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Biology

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/63866
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1
1Putuo People's Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University
* These authors contributed equally

Summary

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Abstract

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune típica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por infiltración inflamatoria, desmielinización y daño axonal. Actualmente, no existen medidas para curar la EM por completo, pero hay múltiples terapias modificadoras de la enfermedad (DMT) disponibles para controlar y mitigar la progresión de la enfermedad. Existen similitudes significativas entre las características patológicas del SNC de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y los pacientes con EM. EAE se ha utilizado ampliamente como modelo representativo para determinar la eficacia de los fármacos para la EM y explorar el desarrollo de nuevas terapias para la enfermedad de la EM. La inducción activa de EAE en ratones tiene un efecto estable y reproducible y es particularmente adecuada para estudiar los efectos de fármacos o genes sobre la neuroinflamación autoinmune. El método de inmunización de ratones C57BL / 6J con glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG35-55) y la evaluación diaria de los síntomas de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica se comparte principalmente. Dada la compleja etiología de la EM con diversas manifestaciones clínicas, el sistema de puntuación clínica existente no puede satisfacer la evaluación del tratamiento de la enfermedad. Para evitar las deficiencias de una sola intervención, se crean nuevos indicadores para evaluar la EAE basados en las manifestaciones clínicas de estados de ánimo similares a la ansiedad y la osteoporosis en pacientes con EM para proporcionar una evaluación más completa del tratamiento de la EM.

Introduction

Las enfermedades autoinmunes son un espectro de trastornos causados por la respuesta inmune del sistema inmune a sus propios antígenos que resultan en daño o disfunción tisular1. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica de polineuropatía en el sistema nervioso central (SNC), caracterizada por infiltración inflamatoria, desmielinización y degeneración axonal neuronal 2,3. En la actualidad, la EM ha afectado a hasta 2,5 millones de personas en todo el mundo, en su mayoría jóvenes y de mediana edad de entre 20 y 40 años, que a menudo son la columna vertebral de sus familias y de la sociedad. Esto ha causado un impacto y daño considerable a las familias y a la sociedad 2,4.

La EM es una enfermedad multifactorial con manifestaciones clínicas diversas y complejas. Además de los trastornos neurológicos clásicos caracterizados por infiltración inflamatoria y desmielinización, la EM a menudo muestra discapacidad visual, discinesia de las extremidades y trastornos cognitivos y emocionales 5,6,7. Si los pacientes con EM no reciben el tratamiento adecuado y correcto, la mitad de ellos vivirá en sillas de ruedas después de 20 años, y casi la mitad de ellos experimentará síntomas depresivos y de ansiedad, lo que llevará a niveles mucho más altos de ideación suicida que la población general 8,9.

A pesar de un largo período de investigación, la etiología de la EM sigue siendo difícil de alcanzar, y la patogénesis de la EM aún no se ha dilucidado. Los modelos animales de EM han permitido servir como herramientas de prueba para explorar el desarrollo de enfermedades y nuevos enfoques terapéuticos, a pesar de las diferencias significativas entre los sistemas inmunológico roedor y humano, mientras que al mismo tiempo comparten algunos principios básicos. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es actualmente el modelo animal ideal para estudiar la EM, que utiliza la inmunidad a los autoantígenos de las proteínas de mielina para inducir la autoinmunidad a los componentes del SNC en ratones susceptibles, con la adición de adyuvante completo de Freund (CFA) y toxina pertussis (PTX) para mejorar la respuesta inmune humoral. Dependiendo de los antecedentes genéticos y los antígenos inmunes, se obtienen diferentes procesos de la enfermedad, incluidos los agudos, recurrentes-remitentes o crónicos, para imitar varias formas clínicas de EM10,11,12. Los inmunógenos relevantes comúnmente utilizados en la construcción de modelos EAE provienen de proteínas auto-SNC, como la proteína básica de mielina (MBP), la proteína proteolípida (PLP) o la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG). Los ratones SJL/L inmunizados con MBP o PLP desarrollan un curso recurrente-remitente, y MOG desencadena EAE progresiva crónica en ratones C57BL / 611,12,13.

El objetivo principal de la terapia modificadora de la enfermedad (DMT) es minimizar los síntomas de la enfermedad y mejorar la función6. Varios medicamentos se usan clínicamente para aliviar la EM, pero aún no se ha utilizado ningún medicamento para curarla por completo, lo que revela la necesidad de un tratamiento sinérgico. Los ratones C57BL/6 son actualmente los más utilizados para construir ratones transgénicos, y en este trabajo se utilizó un modelo EAE inducido por MOG35-55 en ratones C57BL/6J con una escala de 5 puntos para monitorizar la progresión de la enfermedad. Los modelos EAE también sufren de estados de ánimo similares a la ansiedad y pérdida ósea, y las lesiones desmielinizantes ampliamente conocidas. Aquí también se describe el método para evaluar los síntomas de EAE desde múltiples perspectivas mediante prueba de campo abierto y análisis de microtomografía computarizada (Micro-CT).

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Protocol

El Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Tongji aprobó el presente trabajo y se siguieron todas las pautas de cuidado de los animales. Se utilizaron ratones machos o hembras C57BL / 6J entre 8-12 semanas de edad para los experimentos. Se aseguró que la edad y el sexo fueran los mismos en los grupos experimentales; de lo contrario, la susceptibilidad a la enfermedad se vio afectada. Los ratones fueron alojados en un ambiente específico libre de patógenos con ciclos alternos de luz y oscuridad de 12 h en condiciones constantes (temperatura ambiente 23 ± 1 ° C, humedad 50% ± 10%), con libre acceso a comida y agua para ratones.

1. Preparación de la emulsión MOG35-55

  1. Agregue Mycobacterium tuberculosis liofilizada inactivada por calor (MTB, H37Ra) para completar el adyuvante de Freund (que contiene 1 mg / ml de MTB inactivado por calor, H37Ra), lo que resulta en una concentración final de MTB de 5 mg / ml (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Toda la operación debe completarse en el gabinete de bioseguridad; No abra el aire que sopla.
  2. Disuelva el péptido liofilizado MOG35-55 (ver Tabla de materiales) con solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril preenfriada (sin iones de calcio y magnesio, pH 7.4) para preparar la solución de antígeno a la concentración de 2 mg / ml.
  3. Tome un tubo de microcentrífuga limpio de 2 ml y agregue una bola de acero esterilizada de 5 mm (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo.
  4. Añadir 500 μL de adyuvante completo de Freund que contenga 5 mg/ml de MTB y 500 μL de solución de antígeno MOG35-55 al tubo de microcentrífuga anterior que contenga una bola de acero.
  5. Oscile el tubo anterior en un TissueLyser (consulte la Tabla de materiales) durante 10 minutos, enfríe en hielo durante 10 minutos y repita cuatro veces para mezclarlo bien y finalmente formar una solución viscosa blanca.
    NOTA: Una buena emulsificación es un paso clave en la preparación de la emulsión MOG35-55 , por lo que se requiere una mezcla completa. El TissueLyser está ajustado a una velocidad de 28 Hz.

2. Preparación de la toxina de la tos ferina (PTX)

  1. Preparar PTX conddH2Oen una concentración de 100 μg/ml y almacenar a 4 °C.
  2. Diluir la solución madre de PTX 50 veces con 1x PBS estéril (sin iones de calcio y magnesio, pH 7,4) para obtener una solución de 200 ng/100 μL para su uso.

3. Establecimiento del modelo animal EAE

  1. Construir el modelo EAE utilizando ratones machos o hembras C57BL/6J machos o hembras de 8-12 semanas de edad. Asegúrese de que los ratones estén adecuadamente aclimatados al entorno de alimentación antes de la inmunización.
  2. Centrifugar la emulsión MOG35-55 preparada (paso 1) a 4 °C durante 2-3 s pulsando el botón de pulso del equipo (ver Tabla de materiales) para precipitar todas las emulsiones en el fondo del tubo.
    NOTA: La emulsión MOG35-55 se puede almacenar a -20 °C durante varios días. Para evitar el fracaso del medicamento, se recomienda usarlo lo antes posible.
  3. Conecte una aguja de 22 G al cilindro de una jeringa de 1 ml, aspire la emulsión MOG 35-55 y transfiera la emulsión MOG35-55 a un nuevo cilindro de jeringa de 1 ml. Asegure la conexión entre el cilindro de la jeringa de 1 ml y una aguja de 26 G con película de sellado (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Evite las burbujas de aire al cargar la emulsión MOG35-55 en barriles de jeringa de 1 ml.
  4. Limpie y desinfecte el lugar de inyección con etanol al 70%.
  5. Inyecte la emulsión MOG35-55 por vía subcutánea a cada lado de la columna dorsal de los ratones, 100 μL en cada lado. Observe la formación automática de masas bulbosas debajo de la piel del dorso de los ratones después de que se complete la operación de inyección.
    NOTA: Asegúrese de que los experimentadores experimentados realicen el proceso de inmunización y que la inyección se realice suave y lentamente para minimizar la presión sobre los ratones.
  6. Inyecte los ratones anteriores por vía intraperitoneal con 100 μL de PTX (paso 2).
    NOTA: El día de la inmunización es el día 0. Además, asegúrese de que los ratones puedan identificarse con precisión para una evaluación diaria posterior, como el uso de un marcador de color en la cola de los ratones.
  7. Inyecte la misma dosis de PTX el día 2 después de la inmunización.
  8. Prepare un grupo de ratones no inmunizados como ratones de tipo salvaje (WT).

4. Monitorización clínica de ratones

  1. Registre diariamente el peso corporal de los ratones EAE y WT.
    NOTA: La gravedad de EAE se correlaciona positivamente con la pérdida de peso de los ratones, por lo que el peso corporal también es un índice de monitorización muy importante.
  2. Monitorear el estado de los ratones de 0 a 21 días después de la inmunización utilizando el sistema de puntuación de 0 a 5 que figura en la Tabla 1.
    NOTA: Los síntomas intermedios se cuentan como más o menos 0.5 puntos.

5. Prueba de campo abierto

NOTA: Los animales experimentales seleccionados para este paso son ratones EAE en los períodos de inicio temprano, pico y remisión. Además, se utilizaron ratones WT como control. Cabe señalar que todos los ratones fueron probados para el comportamiento similar a la ansiedad antes del modelado para excluir a los ratones con trastornos de ansiedad para el modelado EAE. Además, los ratones EAE en períodos pico y de remisión con incapacidad motora completa fueron excluidos de la prueba.

  1. Prepare una cámara de reacción de campo abierto de 40 × 40 × 40cm3 y un sistema de análisis de video de actividad de locomoción (campo abierto) (ver Tabla de materiales).
    NOTA: La cámara está instalada en una posición que cubre completamente la caja, la sala de reacción está iluminada uniformemente y se requiere que la sala de pruebas sea un área silenciosa.
  2. Coloque los ratones de prueba en la sala de prueba para la habituación 1 h antes de comenzar el experimento.
  3. Rocíe toda el área con etanol al 70% y limpie con una toalla de papel limpia para asegurarse de que la cámara de reacción esté limpia antes de comenzar la prueba.
  4. Retire cada ratón individualmente de su jaula y colóquelo en la misma esquina de la arena antes de comenzar a explorar.
    NOTA: La parte inferior de la caja se divide en 16 cuadrículas, de las cuales el área de las cuatro cuadrículas centrales es el área central y el área circundante es el área periférica.
  5. Haga clic en el botón Iniciar captura en la barra de menú del sistema de análisis de video, grabe el tiempo y comience a disparar.
  6. Manténgase en silencio en la sala de pruebas.
  7. Deje que el ratón se mueva libremente durante 5 minutos durante el proceso de grabación.
  8. Detenga el sistema de adquisición y guarde el video.
  9. Saque el ratón de la arena, vuelva a colocarlo en la jaula y proceda al siguiente ratón.
    NOTA: Limpie el área de prueba con etanol al 70% entre series para eliminar olores y otras sustancias.
  10. Analice los resultados utilizando el sistema de análisis de video.

6. Análisis del fenotipo óseo

  1. Eutanasia de los ratones EAE y WT por luxación cervical en el día 21.
    NOTA: El personal que realiza operaciones de luxación cervical debe estar bien capacitado para minimizar el dolor soportado durante la muerte del animal.
  2. Haga que el ratón se acueste en una bandeja de disección y fije las extremidades.
  3. Sostenga la piel de la extremidad posterior del ratón con fórceps y abra la piel del ratón y el tejido muscular con tijeras.
  4. Separe el fémur de la tibia y el hueso de la cadera cuidadosamente con tijeras.
  5. Retire el músculo adherido al fémur con tijeras y coloque el fémur en etanol al 70% a temperatura ambiente.
  6. Escanear el fémur distal utilizando un sistema de micro-TC (ver Tabla de materiales) con un tamaño de vóxel isotrópico de 10 μm, con un voltaje máximo del tubo de rayos X de 70 kV y una intensidad de rayos X de 0.114 mA.
    NOTA: Un filtro gaussiano 3D permite eliminar ruido de imágenes de umbral 2D.
  7. Analice los 100 cortes escaneados del eje femoral medio para medir los parámetros del fémur, incluido el volumen óseo, el volumen del tejido, la densidad mineral ósea, la separación trabecular, el número trabecular, la densidad de conexión trabecular y el grosor trabecular y cortical.
    NOTA: A partir del extremo proximal de la placa de crecimiento del fémur distal en ratones, se encontraron secciones completamente desprovistas de estructuras de tapa epifisaria y continuaron extendiéndose 100 cortes hacia el fémur proximal, que fueron contornos delineados manualmente en varios vóxeles lejos de la superficie cortical interna para identificar las trabéculas epifisarias.
  8. Cree las reconstrucciones 3D apilando imágenes 2D de umbral de regiones de contorno en el sistema micro-CT.

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Representative Results

Después de la inmunización de los ratones, el peso corporal de los ratones se registra diariamente y sus síntomas clínicos se evalúan de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente (paso 4). En ratones C57BL / 6J inmunizados con péptido MOG, debido a que la ubicación de la lesión se limita principalmente a la médula espinal, la patogénesis de los ratones EAE se propaga desde el extremo de la cola hasta la cabeza. Al comienzo de la enfermedad, los ratones EAE presentan debilidad y caída de la cola, seguidas de debilidad de las extremidades posteriores, movimiento descoordinado y parálisis. A medida que la enfermedad empeora, gradualmente se convierte en debilidad de las extremidades anteriores, parálisis y, en casos graves, causa dificultad para mover a los ratones e incluso cerca de la muerte. Como se muestra en la Figura 1A, el diagrama de estado de los ratones con diferentes grados de patología EAE representa una imagen ejemplar de un grupo de ratones que cambian de síntomas asintomáticos a EAE de alta puntuación (puntuación 4). También se ha mencionado anteriormente que el peso corporal de los ratones EAE se correlaciona con los síntomas clínicos. En comparación con los ratones WT, la pérdida de peso en ratones EAE puede comenzar a ocurrir en los primeros días después de la inmunización, mientras que los síntomas clínicos de los ratones EAE generalmente comienzan en el día 6-9 después de la inmunización y alcanzarán un pico en el día 14-16. Después de esto, los síntomas de los ratones EAE generalmente se recuperan parcialmente y, al mismo tiempo, se aliviará la pérdida de peso de los ratones (Figura 1B, C). Por lo tanto, el curso del inicio de la EAE generalmente se divide en períodos de inicio temprano, pico y remisión, y la predicción de estos puntos de tiempo es importante para evaluar los parámetros de resultado. En general, para analizar la producción de células inmunes y citoquinas en el sitio de las lesiones EAE, las células inmunes en el cerebro y la médula espinal de ratones EAE en el pico de la enfermedad pueden aislarse y procesarse adicionalmente, lo que puede analizarse mediante citometría de flujo14,15. El tejido de la médula espinal en el inicio máximo también es más adecuado para preparar la tinción de hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción azul rápida de Luxol para investigar más a fondo la infiltración de células inflamatorias y la desmielinización de la médula espinal14,16. Para monitorizar los cambios en el sistema inmunitario en diferentes momentos de inicio de la EAE, el bazo y los ganglios linfáticos de inicio temprano también son opciones esenciales17,18. Además, las células del bazo o los ganglios linfáticos de ratones EAE inmunizados con MOG se utilizan comúnmente para construir modelos de transferencia, que se transfieren a ratones receptores después de la reestimulación de MOG in vitro para inducir la inmunización pasiva de ratones EAE18.

El SM es una lesión desmielinizante autoinmune inducida inflamatoria del sistema nervioso central caracterizada por desmielinización inflamatoria y pérdida neuronal 2,3. Esta enfermedad suele ir acompañada de comorbilidades psiquiátricas, como trastornos afectivos, de los cuales el trastorno de ansiedad es muy común en pacientes con EM, con hasta un 30% de los pacientes con EM que sufren de ansiedad 9,19. El trastorno de ansiedad es una anomalía psiquiátrica caracterizada por estrés emocional excesivo y preocupación. La prueba de campo abierto se utiliza a menudo para analizar los comportamientos de ansiedad en roedores20,21. Con la ayuda del análisis de los comportamientos de exploración de los ratones EAE en pruebas de campo abierto durante los períodos de inicio temprano, pico y remisión, se encontró que los ratones EAE también tenían comportamientos similares a la ansiedad similares a los de los pacientes con EM (Figura 2A). En la prueba de campo abierto, los roedores ansiosos tienden a tener una actividad reducida y un mayor comportamiento estereotípico, incluida la preferencia por estar más cerca de las esquinas, un sesgo hacia el dominio periférico y una falta de deseo de explorar el área central. En comparación con los ratones WT, los ratones EAE tuvieron una distancia de caminata y un tiempo de movimiento significativamente más bajos en los tres períodos de la enfermedad, incluso en el inicio temprano de la enfermedad cuando los ratones EAE aún no tenían un deterioro motor (Figura 2B, C). Además, los ratones EAE pasan significativamente menos distancia y permanecen en el área central menos que los ratones normales, e incluso se mueven solo en el área periférica, mostrando un estado de ánimo obvio similar a la ansiedad (Figura 2D, E). Los ratones EAE todavía exhiben un fuerte estado de ánimo similar a la ansiedad cuando el inicio es leve, es decir, la coordinación motora. Algunos estudios sugieren que esto puede ser atribuido a la neuroinflamación leve, que afecta aún más la secreción de neurotransmisores22,23. Las pruebas de campo abierto que monitorean los desencadenantes del estado de ánimo similares a la ansiedad en ratones EAE podrían ayudar a los investigadores a comprender y tratar las comorbilidades psiquiátricas de la EM.

Con el progreso de la enfermedad, la EM esencialmente se manifiesta como discinesia. Estudios han encontrado que los pacientes con EM tienen una mayor susceptibilidad a la osteoporosis y fractura, principalmente debido a la pérdida de masa ósea, y que la gravedad de la discinesia está fuertemente correlacionada con la densidad ósea del paciente24,25. Un fenómeno similar se puede observar mediante análisis Micro-CT con la ayuda del modelo animal EAE (Figura 3A, H). A partir de los datos de análisis trabecular de fémur en ratones, los ratones EAE experimentaron una disminución significativa de la densidad mineral ósea (DMO) en comparación con los ratones WT, lo que es un indicador importante de la respuesta a la resistencia ósea y una base importante para el diagnóstico de osteoporosis (Figura 3B). Un análisis adicional mostró que la pérdida ósea trabecular ocurrió significativamente en ratones EAE en comparación con ratones WT sanos y se acompañó de una reducción en la densidad de conexión trabecular, el número trabecular y el grosor trabecular. Todos estos son característicos de la reducción de la masa ósea, lo que sugiere que EAE también causa pérdida ósea trabecular en el fémur de ratones (Figura 3C-F). Al mismo tiempo, la morfología estructural de las trabéculas óseas cambió, y el espaciamiento de las trabéculas aumentó significativamente; cuanto mayor es el espaciamiento, más osteoporótico es el hueso (Figura 3G). Esto es consistente con la noción de que los pacientes con EM son propensos a la osteoporosis. En los huesos corticales de la diáfisis del fémur, el grosor del hueso cortical en el modelo EAE fue significativamente menor que en ratones normales (Figura 3I). En la EM, la disminución de la motilidad y el aumento de la distrofia muscular están fuertemente asociados con la osteoporosis, fractura y aumento de la resorción ósea debido a la reducción de las fuerzas mecánicas, disminuyendo gradualmente la integridad ósea, aumentando así el riesgo de osteoporosis y fractura26. El análisis micro-CT del fémur en ratones EAE puede controlar bien la salud ósea, y la intervención es beneficiosa para controlar la condición de EAE.

Figure 1
Figura 1: Monitorización de los síntomas clínicos de EAE. (A) La imagen ejemplar de los ratones con diferentes grados de patología EAE. (B) Cambio de peso en ratones WT y EAE. (C) Puntuación clínica en ratones WT y EAE. Los datos se dan como media ± SEM (n = 5), ***p < 0,001 versus ratones WT, prueba ANOVA de dos vías. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Comportamiento similar a la ansiedad de ratones EAE en la prueba de campo abierto. (A) Parcelas representativas de la prueba de campo abierto. Distancia de viaje (B), duración de la actividad (C), distancia de viaje en el centro (D) y tiempo pasado en el centro (E) de ratones WT y ratones EAE en períodos de inicio temprano, pico y remisión. Los datos son media ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus ratones WT, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis micro-CT de la salud ósea en ratones EAE. (A) Imágenes 3D representativas de la arquitectura trabecular femoral (barras de escala, 100 μm). La densidad mineral ósea (B), la relación volumen óseo/volumen tisular (C), la densidad de conexión (D), los números (E), el grosor (F) y la separación (G) del trabecular femoral se determinaron mediante análisis de micro-TC. (H) Imágenes 3D representativas del hueso cortical (barras de escala, 100 μm). (I) Grosor cortical obtenido a partir de datos de tomografía microcomputarizada. Los datos son media ± SEM (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus ratones WT, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Puntuación Signo clínico
0 Sin signos clínicos
0.5 Debilidad de la cola, parte delantera de la cola que cae
1 Cola completamente paralizada
2 Parálisis leve de las extremidades posteriores (debilidad de ambas extremidades posteriores o parálisis unilateral, marcha descoordinada, respuesta al pellizco)
3 Parálisis completa de las extremidades posteriores, extremidades posteriores arrastrando y caminando, extremidades posteriores que no responden al pellizco
4 Parálisis de las extremidades posteriores y debilidad de las extremidades anteriores
5 Cerca de la muerte o morir

Tabla 1: Sistema de puntuación clínica.

Antígeno Colar Característica Aplicación Limitación
PLP SJL/J34 EAE recurrente-remitente Estudio de los eventos celulares y moleculares implicados en la recaída clínica Limitado a respuestas específicas de células T; Estudiar genes y vías específicas en la cepa SJL / J es un desafío
MBP SJL/J35 Parálisis recidivante seguida en receptores parciales o totales después de la recuperación de la parálisis aguda Estudio de la neuroinflamación y la activación del sistema inmune Limitado a respuestas específicas de células T; Estudiar genes y vías específicas en la cepa SJL / J es un desafío
MOG35-55 C57BL/631 EAE primaria progresiva; EAE crónica progresiva Estudio de los mecanismos de daño axonal; Estudio de mecanismos moleculares de enfermedades en modelos transgénicos y knockout Los estudios de desmielinización primaria y regeneración de mielina tienen un valor limitado
Homogeneizado de la médula espinal Biozzi ABH36 EAE recurrente-remitente Estudio de la regeneración de mielina y terapia neuroprotectora para la EM No clínicamente progresivo, con acumulación de déficits neurológicos a lo largo del tiempo; Limitado a respuestas específicas de células T CD4
Virus de la encefalomielitis murina de Theiler Múltiples cepas de ratones son altamente susceptibles, incluyendo SJL/J, SWR, PL/J12,31 Modelos virales de desmielinización inflamatoria Estudio de la lesión axonal y la desmielinización inducida por inflamación No se han identificado infecciones virales específicas de EM; La regeneración de mielina es difícil de evaluar, la desmielinización y la regeneración de mielina ocurren simultáneamente
Cuprizone Ampliamente utilizado en ratones C57BL/6, mientras que otras cepas, como la cepa CD1, son menos susceptibles al daño inducido por cuprizona de cobre37,38 Modelo tóxico de desmielinización y remielinización Estudio de la desmielinización independiente de las células T, especialmente la regeneración de mielina y los procesos básicos de reparación de la mielina La regeneración espontánea significativa de la mielina ocurre después del cese de la lesión tóxica; La desmielinización es específica de la región cerebral y no es útil para estudiar la desmielinización de la médula espinal
Lisolecitina SJL/J12, C57BL/639, etc. Modelo tóxico de desmielinización y remielinización Estudio de la desmielinización independiente de las células T, especialmente la regeneración de mielina y los procesos básicos de reparación de la mielina Falta de respuesta inmune observada durante la EM
Bromuro de etidio C57BL/640, etc. Modelo tóxico de desmielinización y remielinización Estudio de lesiones desmielinizantes focales y predicción de la cinética de desmielinización y regeneración de mielina El bromuro de etidio daña todas las células que contienen nucléolos; Correlación limitada con la EM

Tabla 2: Diferentes modelos de ratón de EM.

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Discussion

El SM es una enfermedad inflamatoria desmielinizante del SNC y es uno de los trastornos neurológicos más comunes que causan discapacidad crónica en los jóvenes, imponiendo una gran carga a las familias y a la sociedad 3,4. La EM siempre ha sido clasificada como una enfermedad autoinmune mediada por células T específicas de órganos, induciendo al sistema autoinmune a erosionar lentamente el SNC, lo que involucrará múltiples sistemas en todo el cuerpo27. Los síntomas clínicos típicos incluyen discapacidad visual, trastornos motores, trastornos cognitivos y emocionales, etc. 6,7. La EM es una enfermedad devastadora que empeorará progresivamente si no se trata adecuadamente, lo que lleva a la ceguera severa y parálisis28. La patogénesis de la EM aún no se comprende completamente, ya que sus manifestaciones clínicas y progresión patológica son heterogéneas y, por lo tanto, los modelos animales son esenciales para la investigación y el desarrollo del tratamiento de la EM.

El modelo animal más frecuentemente estudiado para la EM es EAE, que tiene principalmente dos métodos de modelado: inmunización activa e inmunización pasiva29. El primero es ampliamente adoptado debido a su simplicidad, falta de irradiación del ratón y corto tiempo de ciclo. El modelo inmune activo EAE induce respuestas autoinmunes en el SNC mediante la inmunización de roedores con antígenos de automielina o sus péptidos posteriores, que generalmente se manifiestan como debilidad de la cola y parálisis de las extremidades13. Específicamente, el modelo EAE inducido por MOG 35-55 en ratones C57BL / 6J se caracteriza por ciclos alternos de remisión-recaída, acompañados de inflamación del SNC, desmielinización y lesión axonal, lo que hace que la EAE inducida por MOG35-55 sea el modelo preferido11,12. La EAE puede ser bien inducida en ratones sensibilizados por inyección subcutánea del péptido MOG 35-55, emulsionada con inmunopotenciador CFA enriquecida con MTB, y administrada una inyección intraperitoneal de PTX con efecto disruptor de la barrera hematoencefálica en los días0-2 30. El mayor desafío para el modelo EAE es la baja incidencia de síntomas débiles, y varios factores influyentes son críticos para el curso del experimento. (1) La edad y el entorno de los ratones afectarán a la susceptibilidad a EAE. Por lo tanto, los ratones de la misma edad deben ser seleccionados antes del experimento. Los ratones deben ser ponderados y agrupados aleatoriamente antes de la asignación a la jaula, y el peso de cada grupo debe mantenerse cerca. Además, asegúrese de que las condiciones ambientales entre experimentos independientes sean comparables. (2) La concentración de PTX: El papel principal de PTX es aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T patógenas entren en el SNC para secretar citoquinas relevantes y promover la respuesta inflamatoria, lo que finalmente conduce a la hidrólisis de proteínas de mielina envueltas en la capa externa de los axones nerviosos. La aparición de la enfermedad en ratones EAE se retrasó con la disminución de la concentración de administración de PTX, y la gravedad de la enfermedad se debilitaría si PTX disminuyera en más del 60%. (3) La disolución del antígeno MOG 35-55: Para evitar la congelación y descongelación, se recomienda adquirir el antígeno MOG35-55 liofilizado en paquetes separados, 4 mg / tubo, para evitar la congelación y descongelación. Además, PTX se usa para la disolución en lugar de agua estéril porque es mejor emulsionar con CFA usando PTX. (4) El antígeno MOG35-55 y el CFA deben emulsionarse suficientemente oscilando para formar una estructura de agua en aceite, y las gotas de emulsión no se dispersan en la superficie del agua durante mucho tiempo, lo que indica una buena emulsificación. (5) Se utilizó la inyección de dos puntos para el modelado de EAE en ratones. El sitio de inyección se encuentra preferiblemente por encima de la cintura y por debajo del cuello, cerca de la columna vertebral, para evitar que los ratones laman y muerdan la piel, lo que resulta en el derrame de la emulsión MOG35-55.

Sin embargo, el modelo EAE inducido por el antígeno MOG35-55 todavía tiene algunas limitaciones. Como modelo de encefalopatía inflamatoria de lesión axonal primaria mediada por linfocitos T CD4, la lesión principal es la degeneración axonal masiva con desmielinización secundaria y menor desmielinización primaria, que es diferente de la patología del SM31,32,33. El modelo EAE inducido por MOG35-55 refleja principalmente la respuesta inmune impulsada por las células T CD4, mientras que otras células inmunes como las células T y B CD8 no tienen un fuerte sentido de participación en este modelo31. Otro factor limitante es que la EAE inducida por MOG35-55 tiene un cierto sesgo hacia el componente inmunológico de la fisiopatología de la EM, y se pueden considerar otros modelos animales al considerar estudios centrados en patologías del SNC, como el estudio de los procesos de desmielinización y regeneración de mielina 34,35,36,37,38,39,40, como se describe en la Tabla 2 .

EAE es un predictor eficaz para imitar las propiedades autoinmunes de la EM, así como su mecanismo de inflamación y desmielinización12, lo que hace que muchos estudiosos estén interesados en estudiar sus mecanismos inmunomoduladores, ignorando otros síntomas clínicos de la EM. Los estudios han demostrado que la ansiedad asociada a la EM se atribuye a procesos fisiopatológicos como la desregulación inmune y la inflamación cerebral22, 23,41. Los problemas de salud mental, como la ansiedad, son particularmente comunes en personas con EM, y el trastorno de ansiedad puede impedir el desempeño de las tareas diarias básicas y afectar significativamente la calidad de vida42,43. Las alteraciones en la capacidad locomotora de los ratones EAE pueden predecir alteraciones en los procesos neuronales. En experimentos de campo abierto, se produjeron comportamientos similares a la ansiedad en ratones EAE, incluida una disminución en los comportamientos exploratorios que comenzaron el inicio temprano de la enfermedad (esencialmente, sujetos de prueba con puntuaciones clínicas <0.5 y capacidad locomotora casi tan buena como los ratones normales), lo que sugiere que el inicio de comportamientos similares a la ansiedad precede al deterioro motor. Además, los ratones EAE en el período de remisión no mejoraron el comportamiento similar a la ansiedad con una mayor capacidad motora. La aparición de la respuesta inflamatoria puede ser responsable del deterioro mental en ratones EAE a través de la actividad neuronal, lo que lleva a cambios en el estado de ánimo, y la regulación positiva de los niveles de citoquinas inflamatorias interfiere con la función sináptica estriatal antes de la aparición del deterioro motor23,41. Sin embargo, la prueba de campo abierto requiere atención al hecho de que la sala de pruebas debe ser un área tranquila, y los ratones de prueba deben aclimatarse a la habitación con 1 hora de anticipación para evitar la presión excesiva causada por el nuevo entorno. Se requiere una limpieza adicional con etanol entre las pruebas para eliminar los olores y otras sustancias dejadas por el último sujeto de prueba. La principal limitación de la prueba de campo abierto es la interferencia causada por la disfunción motora en ratones EAE, y la prueba para evaluar el comportamiento similar a la ansiedad de los roedores se basa en la distancia, el tiempo y el rango de actividad de los roedores en la cámara de reacción, y no puede descartar el efecto de la disfunción motora en el comportamiento similar a la ansiedad. Por lo tanto, los estudios futuros deben tener en cuenta el deterioro locomotor.

Los métodos tradicionales para analizar estudios relacionados con el tejido óseo a menudo utilizan microscopía de sección ósea bidimensional, que puede tener mayores dificultades para analizar la morfología estructural, la distribución de la densidad, la distribución de la orientación y otras características debido a la influencia de los planos bidimensionales y la falta de homogeneidad de las muestras biológicas. Muchos estudios han confirmado la exactitud y eficacia del sistema Micro-CT para describir la morfología ósea, y muchos estudios44,45,46 han confirmado los resultados de la detección de microestructuras. La obtención de imágenes tridimensionales del tejido óseo mediante Micro-CT permite obtener resultados de histomorfometría ósea más intuitivos y precisos. Se ha logrado escanear animales pequeños y especímenes sin ejecutar al animal o dañar la muestra de tejido, lo que permite información detallada de la estructura espacial tridimensional dentro del tejido44. Estudios han demostrado que los pacientes con EM son propensos a la pérdida de masa ósea y osteoporosis24,25; Al escanear e imaginar el fémur de ratones EAE con un sistema Micro-CT, se pudo observar un deterioro obvio de la microarquitectura ósea y una disminución de la resistencia ósea en el fémur de ratones EAE en comparación con los ratones WT que habían desarrollado osteoporosis. El análisis de micro-CT es relativamente simple de realizar y relativamente barato, y las imágenes en vivo de Micro-CT se pueden usar para monitorear la salud ósea en el futuro cuando se administre tratamiento a ratones EAE. Sin embargo, el inconveniente es la ausencia de marcadores de recambio óseo evaluados a través de muestras de sangre o histomorfometría ósea para observar cambios fundamentales en la homeostasis metabólica ósea en ratones EAE47. La regulación de osteoblastos y osteoclastos podría considerarse dentro del estudio en el futuro.

La EM es una enfermedad con múltiples síntomas, y el único objetivo del manejo de la enfermedad es minimizar los síntomas de la enfermedad. En el protocolo mencionado anteriormente, los síntomas clínicos de la EM se pueden simular mediante la construcción del modelo EAE inducido por MOG35-55 . Los ratones EAE mostraron síntomas clínicos de disfunción motora y comportamiento similar a la ansiedad, y osteoporosis. El sistema de puntuación de 5 puntos, la prueba de campo abierto y el análisis Micro-CT descritos en este protocolo pueden monitorizar los síntomas patológicos de ratones EAE desde múltiples perspectivas y proporcionar un esquema de referencia para el tratamiento de EAE. En ausencia de fármacos modificadores de la enfermedad eficaces, una posible combinación de terapia sinérgica puede proporcionar la mejor oportunidad para aliviar los síntomas y mejorar la función.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) y el Laboratorio Estatal Clave de Investigación de Medicamentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie,… More

Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).

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