processus physiopathologiques tels que la dysrégulation immunitaire et l’inflammation cérébrale22, 23,41. Les problèmes de santé mentale, comme l’anxiété, sont particulièrement fréquents chez les personnes atteintes de SP, et le trouble anxieux peut nuire à l’exécution des tâches quotidiennes de base et affecter considérablement la qualité de vie42,43. Les altérations de la capacité locomotrice des souris EAE peuvent prédire des altérations des processus neuronaux. Dans les expériences en plein champ, des comportements anxieux se sont produits chez les souris EAE, y compris une diminution des comportements exploratoires qui ont commencé l’apparition précoce de la maladie (essentiellement, des sujets testés avec des scores cliniques <0,5 et une capacité locomotrice presque aussi bonne que les souris normales), suggérant que l’apparition de comportements anxieux précède la déficience motrice. De plus, les souris EAE dans la période de rémission n’ont pas amélioré le comportement anxieux avec une capacité motrice accrue. L’émergence de la réponse inflammatoire peut être responsable de la déficience mentale chez les souris EAE par l’activité neuronale, entraînant des changements d’humeur, et la régulation positive des niveaux de cytokines inflammatoires interfère avec la fonction synaptique striatale avant l’apparition de la déficience motrice23,41. Cependant, l’essai en plein champ nécessite une attention particulière au fait que la salle d’essai doit être une zone calme et que les souris d’essai doivent s’acclimater à la pièce pendant 1 h à l’avance pour éviter une pression excessive causée par le nouvel environnement. Un nettoyage supplémentaire à l’éthanol est nécessaire entre les tests pour éliminer les odeurs et autres substances laissées par le dernier sujet d’essai. La principale limitation du test en champ ouvert est l’interférence causée par le dysfonctionnement moteur chez les souris EAE, et le test d’évaluation du comportement anxieux des rongeurs est basé sur la distance, le temps et la gamme de l’activité des rongeurs dans la chambre de réaction, et ne peut exclure l’effet du dysfonctionnement moteur sur le comportement anxieux. Par conséquent, les études futures doivent prendre en compte l’altération locomotrice.

Les méthodes traditionnelles d’analyse des études liées au tissu osseux utilisent souvent la microscopie bidimensionnelle de la coupe osseuse, qui peut avoir plus de difficultés à analyser la morphologie structurale, la distribution de la densité, la distribution de l’orientation et d’autres caractéristiques en raison de l’influence des plans bidimensionnels et de l’inhomogénéité des échantillons biologiques. De nombreuses études ont confirmé la précision et l’efficacité du système Micro-CT pour décrire la morphologie osseuse, et de nombreuses études44,45,46 ont confirmé les résultats de détection de la microstructure. L’imagerie tridimensionnelle du tissu osseux par Micro-CT permet d’obtenir des résultats d’histomorphométrie osseuse plus intuitifs et plus précis. Il a été réalisé pour scanner de petits animaux et des spécimens sans exécuter l’animal ou endommager l’échantillon de tissu, ce qui permet d’obtenir des informations détaillées sur la structure spatiale tridimensionnelle à l’intérieur du tissu44. Des études ont montré que les patients atteints de SEP sont sujets à la perte de masse osseuse et à l’ostéoporose24,25; En scannant et en imageant le fémur de souris EAE avec un système Micro-CT, une détérioration évidente de la microarchitecture osseuse et une diminution de la résistance osseuse ont pu être observées dans le fémur de souris EAE par rapport aux souris WT qui avaient développé l’ostéoporose. L’analyse micro-CT est relativement simple à effectuer et relativement peu coûteuse, et l’imagerie en direct Micro-CT peut être utilisée pour surveiller la santé osseuse à l’avenir lors de l’administration d’un traitement à des souris EAE. Cependant, l’inconvénient est l’absence de marqueurs de renouvellement osseux évalués par des échantillons de sang ou une histomorphométrie osseuse pour observer des changements fondamentaux dans l’homéostasie métabolique osseuse chez les souris EAE47. La régulation des ostéoblastes et des ostéoclastes pourrait être envisagée dans le cadre de l’étude à l’avenir.

La SEP est une maladie à symptômes multiples, et le seul but de la gestion de la maladie est de minimiser les symptômes de la maladie. Dans le protocole mentionné ci-dessus, les symptômes cliniques de la SEP peuvent être simulés en construisant le modèle EAE induit par MOG35-55 . Les souris EAE ont présenté des symptômes cliniques de dysfonctionnement moteur et de comportement anxieux, ainsi que d’ostéoporose. Le système de notation en 5 points, le test en champ ouvert et l’analyse Micro-CT décrits dans ce protocole peuvent surveiller les symptômes pathologiques des souris EAE sous plusieurs angles et fournir un schéma de référence pour le traitement de l’EAE. En l’absence de médicaments modificateurs de la maladie efficaces, une combinaison potentielle de thérapie synergique peut fournir la meilleure occasion de soulager les symptômes et d’améliorer la fonction.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le soutien de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) et du State Key Laboratory of Drug Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

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Induction et divers indicateurs d’évaluation de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale
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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).

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