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Biology

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/63866
* These authors contributed equally

Summary

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Abstract

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune típica do sistema nervoso central (SNC) caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e dano axonal. Atualmente, não há medidas para curar completamente a EM, mas várias terapias modificadoras da doença (DMT) estão disponíveis para controlar e mitigar a progressão da doença. Existem semelhanças significativas entre as características patológicas do SNC da encefalomielite autoimune experimental (EAE) e pacientes com EM. O EAE tem sido amplamente utilizado como um modelo representativo para determinar a eficácia dos medicamentos para EM e explorar o desenvolvimento de novas terapias para a doença da EM. A indução ativa de EAE em camundongos tem um efeito estável e reprodutível e é particularmente adequada para estudar os efeitos de drogas ou genes na neuroinflamação autoimune. O método de imunização de camundongos C57BL/6J com glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) e a avaliação diária dos sintomas da doença usando um sistema de pontuação clínica são compartilhados principalmente. Dada a complexa etiologia da SM com diversas manifestações clínicas, o sistema de pontuação clínica existente não pode satisfazer a avaliação do tratamento da doença. Para evitar as deficiências de uma única intervenção, novos indicadores para avaliar EAE com base nas manifestações clínicas de humor semelhante à ansiedade e osteoporose em pacientes com EM são criados para fornecer uma avaliação mais abrangente do tratamento da EM.

Introduction

As doenças autoimunes são um espectro de distúrbios causados pela resposta imune do sistema imunológico aos seus próprios antígenos, resultando em danos ou disfunção tecidual1. A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune crônica de polineuropatia no sistema nervoso central (SNC), caracterizada por infiltração inflamatória, desmielinização e degeneração axonal neuronal 2,3. Atualmente, a EM afetou até 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo, principalmente jovens e pessoas de meia-idade com idades entre 20 e 40 anos, que são muitas vezes a espinha dorsal de suas famílias e da sociedade. Isso tem causado considerável impacto e danos às famílias e à sociedade 2,4.

A SM é uma doença multifatorial com manifestações clínicas diversas e complexas. Além dos distúrbios neurológicos clássicos caracterizados por infiltração inflamatória e desmielinização, a SM frequentemente apresenta deficiência visual, discinesia de membros e distúrbios cognitivos e emocionais 5,6,7. Se os pacientes com EM não receberem o tratamento adequado e correto, metade deles viverá em cadeiras de rodas após 20 anos, e quase metade deles experimentará sintomas depressivos e de ansiedade, levando a níveis muito mais elevados de ideação suicida do que a população em geral 8,9.

Apesar de um longo período de pesquisa, a etiologia da EM permanece indescritível, e a patogênese da EM ainda não foi elucidada. Modelos animais de EM permitiram servir como ferramentas de teste para explorar o desenvolvimento de doenças e novas abordagens terapêuticas, apesar das diferenças significativas entre os sistemas imunológico de roedores e humanos, ao mesmo tempo em que compartilhavam alguns princípios básicos. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é atualmente o modelo animal ideal para o estudo da EM, que usa a imunidade de autoantígenos das proteínas da mielina para induzir a autoimunidade aos componentes do SNC em camundongos suscetíveis, com a adição de adjuvante de Freund completo (CFA) e toxina pertussis (PTX) para melhorar a resposta imune humoral. Dependendo do contexto genético e dos antígenos imunológicos, diferentes processos patológicos, incluindo agudos, remitentes-recorrentes ou crônicos, são obtidos para mimetizar várias formas clínicas de SM10,11,12. Os imunógenos relevantes comumente usados na construção de modelos EAE vêm de proteínas do auto-SNC, como a proteína básica de mielina (MBP), a proteína proteolipídica (PLP) ou a glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG). Camundongos SJL/L imunizados com MBP ou PLP desenvolvem um curso remitente-recorrente, e o MOG desencadeia EAE crônica progressiva em camundongos C57BL/611,12,13.

O principal objetivo da terapia modificadora da doença (DMT) é minimizar os sintomas da doença e melhorar a função6. Várias drogas são usadas clinicamente para aliviar a EM, mas nenhuma droga ainda foi usada para curá-la completamente, revelando a necessidade de tratamento sinérgico. Os camundongos C57BL/6 são atualmente os mais comumente utilizados para a construção de camundongos transgênicos e, neste trabalho, um modelo EAE induzido pelo MOG35-55 em camundongos C57BL/6J com uma escala de 5 pontos foi usado para monitorar a progressão da doença. Os modelos EAE também sofrem de humor semelhante à ansiedade e perda óssea, e as lesões desmielinizantes amplamente conhecidas. Aqui, o método para avaliar os sintomas de EAE a partir de múltiplas perspectivas usando teste de campo aberto e análise de tomografia micro-computadorizada (Micro-CT) também é descrito.

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Protocol

O Comitê de Cuidados com os Animais da Universidade de Tongji aprovou o presente trabalho, e todas as diretrizes de cuidados com os animais foram seguidas. Camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas entre 8-12 semanas de idade foram utilizados para os experimentos. Garantiu-se que a idade e o sexo fossem os mesmos nos grupos experimentais; caso contrário, a suscetibilidade à doença foi afetada. Os camundongos foram alojados em um ambiente específico livre de patógenos com ciclos alternados de 12 h de luz e escuridão sob condições constantes (temperatura ambiente de 23 ± 1 °C, umidade de 50% ± 10%), com livre acesso a alimentos e água de camundongos.

1. Preparação da emulsão MOG35-55

  1. Adicionar o Mycobacterium tuberculosis liofilizado inativado pelo calor (MTB, H37Ra) para completar o adjuvante de Freund (ele próprio contendo 1 mg/mL de MTB inativado pelo calor, H37Ra), resultando em uma concentração final de MTB de 5 mg/mL (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Toda a operação deve ser concluída no gabinete de biossegurança; não abra o ar soprando.
  2. Dissolva o peptídeo MOG35-55 liofilizado (ver Tabela de Materiais) com solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril pré-resfriado (sem íons cálcio e magnésio, pH 7,4) para preparar a solução antigênica na concentração de 2 mg/mL.
  3. Pegue um tubo de microcentrífuga limpo de 2 mL e adicione uma esfera de aço esterilizada de 5 mm (consulte Tabela de Materiais) a cada tubo.
  4. Adicionar 500 μL de adjuvante completo de Freund contendo 5 mg/mL de MTB e 500 μL de solução antigênica MOG35-55 ao tubo de microcentrífuga acima contendo uma esfera de aço.
  5. Oscile o tubo acima em um TissueLyser (ver Tabela de Materiais) por 10 min, esfrie no gelo por 10 min e repita quatro vezes para misturá-lo bem e, finalmente, formar uma solução viscosa branca.
    NOTA: Uma boa emulsificação é um passo fundamental na preparação da emulsão MOG35-55 , por isso é necessária uma mistura completa. O TissueLyser é ajustado para uma velocidade de 28 Hz.

2. Preparação da toxina pertussis (PTX)

  1. Preparar a PTX com ddH2O numa concentração de 100 μg/ml e conservar a 4 °C.
  2. Diluir a solução-mãe de PTX 50 vezes com PBS estéril 1x (sem iões de cálcio e magnésio, pH 7,4) para obter uma solução de 200 ng/100 μL para utilização.

3. Estabelecimento do modelo animal EAE

  1. Construa o modelo EAE usando os camundongos C57BL/6J machos ou fêmeas de 8 a 12 semanas de idade. Certifique-se de que os ratos estejam adequadamente aclimatados ao ambiente de alimentação antes da imunização.
  2. Centrifugar a emulsão MOG35-55 preparada (passo 1) a 4 °C durante 2-3 s premindo o botão Pulso do equipamento (ver Tabela de Materiais) para precipitar todas as emulsões no fundo do tubo.
    NOTA: A emulsão MOG35-55 pode ser armazenada a -20 °C durante vários dias. Para evitar a falha do medicamento, recomenda-se usá-lo o mais rápido possível.
  3. Ligue uma agulha de 22 G a um tambor de seringa de 1 ml, aspirar a emulsão MOG 35-55 e transferir a emulsão MOG35-55 para um novo tambor de seringa de 1 ml. Fixe a ligação entre o tambor da seringa de 1 ml e uma agulha de 26 G com película de vedação (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Evite bolhas de ar ao carregar a emulsão MOG35-55 em barris de seringa de 1 mL.
  4. Limpe e desinfete o local de injeção com etanol a 70%.
  5. Injete a emulsão MOG35-55 por via subcutânea em cada lado da coluna dorsal dos camundongos, 100 μL de cada lado. Observe a formação automática de massas bulbosas sob a pele do dorso dos ratos após a conclusão da operação de injeção.
    NOTA: Certifique-se de que experimentadores experientes realizem o processo de imunização e que a injeção seja feita de forma suave e lenta para minimizar a pressão sobre os camundongos.
  6. Injete os ratos acima por via intraperitoneal com 100 μL de PTX (passo 2).
    NOTA: O dia da imunização é o dia 0. Além disso, certifique-se de que os ratos possam ser identificados com precisão para avaliação diária subsequente, como o uso de um marcador de cor na cauda dos camundongos.
  7. Injete a mesma dose de PTX no dia 2 após a imunização.
  8. Prepare um grupo de camundongos não imunizados como camundongos do tipo selvagem (WT).

4. Monitorização clínica de ratinhos

  1. Registre o peso corporal de camundongos EAE e WT diariamente.
    NOTA: A gravidade do EAE está positivamente correlacionada com a perda de peso dos ratos, de modo que o peso corporal também é um índice de monitoramento muito importante.
  2. Monitore o status dos camundongos de 0 a 21 dias após a imunização usando o sistema de pontuação 0 a 5 listado na Tabela 1.
    NOTA: Os sintomas intermediários são contados como mais ou menos 0,5 pontos.

5. Teste de campo aberto

NOTA: Os animais experimentais selecionados para esta etapa são camundongos EAE nos períodos de início precoce, pico e remissão. Além disso, camundongos WT foram utilizados como controle. Deve-se notar que todos os ratos foram testados para o comportamento semelhante à ansiedade antes da modelagem para excluir ratos com transtornos de ansiedade para modelagem EAE. Além disso, camundongos EAE em períodos de pico e remissão com incapacidade motora completa foram excluídos do teste.

  1. Prepare uma câmara de reação de campo aberto de 40 × 40 × 40 cm3 e um sistema de análise de vídeo de atividade de locomoção (campo aberto) (consulte Tabela de Materiais).
    NOTA: A câmera é instalada em uma posição que cobre completamente a caixa, a sala de reação é uniformemente iluminada e a sala de teste deve ser uma área silenciosa.
  2. Coloque os ratos de teste na sala de teste para habituação 1 h antes de iniciar o experimento.
  3. Pulverize toda a área com etanol a 70% e limpe com uma toalha de papel limpa para garantir que a câmara de reação esteja limpa antes de iniciar o teste.
  4. Remova cada mouse individualmente de sua gaiola e coloque-o no mesmo canto da arena antes de começar a explorar.
    NOTA: A parte inferior da caixa é dividida em 16 grades, das quais a área das quatro grades do meio é a área central e a área circundante é a área periférica.
  5. Clique no botão Iniciar captura na barra de menus do sistema de análise de vídeo, registre o tempo e comece a fotografar.
  6. Mantenha-se quieto na sala de testes.
  7. Deixe o mouse se mover livremente por 5 minutos durante o processo de gravação.
  8. Pare o sistema de aquisição e salve o vídeo.
  9. Tire o mouse da arena, coloque-o de volta na gaiola e prossiga para o próximo mouse.
    NOTA: Limpe a área de teste com etanol a 70% entre as corridas para remover odores e outras substâncias.
  10. Analise os resultados usando o sistema de análise de vídeo.

6. Análise do fenótipo ósseo

  1. Eutanasiar os camundongos EAE e WT por luxação cervical no 21º dia.
    NOTA: O pessoal que realiza operações de luxação cervical deve ser bem treinado para minimizar a dor sofrida durante a morte do animal.
  2. Faça o rato deitado em uma bandeja de dissecação e fixe as extremidades.
  3. Segure a pele do membro posterior do rato com fórceps e abra a pele do rato e o tecido muscular com uma tesoura.
  4. Separe o fêmur da tíbia e do osso do quadril cuidadosamente com uma tesoura.
  5. Remova o músculo aderente ao fêmur com uma tesoura e coloque o fêmur em etanol a 70% à temperatura ambiente.
  6. Escaneie o fêmur distal usando um sistema de micro-TC (ver Tabela de Materiais) com um tamanho de voxel isotrópico de 10 μm, com uma tensão de pico do tubo de raios-X de 70 kV e uma intensidade de raios-X de 0,114 mA.
    NOTA: Um filtro Gaussiano 3D permite a denoising de imagens de limiar 2D.
  7. Analise os 100 cortes escaneados da diáfise femoral média para medir os parâmetros do fêmur, incluindo volume ósseo, volume tecidual, densidade mineral óssea, separação trabecular, número trabecular, densidade de conexão trabecular e espessura trabecular e cortical.
    NOTA: A partir da extremidade proximal da placa distal de crescimento do fêmur em camundongos, seções completamente desprovidas de estruturas da tampa epifisária foram encontradas e continuaram a estender 100 cortes em direção ao fêmur proximal, que foram contornos manualmente delineados em vários voxels longe da superfície cortical interna para identificar trabéculas epifisárias.
  8. Crie as reconstruções 3D empilhando imagens 2D de limiar de regiões de contorno no sistema de micro-CT.

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Representative Results

Após a imunização dos camundongos, o peso corporal dos camundongos é registrado diariamente, e seus sintomas clínicos são avaliados de acordo com o protocolo descrito acima (etapa 4). Em camundongos C57BL / 6J imunizados com peptídeo MOG, porque a localização da lesão está confinada principalmente à medula espinhal, a patogênese dos camundongos EAE se espalha da extremidade da cauda até a cabeça. No início da doença, os camundongos EAE exibem fraqueza e queda da cauda, seguidos por fraqueza dos membros posteriores, movimento descoordenado e paralisia. À medida que a doença piora, ela gradualmente se desenvolve na fraqueza dos membros anteriores, paralisia e, em casos graves, causa dificuldade em mover os ratos e até mesmo perto da morte. Como mostrado na Figura 1A, o diagrama de estado dos camundongos com diferentes graus de patologia da EAE mostra um quadro exemplar de um grupo de camundongos mudando de assintomáticos para sintomas de EAE de alta pontuação (escore 4). Também foi mencionado anteriormente que o peso corporal de camundongos EAE está correlacionado com sintomas clínicos. Em comparação com camundongos WT, a perda de peso em camundongos EAE pode começar a ocorrer nos primeiros dias após a imunização, enquanto os sintomas clínicos de camundongos EAE geralmente começam no dia 6-9 após a imunização e atingirão um pico no dia 14-16. Depois disso, os sintomas dos camundongos EAE geralmente se recuperam parcialmente e, ao mesmo tempo, a perda de peso dos camundongos será aliviada (Figura 1B,C). Assim, o curso do início do EAE é geralmente dividido em períodos de início precoce, pico e remissão, e a previsão desses pontos de tempo é importante na avaliação dos parâmetros de desfecho. Em geral, para analisar a produção de células imunes e citocinas no local das lesões de EAE, células imunes no cérebro e na medula espinhal de camundongos EAE no pico da doença podem ser isoladas e processadas, o que pode ser analisado por citometria de fluxo14,15. O tecido medular no início máximo também é mais adequado para o preparo das colorações de hematoxilina e eosina (H&E) e da coloração azul rápida de Luxol para investigar melhor a infiltração de células inflamatórias e a desmielinização da medula espinhal14,16. Para o monitoramento de alterações no sistema imunológico em diferentes épocas de início da EAE, baço e linfonodos no início precoce também são opções essenciais17,18. Além disso, células do baço ou linfonodos de camundongos EAE imunizados com MOG são comumente usadas para construir modelos de transferência, que são transferidos para camundongos receptores após a reestimulação de MOG in vitro para induzir a imunização passiva de camundongos EAE18.

A SM é uma lesão desmielinizante autoimune induzida por inflamação do sistema nervoso central, caracterizada por desmielinização inflamatória e perda neuronal 2,3. Essa doença geralmente é acompanhada de comorbidades psiquiátricas, como transtornos afetivos, dos quais o transtorno de ansiedade é muito comum em pacientes com EM, com até 30% dos pacientes com SM sofrendo de ansiedade 9,19. O transtorno de ansiedade é uma anormalidade psiquiátrica caracterizada por estresse emocional excessivo e preocupação. O teste de campo aberto é frequentemente utilizado para analisar comportamentos de ansiedade em roedores20,21. Com a ajuda de analisar os comportamentos de exploração de camundongos EAE em testes de campo aberto durante os períodos de início precoce, pico e remissão, verificou-se que os camundongos EAE também tinham comportamentos semelhantes aos de ansiedade semelhantes aos de pacientes com EM (Figura 2A). No teste de campo aberto, roedores ansiosos tendem a ter atividade reduzida e aumento do comportamento estereotipado, incluindo uma preferência por estar mais perto dos cantos, um viés em relação ao domínio periférico e uma falta de desejo de explorar a área central. Em comparação com os camundongos WT, os camundongos EAE tiveram distância de caminhada e tempo de movimento significativamente menores em todos os três períodos da doença, mesmo no início precoce da doença, quando os camundongos EAE ainda não tinham um comprometimento motor (Figura 2B,C). Além disso, os camundongos EAE passam significativamente menos distância e permanecem na área central menos do que os camundongos normais, e até mesmo se movem apenas na área periférica, mostrando um humor óbvio semelhante à ansiedade (Figura 2D,E). Os camundongos EAE ainda exibem um forte humor semelhante à ansiedade quando o início é leve, ou seja, coordenação motora. Alguns estudos sugerem que isso pode ser atribuído à neuroinflamação leve, que afeta ainda mais a secreção de neurotransmissores22,23. Testes de campo aberto monitorando gatilhos de humor semelhantes à ansiedade em camundongos EAE podem ajudar os pesquisadores a entender e tratar comorbidades psiquiátricas da EM.

Com o progresso da doença, a EM essencialmente eventualmente se manifesta como discinesia. Estudos têm encontrado que pacientes com SM apresentam maior suscetibilidade à osteoporose e fratura, principalmente devido à perda de massa óssea, e que a gravidade da discinesia está fortemente correlacionada com a densidade óssea do paciente24,25. Fenômeno semelhante pode ser observado pela análise de Micro-TC com o auxílio do modelo animal EAE (Figura 3A,H). A partir dos dados da análise trabecular do fêmur em camundongos, camundongos EAE sofreram uma diminuição significativa da densidade mineral óssea (DMO) em comparação com camundongos WT, o que é um importante indicador da resposta à força óssea e uma base importante para o diagnóstico de osteoporose (Figura 3B). Uma análise mais aprofundada mostrou que a perda óssea trabecular ocorreu significativamente em camundongos EAE em comparação com camundongos WT saudáveis e foi acompanhada por uma redução na densidade de conexão trabecular, números trabeculares e espessura trabecular. Todas elas são características da redução da massa óssea, sugerindo que a EAE também causa perda óssea trabecular no fêmur de camundongos (Figura 3C-F). Ao mesmo tempo, a morfologia estrutural das trabéculas ósseas mudou e o espaçamento das trabéculas aumentou significativamente; quanto maior o espaçamento, mais osteoporótico o osso (Figura 3G). Isso é consistente com a noção de que os pacientes com EM são propensos à osteoporose. Nos ossos corticais da diáfise do fêmur, a espessura do osso cortical no modelo EAE foi significativamente menor do que na de camundongos normais (Figura 3I). Na SM, a diminuição da motilidade e o aumento da distrofia muscular estão fortemente associados à osteoporose, fratura e aumento da reabsorção óssea devido à redução das forças mecânicas, diminuindo gradualmente a integridade óssea, aumentando o risco de osteoporose e fratura26. A análise por micro-TC do fêmur em camundongos EAE pode monitorar bem a saúde óssea, e a intervenção é benéfica no controle da condição da EAE.

Figure 1
Figura 1: Monitorização dos sintomas clínicos do EAE. (A) O quadro exemplar dos camundongos com diferentes graus de patologia do EAE. (B) Mudança de peso em camundongos WT e EAE. (C) Escore clínico em camundongos WT e EAE. Os dados são dados como média ± MEV (n = 5), ***p < 0,001 versus camundongos WT, teste ANOVA two-way. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Comportamento semelhante ao da ansiedade de camundongos EAE no teste de campo aberto. (A) Gráficos de pista representativos do teste de campo aberto. Distância de viagem (B), duração da atividade (C), distância de viagem no centro (D) e tempo gasto no centro (E) de camundongos WT e EAE em períodos de início precoce, pico e remissão. Os dados são médios ± MEV (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus camundongos WT, teste t de Student. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Análise micro-CT da saúde óssea em camundongos EAE. (A) Imagens 3D representativas da arquitetura trabecular femoral (barras de escala, 100 μm). A densidade mineral óssea (B), a relação volume ósseo/volume tecidual (C), a densidade de conexão (D), os números (E), a espessura (F) e a separação (G) do trabecular femoral foram determinados por análise de Micro-TC. (H) Imagens 3D representativas do osso cortical (barras de escala, 100 μm). (I) Espessura cortical obtida a partir de dados de tomografia microcomputadorizada. Os dados são médios ± MEV (n = 3), *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus camundongos WT, teste t de Student. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Pontuação Sinal clínico
0 Sem sinais clínicos
0.5 Fraqueza da cauda, frente da cauda caindo
1 Cauda completamente paralisada
2 Paralisia leve dos membros posteriores (fraqueza de ambos os membros posteriores ou paralisia unilateral, caminhada descoordenada, resposta ao beliscão)
3 Paralisia completa dos membros posteriores, membros posteriores arrastando e andando, membros posteriores não respondendo ao beliscão
4 Paralisia dos membros posteriores e fraqueza dos membros anteriores
5 Perto da morte ou morte

Tabela 1: Sistema de pontuação clínica.

Antígeno Coar Característica Aplicação Limitação
PLP SJL/J34 EAE remitente-recorrente Estudo dos eventos celulares e moleculares envolvidos na recidiva clínica Limitado a respostas específicas de células T; Estudar genes e vias específicas na cepa SJL/J é um desafio
MBP SJL/J35 Paralisia recidivante seguida em receptores parciais ou totais após recuperação de paralisia aguda Estudo da neuroinflamação e ativação do sistema imunológico Limitado a respostas específicas de células T; Estudar genes e vias específicas na cepa SJL/J é um desafio
MOG35-55 C57BL/631 EAE progressivo primário; EAE progressiva crônica Estudo dos mecanismos de dano axonal; Estudo dos mecanismos moleculares de doenças em modelos transgênicos e knockout Estudos de desmielinização primária e regeneração de mielina são de valor limitado
Homogeneizado da medula espinhal Biozzi ABH36 EAE remitente-recorrente Estudo da regeneração da mielina e terapia neuroprotetora para EM Não clinicamente progressiva, com acúmulo de déficits neurológicos ao longo do tempo; Limitado a respostas específicas de células T CD4
Vírus da encefalomielite murina de Theiler Múltiplas cepas de camundongos são altamente suscetíveis, incluindo SJL/J, SWR, PL/J12,31 Modelos virais de desmielinização inflamatória Estudo da lesão axonal e da desmielinização induzida por inflamação Não foram identificadas infecções virais específicas da EM; A regeneração da mielina é difícil de avaliar, a desmielinização e a regeneração da mielina ocorrem simultaneamente
Cuprizone Amplamente utilizado em camundongos C57BL/6, enquanto outras cepas, como a cepa CD1, são menos suscetíveis a danos induzidos pela cuprizona de cobre37,38 Modelo tóxico de desmielinização e remielinização Estudo da desmielinização independente de células T, especialmente regeneração de mielina e processos básicos de reparo de mielina A regeneração espontânea significativa da mielina ocorre após a cessação da lesão tóxica; A desmielinização é específica da região do cérebro e não é útil para estudar a desmielinização da medula espinhal
Lisoleecitina SJL/J12, C57BL/639, etc. Modelo tóxico de desmielinização e remielinização Estudo da desmielinização independente de células T, especialmente regeneração de mielina e processos básicos de reparo de mielina Falta de resposta imune observada durante a EM
Brometo de etídio C57BL/640, etc. Modelo tóxico de desmielinização e remielinização Estudo de lesões desmielinizantes focais e predição da cinética da desmielinização e regeneração da mielina O brometo de etídio danifica todas as células contendo nucléolo; Correlação limitada com a EM

Tabela 2: Diferentes modelos de mouse de EM.

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Discussion

A SM é uma doença inflamatória desmielinizante do SNC e é um dos distúrbios neurológicos mais comuns causadores de incapacidade crônica em jovens, impondo um enorme fardo às famílias e à sociedade 3,4. A SM sempre foi classificada como uma doença autoimune mediada por células T específicas de órgãos, induzindo o sistema autoimune a corroer lentamente o SNC, o que envolverá múltiplos sistemas em todo o corpo27. Os sintomas clínicos típicos incluem deficiência visual, distúrbios motores, distúrbios cognitivos e emocionais, etc 6,7. A SM é uma doença devastadora que se agravará progressivamente se não for tratada adequadamente, levando a cegueira e paralisia graves28. A patogênese da SM ainda não é totalmente compreendida, pois suas manifestações clínicas e progressão patológica são heterogêneas e, portanto, os modelos animais são essenciais para a pesquisa e o desenvolvimento do tratamento da EM.

O modelo animal mais frequentemente estudado para a SM é o EAE, que possui principalmente dois métodos de modelagem: imunização ativa e imunização passiva29. O primeiro é amplamente adotado por causa de sua simplicidade, falta de irradiação do mouse e curto tempo de ciclo. O modelo imune ativo EAE induz respostas autoimunes no SNC imunizando roedores com antígenos de automielina ou seus peptídeos subsequentes, geralmente manifestando-se como fraqueza da cauda e paralisia dos membros13. Especificamente, o modelo EAE induzido pelo MOG35-55 em camundongos C57BL/6J é caracterizado por ciclos alternados de remissão-recidiva, acompanhados de inflamação do SNC, desmielinização e lesão axonal, o que torna o EAE induzido por MOG35-55 o modelo preferido11,12. A EAE pode ser bem induzida em camundongos sensibilizados por injeção subcutânea do peptídeo MOG35-55, emulsionada com imunopotenciador CFA enriquecido com MTB e administrada uma injeção intraperitoneal de PTX com efeito de ruptura da barreira hematoencefálica nos dias 0-230. O maior desafio para o modelo EAE é a baixa incidência de sintomas fracos, e vários fatores de influência são críticos para o curso do experimento. (1) A idade e o ambiente dos ratinhos afectarão a susceptibilidade aos EAE. Portanto, camundongos da mesma idade precisam ser selecionados antes do experimento. Os ratos devem ser pesados e agrupados aleatoriamente antes da alocação da gaiola, e o peso de cada grupo precisa ser mantido próximo. Além disso, certifique-se de que as condições ambientais entre experimentos independentes sejam comparáveis. (2) A concentração de PTX: O principal papel do PTX é aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, o que permite que as células T patogênicas entrem no SNC para secretar citocinas relevantes e promover a resposta inflamatória, levando à hidrólise de proteínas de mielina envolvidas na camada externa dos axônios nervosos. O início da doença em camundongos EAE foi retardado com a diminuição da concentração de administração de PTX, e a gravidade da doença seria enfraquecida se a PTX diminuísse em mais de 60%. (3) A dissolução do antígeno MOG 35-55: Para evitar o congelamento e o descongelamento, recomenda-se a obtenção do antígeno liofilizado MOG35-55 em embalagens separadas, 4 mg/tubo, para evitar o congelamento e o descongelamento. Além disso, o PTX é usado para dissolução em vez de água estéril, porque é melhor emulsionar com CFA usando PTX. (4) O antígeno MOG35-55 e o CFA devem ser suficientemente emulsionados por oscilação para formar uma estrutura de água em óleo, e as gotículas de emulsão não se dispersam na superfície da água por um longo tempo, indicando uma boa emulsificação. (5) A injeção de dois pontos foi utilizada para a modelagem de EAE em camundongos. O local de injeção é preferencialmente localizado acima da cintura e abaixo do pescoço, perto da coluna vertebral, para evitar que os ratos lambam e mordam a pele, resultando no derramamento da emulsão MOG35-55.

No entanto, o modelo EAE induzido pelo antígeno MOG35-55 ainda apresenta algumas limitações. Como modelo de encefalopatia inflamatória de lesão axonal primária mediada por células T CD4, a principal lesão é a degeneração axonal maciça com desmielinização secundária e menor desmielinização primária, o que difere da patologia da SM31,32,33. O modelo EAE induzido pelo MOG35-55 reflete principalmente a resposta imune impulsionada pelas células T CD4, enquanto outras células imunes, como as células T CD8 e B, não têm um forte senso de participação nesse modelo31. Outro fator limitante é que a EAE induzida pelo MOG35-55 tem certo viés em relação ao componente imunológico da fisiopatologia da EM, e outros modelos animais podem ser considerados quando considerados estudos focados em patologias do SNC, como o estudo dos processos de desmielinização e regeneração da mielina 34,35,36,37,38,39,40, conforme descrito na Tabela 2 .

O EAE é um preditor eficaz na imitação das propriedades autoimunes da EM, bem como de seu mecanismo de inflamação e desmielinização12, o que faz com que muitos estudiosos se interessem por estudar seus mecanismos imunomoduladores, ignorando outros sintomas clínicos da EM. Estudos têm demonstrado que a ansiedade associada à EM é atribuída a processos fisiopatológicos, como desregulação imunológica e inflamação cerebral22, 23,41. Problemas de saúde mental, como a ansiedade, são particularmente comuns em pessoas com EM, e o transtorno de ansiedade pode impedir a realização de tarefas diárias básicas e afetar significativamente a qualidade de vida42,43. Alterações na capacidade locomotora de camundongos EAE podem predizer alterações nos processos neurais. Em experimentos de campo aberto, comportamentos semelhantes à ansiedade ocorreram em camundongos EAE, incluindo uma diminuição nos comportamentos exploratórios que iniciaram o início precoce da doença (essencialmente, indivíduos de teste com escores clínicos <0,5 e capacidade locomotora quase tão boa quanto a normal de camundongos), sugerindo que o início de comportamentos semelhantes à ansiedade precede o comprometimento motor. Além disso, os camundongos EAE no período de remissão não melhoraram o comportamento semelhante à ansiedade com o aumento da capacidade motora. O surgimento da resposta inflamatória pode ser responsável pelo comprometimento mental em camundongos EAE por meio da atividade neuronal, levando a alterações de humor, e a regulação positiva dos níveis de citocinas inflamatórias interfere na função sináptica estriatal antes do início do comprometimento motor23,41. No entanto, o teste de campo aberto requer atenção ao fato de que a sala de teste deve ser uma área silenciosa, e os ratos de teste precisam se aclimatar à sala por 1 h de antecedência para evitar a pressão excessiva causada pelo novo ambiente. É necessária uma limpeza adicional com etanol entre os ensaios para remover odores e outras substâncias deixadas para trás pelo último sujeito do ensaio. A principal limitação do teste de campo aberto é a interferência causada pela disfunção motora em camundongos EAE, e o teste para avaliar o comportamento semelhante à ansiedade de roedores é baseado na distância, tempo e amplitude de atividade de roedores na câmara de reação, e não pode descartar o efeito da disfunção motora no comportamento semelhante à ansiedade. Portanto, estudos futuros precisam levar em conta o comprometimento locomotor.

Os métodos tradicionais para analisar estudos relacionados ao tecido ósseo geralmente usam microscopia bidimensional de seção óssea, que pode ter maiores dificuldades em analisar a morfologia estrutural, a distribuição de densidade, a distribuição de orientação e outras características devido à influência de planos bidimensionais e à não homogeneidade dos espécimes biológicos. Muitos estudos confirmaram a acurácia e a eficácia do sistema Micro-CT para descrever a morfologia óssea, e muitos estudos44,45,46 confirmaram os resultados da detecção de microestruturas. A imagem tridimensional do tecido ósseo por Micro-CT permite resultados de histomorfometria óssea mais intuitivos e precisos. Realizou-se a varredura de pequenos animais e espécimes sem executar o animal ou danificar o espécime tecidual, permitindo informações detalhadas da estrutura espacial tridimensional dentro do tecido44. Estudos têm demonstrado que pacientes com EM são propensos à perda de massa óssea e osteoporose24,25; Ao escanear e fotografar o fêmur de camundongos EAE com um sistema Micro-CT, uma deterioração óbvia da microarquitetura óssea e diminuição da força óssea pôde ser observada no fêmur de camundongos EAE em comparação com camundongos WT que desenvolveram osteoporose. A análise de micro-TC é relativamente simples de realizar e relativamente barata, e a imagem ao vivo de Micro-CT pode ser usada para monitorar a saúde óssea no futuro ao administrar tratamento a camundongos EAE. No entanto, a desvantagem é a ausência de marcadores de remodelação óssea avaliados por meio de amostras de sangue ou histomorfometria óssea para observar alterações fundamentais na homeostase metabólica óssea em camundongos EAE47. A regulação de osteoblastos e osteoclastos pode ser considerada dentro do estudo no futuro.

A EM é uma doença multissintomática, e o único objetivo do manejo da doença é minimizar os sintomas da doença. No protocolo mencionado acima, os sintomas clínicos da SM podem ser simulados pela construção do modelo EAE induzido pelo MOG35-55 . Camundongos EAE mostraram sintomas clínicos de disfunção motora e comportamento semelhante à ansiedade e osteoporose. O sistema de pontuação de 5 pontos, o teste de campo aberto e a análise de Micro-TC descritos neste protocolo podem monitorar os sintomas patológicos de camundongos EAE a partir de múltiplas perspectivas e fornecer um esquema de referência para o tratamento de EAE. Na ausência de drogas modificadoras da doença eficazes, uma combinação potencial de terapia sinérgica pode fornecer a melhor oportunidade para aliviar os sintomas e melhorar a função.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32070768, 31871404, 31900658, 32270754) e do State Key Laboratory of Drug Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland

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Biologia Edição 187 esclerose múltipla encefalomielite autoimune experimental glicoproteína de oligodendrócitos de mielina neuroinflamação comportamento semelhante à ansiedade osteoporose
Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental
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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie,More

Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).

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