Methodenartikel

Fragmentierung von Bulk-Hydrogelen und Verarbeitung zu granularen Hydrogelen für biomedizinische Anwendungen

DOI:

10.3791/63867

⸱

17. Mai 2022

 ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 2BioFrontiers Institute, University of Colorado Boulder, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering and Applied Science, University of Colorado Boulder

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit beschreibt einfache, anpassungsfähige und kostengünstige Methoden, um Mikrogele mit Extrusionsfragmentierung herzustellen, die Mikrogele zu injizierbaren granularen Hydrogelen zu verarbeiten und die granularen Hydrogele als Extrusionsdruckfarben für biomedizinische Anwendungen aufzutragen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granulare Hydrogele sind gestaute Anordnungen von Hydrogel-Mikropartikeln (d. h. "Mikrogelen"). Im Bereich der Biomaterialien haben granulare Hydrogele viele vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich Injektionsfähigkeit, Mikroskalenporosität und Abstimmbarkeit durch Mischen mehrerer Mikrogelpopulationen. Verfahren zur Herstellung von Mikrogelen beruhen häufig auf Wasser-in-Öl-Emulsionen (z. B. Mikrofluidik, Batch-Emulsionen, Elektrospritzen) oder der Photolithographie, die hohe Anforderungen an Ressourcen und Kosten stellen können und möglicherweise nicht mit vielen Hydrogelen kompatibel sind. Diese Arbeit beschreibt einfache, aber hochwirksame Methoden, um Mikrogele unter Verwendung von Extrusionsfragmentierung herzustellen und sie zu granularen Hydrogelen zu verarbeiten, die für biomedizinische Anwendungen nützlich sind (z. B. 3D-Druckfarben). Zunächst werden Bulk-Hydrogele (am Beispiel photovernetzbare Hyaluronsäure (HA)) durch eine Reihe von Nadeln mit sequentiell kleineren Durchmessern extrudiert, um fragmentierte Mikrogele zu bilden. Diese Mikrogel-Herstellungstechnik ist schnell, kostengünstig und hochgradig skalierbar. Es werden Verfahren zum Einklemmen von Mikrogelen zu granularen Hydrogelen durch Zentrifugation und vakuumgetriebene Filtration beschrieben, mit optionaler Nachvernetzung zur Hydrogelstabilisierung. Schließlich werden granulare Hydrogele, die aus fragmentierten Mikrogelen hergestellt werden, als Extrusionsdruckfarben demonstriert. Während die hier beschriebenen Beispiele photovernetzbares HA für den 3D-Druck verwenden, sind die Methoden für eine Vielzahl von Hydrogeltypen und biomedizinischen Anwendungen leicht anpassbar.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Granulare Hydrogele werden durch die Verpackung von Hydrogelpartikeln (d.h. Mikrogelen) hergestellt und sind eine spannende Klasse von Biomaterialien mit vielen vorteilhaften Eigenschaften für biomedizinische Anwendungen 1,2,3. Aufgrund ihrer partikulären Struktur sind granulare Hydrogele scherdünner und selbstheilend, was ihre Verwendung als Extrusionsdrucktinten, granulare Stützen für den eingebetteten Druck und injizierbare Therapeutika 4,5,6,7,8,9 ermöglicht. Zusätzlich bietet der Hohlraum zwischen den Mikrogelen eine mikroskalige Porosität für Zellbewegung und molekulare Diffusion 8,10,11. Darüber hinaus können mehrere Mikrogelpopulationen zu einer einzigen Formulierung kombiniert werden, um eine verbesserte Abstimmbarkeit und Materialfunktionalitätzu ermöglichen 8,10,12,13. Diese wichtigen Eigenschaften haben in den letzten Jahren den raschen Ausbau der granularen Hydrogelentwicklung motiviert.

Es gibt eine Reihe von Methoden, um Mikrogele für die granulare Hydrogelherstellung zu bilden, jede mit ihren eigenen Vor- und Nachteilen. Zum Beispiel werden Mikrogele oft aus Wasser-in-Öl-Emulsionen unter Verwendung von Tröpfchenmikrofluidik 4,11,13,14,15,16,17, Batch-Emulsionen 7,18,19,20,21,22 oder Elektrospritzen 6,23 gebildet. 24,25 Diese Methoden ergeben sphärische Mikrogele mit entweder gleichmäßigen (Mikrofluidik) oder polydispersen (Batch-Emulsionen, Elektrospritzen) Durchmessern. Es gibt einige Einschränkungen für diese Wasser-in-Öl-Emulsionsherstellungsmethoden, einschließlich der potenziell niedrigen Durchsatzproduktion, des Bedarfs an niedrigviskosen Hydrogel-Vorläuferlösungen und der hohen Kosten und Ressourcen für die Einrichtung. Darüber hinaus können diese Protokolle aggressive Öle und Tenside erfordern, die mit Verfahren, die Verarbeitungsschritte hinzufügen, aus den Mikrogelen gewaschen werden müssen, und es kann schwierig sein, sie in sterile Bedingungen für biomedizinische Anwendungen in vielen Labors umzusetzen. Um die Notwendigkeit von Wasser-in-Öl-Emulsionen zu beseitigen, kann auch die (Foto-)Lithographie verwendet werden, bei der Formen oder Fotomasken verwendet werden, um die Aushärtung von Mikrogelen aus Hydrogel-Vorläuferlösungen 1,26,27 zu kontrollieren. Wie die Mikrofluidik können diese Methoden in ihrem Produktionsdurchsatz begrenzt sein, was eine große Herausforderung darstellt, wenn große Mengen benötigt werden.

Als Alternative zu diesen Methoden wurde die mechanische Fragmentierung von Bulk-Hydrogelen verwendet, um Mikrogele mit unregelmäßigen Größen 19,28,29,30,31,32 herzustellen. Zum Beispiel können Bulk-Hydrogele vorgeformt und anschließend durch Netze oder Siebe geleitet werden, um fragmentierte Mikrogele zu bilden, ein Prozess, der sogar in Gegenwart von Zellen in Mikrogelsträngen33,34 durchgeführt wurde. Bulk-Hydrogele wurden auch zu Mikrogelen mit mechanischer Unterbrechung unter Verwendung von Techniken wie dem Mahlen mit Mörser und Stößel oder durch die Verwendung von kommerziellen Mixern35,36,37 verarbeitet. Andere haben auch mechanisches Rühren während der Hydrogelbildung verwendet, um fragmentierte Mikrogele (dh flüssige Gele) herzustellen31.

Die hierin enthaltenen Methoden erweitern diese mechanischen Fragmentierungstechniken und präsentieren einen einfachen Ansatz zur Herstellung von Mikrogelen mit Extrusionsfragmentierung am Beispiel photovernetzbarer Hyaluronsäure (HA)-Hydrogele. Bei der Extrusionsfragmentierung werden nur Spritzen und Nadeln verwendet, um fragmentierte Mikrogele in einer kostengünstigen, leicht skalierbaren Methode mit hohem Durchsatz herzustellen, die für eine breite Palette von Hydrogelen geeignet ist19,32. Weiterhin werden Verfahren beschrieben, um diese fragmentierten Mikrogele zu granularen Hydrogelen zusammenzusetzen, indem entweder Zentrifugation (Low Packing) oder vakuumgetriebene Filtration (High Packing) verwendet wird. Schließlich wird die Anwendung dieser fragmentierten granularen Hydrogele für die Verwendung als Extrusionsdruckfarbe diskutiert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einfache Methoden einzuführen, die an eine Vielzahl von Hydrogelen anpassbar sind und in praktisch jedem Labor implementiert werden können, das sich für granulare Hydrogele interessiert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung von Bulk-Hydrogelen in einer Spritze mittels Photocrosslinking

HINWEIS: Eine Übersicht über die Herstellung von Bulk-Hydrogel in einer Spritze mithilfe von Photocrosslinking ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll verwendet Norbornen-modifizierte Hyaluronsäure (NorHA), um Bulk-Hydrogele unter Verwendung einer photovermittelten Thiol-en-Reaktion herzustellen. Detaillierte Verfahren für die Synthese von NorHA werden an anderer Stelle38 beschrieben. Dieses Protokoll ist jedoch in hohem Maße an jedes photovernetzbare Hydrogel anpassbar. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion.

  1. Bestimmen Sie die gewünschten Konzentrationen von Polymer, Vernetzer und Initiatoren für die Bulk-Hydrogel-Formulierung. In diesem Protokoll besteht die Hydrogel-Vorläuferlösung aus NorHA (2 Gew.%, ~25% Grad Norbornen-Modifikation), Dithiothreitol (DTT, 6 mM) und Irgacure D-2959 (I2959, 0,05 Gew.%). Stellen Sie sicher, dass die Komponenten (1 ml) vollständig in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem Mikrozentrifugenröhrchen gelöst sind.
    HINWEIS: Bei der Herstellung der Hydrogel-Vorläuferlösung kann hochmolekulares FITC-Dextran (2 MDa, 0,1 Gew.%) der Lösung hinzugefügt werden, um Mikrogele zu visualisieren, die später im Protokoll mittels Fluoreszenzmikroskopie hergestellt werden.
  2. Laden Sie eine 3-ml-Spritze mit der Hydrogel-Vorläuferlösung.
    1. Entfernen Sie den Kolben von der Rückseite einer leeren 3-ml-Spritze und fügen Sie eine Spitzenkappe an der Oberseite des Spritzenlaufs hinzu.
    2. Verwenden Sie eine 1.000-μL-Pipette, um die Hydrogel-Vorläuferlösung mit der Spitzenkappe in den Spritzenlauf zu übertragen.
    3. Halten Sie den Spritzenlauf mit Hydrogel-Vorläuferlösung in einer Hand, wobei die Spitzenkappe nach unten und das offene Ende des Laufs nach oben zeigt. Mit der anderen Hand bringen Sie den Spritzenkolben in die Öffnung der Rückseite des Spritzenlaufs zurück. Drücken Sie den Spritzenkolben vorsichtig in den Lauf, gerade genug, um die Öffnung an der Rückseite des Spritzenzylinders abzudichten.
    4. Halten Sie den Kolben und den Spritzenzylinder vorsichtig zusammen, um sicherzustellen, dass die Rückseite des Spritzenzylinders mit dem Kolben versiegelt ist, drehen Sie die Spritze so um, dass der Kolben nach unten zeigt und die Spitzenkappe jetzt nach oben zeigt. Entfernen Sie die Spitzenkappe und drücken Sie den Kolben vorsichtig in den Spritzenlauf, bis die gesamte Luft aus der Spritze entfernt ist (nur die Hydrogel-Vorläuferlösung bleibt übrig).
    5. Befestigen Sie die Spitzenkappe wieder an der Spritze. Stellen Sie sicher, dass die Hydrogel-Vorläuferlösung in der 3-ml-Spritze mit einer Spitzenkappe gesichert ist.
  3. Bilden Sie ein Bulk-Hydrogel in der 3-ml-Spritze.
    1. Stellen Sie sicher, dass vor dem Einschalten der UV-Lampe eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) und Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden. Dazu gehört das Tragen einer UV-schützenden Brille und das Umschließen des Lampenbereichs, um andere vor UV-Licht zu schützen.
    2. Kalibrieren Sie die UV-Spot-Härtungslampe mit einem Radiometer auf eine Lichtintensität von 10 mW/cm2.
      HINWEIS: Es wird eine leichte Dämpfung durch den Spritzenlauf geben. Bestimmen Sie vor der Herstellung den Prozentsatz der vorhandenen Lichtdämpfung mit einem Radiometer. Die Lichtintensität des Spothärtungssystems sollte entsprechend angepasst werden, um einer solchen Dämpfung Rechnung zu tragen.
    3. Legen Sie die 3-ml-Spritze, die mit der Hydrogel-Vorläuferlösung beladen ist, für eine gewünschte Zeit unter die UV-Spot-Härtungslampe, um vollständig zu vernetzen. Für das hierin beschriebene System wird NorHA Hydrogel-Vorläuferlösung 5 min lang UV-Licht mit einer Intensität von 10 mW/cm2 belichtet, was auf der Grundlage früherer Studien39 ausreichend Zeit und Lichtintensität war, um eine vollständige Vernetzung zu gewährleisten, wie sie durch photocrosslinking oszillierende Scherrheologie-Zeitfeger bestimmt wurde.
      HINWEIS: Um eine vollständige Fotovernetzung innerhalb der Spritze zu gewährleisten, kann die Spritze in der Mitte der Fotoverkettungsperiode umgedreht werden.
    4. Schalten Sie die UV-Lampe aus und entfernen Sie die Spritze. Stellen Sie sicher, dass das Hydrogel jetzt in der Spritze fotovernetzt ist. Dies kann erreicht werden, indem der Kolben zurückgezogen und beobachtet wird, wie sich das Hydrogel als fester Block und nicht als viskose Flüssigkeit bewegt.

figure-protocol-1
Abbildung 1: Übersicht über die Herstellung von Bulk-Hydrogelen in einer Spritze mittels Fotovernetzung. Die Abbildung zeigt (A) das Entfernen des Kolbens aus der Spritze, (B) das Befestigen der Spitzenkappe am Spritzenfass, (C) das Hinzufügen von Hydrogelvorläufer zum Spritzenfass, (D) das Zurückführen des Kolbens in die Spritze, (E) das Entfernen überschüssiger Luft und das Sichern der Spitzenkappe und (F) das Photovernetzen von Hydrogel in der Spritze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Herstellung von Mikrogelen mittels Extrusionsfragmentierung

HINWEIS: Eine Übersicht über die Mikrogelherstellung mittels Extrusionsfragmentierung ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. Entfernen Sie den Kolben von der Rückseite einer leeren 3-ml-Spritze. Befestigen Sie eine Tip Cap am Luer-Lock.
  2. Entfernen Sie die Spitzenkappe von der Spritze, die das photovernetzte Bulk-Hydrogel enthält. Richten Sie die Oberseite der Hydrogelspritze mit der Öffnung des Zylinders auf der leeren Spritze aus.
  3. Extrudieren Sie das Bulk-Hydrogel durch die Spritzenöffnung (keine Nadel angebracht) in den Lauf der leeren Spritze. Entsorgen Sie die jetzt leere Spritze (die früher das Hydrogel enthielt) ordnungsgemäß in den richtigen Abfallstrom.
  4. Halten Sie die Spritze, die das extrudierte Hydrogel enthält, so, dass die Spitzenkappe nach unten zeigt und die Fassöffnung nach oben zeigt. Mit einer 1.000-μL-Pipette 1,5 ml PBS in den Spritzenzylinder geben.
  5. Richten Sie den Spritzenkolben mit der Öffnung des Laufs aus und drücken Sie den Kolben gerade noch so weit ein, dass eine Abdichtung entsteht. Drehen Sie die Spritze so um, dass der Kolben jetzt nach unten zeigt und die Spitzenkappe nach oben zeigt, und stellen Sie sicher, dass der Kolben und der Spritzenlauf zusammengehalten werden, damit kein Hydrogel oder PBS austritt. Mehrmals invertieren, um das fragmentierte Hydrogel mit dem hinzugefügten PBS zu mischen.
  6. Halten Sie die Spritze so, dass die Spitzenkappe nach oben und der Kolben nach unten zeigt. Entfernen Sie die Spitzenkappe. Drücken Sie den Kolben sehr vorsichtig nach oben, um Luft aus dem Inneren der Spritze zu entfernen.
    HINWEIS: Es wird wahrscheinlich eine Rille auf der Rückseite der 3-ml-Spritze geben, die zusätzliche Kraft erfordert, um den Kolben hineinzudrücken. Sehr vorsichtig den Kolben über die Nut schieben. Jede plötzliche oder harte Menge an Kraft führt dazu, dass sich der Kolben zu schnell bewegt und möglicherweise die fragmentierte Hydrogelsuspension ausstößt.
  7. Extrudieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension durch eine Reihe von Nadeln, um fragmentierte Mikrogele zu erzeugen.
    1. Befestigen Sie eine 18-G-Nadel mit stumpfer Spitze an der Oberseite der Spritze, die das fragmentierte Hydrogel und PBS enthält. Entfernen Sie den Kolben aus einer frischen 3-ml-Spritze und befestigen Sie eine Spitzenkappe am leeren Spritzenlauf.
    2. Extrudieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension durch die 18 G-Nadel in die Rückseite des leeren Spritzenfasses. Entsorgen Sie die leere Spritze und die Nadel in den richtigen Abfallstrom für scharfe Gegenstände.
    3. Halten Sie die Spritze, die die fragmentierte Hydrogelsuspension enthält, so, dass die Spitzenkappe nach unten zeigt und die Lauföffnung nach oben zeigt. Richten Sie den Spritzenkolben mit der Öffnung des Laufs aus und drücken Sie den Kolben gerade noch so weit ein, dass eine Abdichtung entsteht.
    4. Drehen Sie die Spritze so um, dass der Kolben jetzt nach unten zeigt und die Spitzenkappe nach oben zeigt, und stellen Sie sicher, dass der Kolben und der Spritzenlauf zusammengehalten werden, damit kein Hydrogel oder PBS austritt.
    5. Halten Sie die Spritze so, dass die Spitzenkappe nach oben und der Kolben nach unten zeigt. Entfernen Sie die Spitzenkappe. Drücken Sie den Kolben sehr vorsichtig nach oben, um Luft aus dem Inneren der Spritze zu entfernen. Siehe den obigen HINWEIS zum sanften Drücken des Spritzenkolbens nach innen, um einen unerwünschten Ausstoß von Hydrogelmaterial zu verhindern.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 2.7.1-2.7.5 mit einer Nadel mit 23 G, 27 G und 30 G. Beim letzten Extrusionsschritt (30 G Nadel) extrudieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen. Für die hierin beschriebenen Volumina beträgt das endgültige fragmentierte Hydrogel-Suspensionsvolumen ~ 2,5 ml, was zwei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (gleichmäßige Volumenverteilung) erfordert.
      HINWEIS: Es sollte keine übermäßige Kraft erforderlich sein, um fragmentierte Hydrogelsuspension durch die Nadeln zu extrudieren. Für bewährte Sicherheitspraktiken wird empfohlen, alle Extrusionsfragmentierungsschritte innerhalb einer chemischen Haube durchzuführen, um Schutz im Falle einer Überbeaufschlagung der Spritze während der Extrusion zu bieten. Darüber hinaus kann dieser Prozess problemlos in einer Biosicherheitswerkbank / Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um die Sterilität während der Herstellung aufrechtzuerhalten. Weitere Vorschläge zur Fehlerbehebung finden Sie unter Diskussion.
  8. Waschen und isolieren Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension.
    HINWEIS: Das Waschen fragmentierter Mikrogele hilft, nicht umgesetztes Polymer und Vernetzer zu entfernen. Darüber hinaus hilft die Zentrifugierung, die Mikrogele aus der Suspension zu isolieren, indem ein Pellet gebildet wird.
    1. Mit einer Mikrozentrifuge die fragmentierte Mikrogelsuspension mit 5.000 x g für 5 min nach unten drehen.
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 1 ml PBS zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das fragmentierte Mikrogele und Wirbel für 5-10 s enthält.
    3. Wiederholen Sie das Zentrifugieren und Waschen mit PBS 3x.

figure-protocol-2
Abbildung 2: Überblick über die Mikrogelherstellung mittels Extrusionsfragmentierung. Die Abbildung zeigt (A) das Extrudieren von Hydrogel in ein leeres Spritzenfass und das Zugabe von PBS, (B) das Sichern eines Kolbens in der Spritze mit fragmentiertem Hydrogel, (C) das Anbringen einer 18-G-Nadel und das Extrudieren einer fragmentierten Hydrogelsuspension in ein leeres Spritzenfass und (D) das Wiederholen von Extrusionsfragmentierungsschritten mit 23 G-, 27-G- und 30-G-Nadeln, Sammeln von fragmentierter Hydrogelsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen bei der endgültigen Extrusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Charakterisierung fragmentierter Mikrogele mit ImageJ

HINWEIS: Eine Übersicht über die Charakterisierung der fragmentierten Mikrogele mit ImageJ ist in Abbildung 3 dargestellt, ebenso wie repräsentative Ergebnisse zur Beschreibung von Größenverteilungen und Formen innerhalb einer Charge fragmentierter Mikrogele. Mikrogele sollten vor der Visualisierung fluoreszierend markiert werden. Zum Beispiel kann FITC-Dextran (2 MDa) mit hohem Molekülgewicht vor der Fragmentierung im Bulk-Hydrogel verkapselt werden, um fluoresceinmarkierte Mikrogele zu erzeugen.

  1. Kombinieren Sie 20 μL fragmentierte Mikrogelsuspension mit 180 μL PBS, um eine verdünnte fragmentierte Mikrogelsuspension zu erzeugen. Vortex zum gründlichen Mischen.
  2. Übertragen Sie 50 μL verdünnte fragmentierte Mikrogelsuspension auf einen Objektträger des Glasmikroskops.
  3. Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um Bilder von fluoreszierend markierten Mikrogelen mit 4-fachem oder 10-fachem Zoom aufzunehmen.
    HINWEIS: Die Mikrogel-Suspension sollte so verdünnt sein, dass benachbarte Mikrogele nicht miteinander in Kontakt kommen, aber so konzentriert, dass Dutzende von Mikrogelen im Ansichtsfenster sichtbar sind. Die Verdünnung der Mikrogelsuspension kann entsprechend angepasst werden, um dies zu erreichen.
  4. Verwenden von ImageJ zur Analyse fragmentierter Mikrogelpartikel. Weitere Informationen zur Verwendung der Funktion "Partikel analysieren" in ImageJ finden Sie unter dem Link in der Materialtabelle.
    1. Öffnen Sie die Bilder von Mikrogelen in Suspension in ImageJ.
    2. Wählen Sie Analysieren > Maße, Prüfbereich, Formdeskriptoren und Feret-Durchmesser festlegen. Klicken Sie auf OK.
    3. Wählen Sie Bild > Geben Sie > 8-Bit ein.
    4. Wählen Sie Bild > passen Sie > Schwellenwert an. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass Mikrogele von einer roten Maske bedeckt sind und der Hintergrund schwarz bleibt. Klicken Sie auf Übernehmen.
      HINWEIS: Wenn sich Mikrogele leicht überlappen, zeichnen Sie mit dem Bleistiftwerkzeug eine dünne schwarze Linie (<5 Pixel) zwischen Mikrogelen, um sie im Schwarz-Weiß-Bild zu trennen.
    5. Wählen Sie Analysieren > Partikel analysieren aus. Legen Sie die Größe (Pixel2) von 50-Infinity fest, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Setzen Sie die Zirkularität auf 0,00-1,00. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Umrisse anzeigen aus. Überprüfen Sie die Anzeigeergebnisse, schließen Sie sie an Kanten aus und schließen Sie Löcher ein. Lassen Sie die verbleibenden Kontrollkästchen deaktiviert. Klicken Sie auf OK.
    6. Es öffnet sich eine Ergebnisanzeige, einschließlich der Fläche, der Formbeschreibungen und der Feret-Durchmesserinformationen für jedes identifizierte Mikrogel. Kopieren Sie die Ergebnisse und fügen Sie sie in eine Tabelle ein.
    7. Bestimmen Sie den äquivalenten Kreisdurchmesser für jedes Partikel.
      1. Beziehen Sie die Bildskala in μm/Pixel aus der Skalenleiste oder den Instrumenteninformationen. Erstellen Sie eine Spalte in der Tabelle, die die Fläche jedes Mikrogels von Pixel 2 in μm2 umwandelt.
      2. Verwenden Sie die Fläche in μm2, um den äquivalenten Kreisdurchmesser des Mikrogels in μm zu bestimmen (d. h. nehmen Sie die Quadratwurzel der Fläche geteilt durch Pi und verdoppeln Sie sie).
    8. Verwenden Sie die μm/Pixel-Skala, um die Durchmesser des Feret (d. h. den längsten Abstand zwischen zwei beliebigen Punkten an der Partikelgrenze) für jedes Mikrogel in eine Einheit von μm umzuwandeln.
    9. Zirkularität ("Circ."), Seitenverhältnis ("AR"), Rundheit ("Rundheit") und Festigkeitswerte für jedes Mikrogel können so verwendet werden, wie es direkt aus ImageJ stammt.
    10. Analysieren Sie die Mikrogelpopulation wie gewünscht unter Berücksichtigung der Verteilung der Durchmesser (äquivalente kreisförmige und Feret-Durchmesser), der Zirkularität, des Seitenverhältnisses, der Rundheit und der Festigkeit.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Überblick über die Charakterisierung fragmentierter Mikrogelpartikel mit ImageJ. Die Abbildung zeigt (A) die Erstellung einer verdünnten Suspension von fragmentierten Mikrogelpartikeln und die Verwendung eines epifluoreszierenden oder konfokalen Mikroskops zur Abbildung von Mikrogelen in Suspension (Skalenbalken = 500 μm), (B) die Umwandlung in ein binäres Bild in ImageJ und die Analyse von Partikeln (Anzahl, Formdeskriptoren usw.) und (C) repräsentative Ergebnisse. Fehlerbalken zeigen min und max mit abgegrenzten inneren Quartilsbereichen. Es wird eine Populationsgröße von n = 100 Mikrogelen angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Zusammensetzen von fragmentierten Mikrogelen zu granularen Hydrogelen

HINWEIS: Es werden zwei Methoden zur Formulierung von granularen Hydrogelen aus fragmentierten Mikrogelen vorgestellt, die Zentrifugation und Filtration verwenden. Die verwendete Methode hängt von der gewünschten Mikrogelpackung ab (d. H. Filtrationspackungen Partikel dichter) und ob biologische Komponenten enthalten sind (dh die Zentrifugation hält Komponenten zwischen den Partikeln zurück, während diese bei der Filtration verloren gehen können). Frühere Arbeiten40 beschreiben ausführlich vergleichende Ergebnisse (d.h. Mechanik, Porosität) für granulare Hydrogele, die entweder durch Zentrifugen- oder vakuumgetriebene Filtration gebildet werden.

  1. Option 1: Marmeln fragmentierter Mikrogele mittels Zentrifugation.
    1. Nachdem Sie den PBS-Überstand aus dem letzten Waschschritt entfernt haben, geben Sie 1 ml PBS in jedes Mikrozentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Mikrogele.
    2. Drehen Sie die fragmentierte Hydrogel-Suspension bei 18.000 x g für 5 min herunter.
      HINWEIS: Langsamere Zentrifugengeschwindigkeiten können für die Verklemmung von Mikrogelen in granulare Hydrogele mit weniger dichter Packung verwendet werden, falls gewünscht.
    3. Entfernen Sie den PBS-Überstand.
    4. Besorgen Sie sich eine frische 3-ml-Spritze und entfernen Sie den Kolben. Verwenden Sie einen Metallspatel, um das fragmentierte körnige Hydrogel aus dem Mikrozentrifugenröhrchen zu schöpfen und in die Rückseite des leeren Spritzenfasses zu geben. Eine Pipettenspitze kann verwendet werden, um die Übertragung des granularen Hydrogels in die Spritze zu unterstützen. Bringen Sie den Kolben in die Spritze zurück. Laden Sie nun das fragmentierte körnige Hydrogel in die Spritze, und es ist einsatzbereit.
  2. Option 2: Stampfen fragmentierter Mikrogele mittels vakuumgetriebener Filtration. Eine Übersicht über das Stau durch vakuumbetriebene Filtration ist in Abbildung 4 dargestellt.
    1. Montieren und testen Sie die vakuumbetriebene Filtrationsvorrichtung.
      1. Befestigen Sie einen Buchner-Trichter in einem Filterkolben und platzieren Sie den Filteradapter zwischen dem Trichter und der Kolbenöffnung.
      2. Verwenden Sie Schläuche, um den Filterkolben an eine Vakuumleitung anzuschließen.
      3. Legen Sie einen Membranfilter (0,22 μm) in den Buchner Trichterbecher.
      4. Schalten Sie die Vakuumleitung ein, indem Sie das Wählschieber öffnen. Testen Sie die Verbindung, indem Sie ~ 0,5 ml PBS auf den Membranfilter pipettieren und beobachten Sie, dass das gesamte PBS durch den Filter geht und sich im Boden des Filterkolbens sammelt.
    2. Schalten Sie die Vakuumleitung ein und sorgen Sie für eine vollständige Abdichtung. Wirbeln Sie die fragmentierte Hydrogelsuspension so auf, dass Mikrogele in PBS suspendiert werden.
    3. Mit einer 1.000 μL Pipette wird die fragmentierte Hydrogelsuspension auf den Membranfilter (0,22 μm) übertragen. Nachdem Sie die gesamte Mikrogelsuspension übertragen haben, warten Sie ~ 30 s, bis das Vakuum PBS aus der fragmentierten Hydrogelsuspension gezogen hat. Schalten Sie die Vakuumleitung aus.
      HINWEIS: Die Zeit, in der die fragmentierte Hydrogelsuspension beim Ziehen des Vakuums auf dem Membranfilter sitzt, kann variiert werden. Weitere Informationen und Vorschläge zur Fehlerbehebung finden Sie unter Diskussion.
    4. Besorgen Sie sich eine frische 3-ml-Spritze und entfernen Sie den Kolben. Verwenden Sie einen Metallspatel, um das fragmentierte körnige Hydrogel aus dem Filter zu schöpfen und in die Rückseite des leeren Spritzenfasses zu geben. Eine Pipettenspitze kann verwendet werden, um die Übertragung des granularen Hydrogels in die Spritze zu unterstützen. Bringen Sie den Kolben in die Spritze zurück. Laden Sie das fragmentierte körnige Hydrogel in die Spritze, und es ist jetzt einsatzbereit.

figure-protocol-4
Abbildung 4: Übersicht über das Stören von Mikrogelen durch vakuumgetriebene Filtration zur Herstellung dicht gepackter fragmentierter granularer Hydrogele. Die Abbildung zeigt (A) das Anbringen eines Membranfilters auf die Vakuumfiltrationsvorrichtung, (B) die Verwendung einer Pipette zum Übertragen einer fragmentierten Mikrogelsuspension auf den Filter, (C) das Ziehen des Vakuums und das Warten darauf, dass sich Mikrogele verklemmen und ein granulares Hydrogel bilden, (D) das Ausschalten des Vakuums und das Entfernen von fragmentiertem körnigem Hydrogel mit einem Metallspatel und (E) die Verwendung eines Metallspatels, um granulares Hydrogel auf die Spritze zu übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Extrusionsdruck mit granularen Hydrogelfarben

HINWEIS: Eine Übersicht über den Extrusionsdruckprozess ist in Abbildung 5 dargestellt, einschließlich eines repräsentativen Drucks eines sternförmigen Konstrukts unter Verwendung fragmentierter granularer Hydrogele, die mit vakuumgetriebener Filtration verstopft sind. Der Druckworkflow besteht aus der Formulierung einer Tinte, der Planung des Druckdesigns und dem anschließenden Drucken der Tinte basierend auf dem gewünschten Design41. Auf Wunsch können gedruckte granulare Hydrogelkonstrukte mittels Photocrosslinking Post-Extrusion stabilisiert werden, indem überschüssiges DTT (5 mM) und I2959 (0,05 Gew.%) zu der fragmentierten Mikrogelsuspension vor dem Jammen. Dies führt zu photovernetzten kovalenten Bindungen, die zwischen den Mikrogelen gebildet werden, was zu einer dauerhaften Stabilisierung des granularen Hydrogelkonstrukts führt.

  1. Tintenformulierung
    1. Berücksichtigen Sie während des Planungsprozesses die Eigenschaften der zu verwendenden Tinte. Um die Tinte zu charakterisieren, führen Sie die rheologische Analyse der fragmentierten Hydrogele durch, um den Druckdesignprozess zu unterstützen. Methoden, die die rheologische Charakterisierung granularer Hydrogele beschreiben, werden an anderer Stelle beschrieben und können für diese Studieangepasst werden 40.
    2. Wählen Sie aus der rheologischen Analyse eine Druckplattform und eine Reihe von anfänglichen Druckparametern aus.
      HINWEIS: Aufgrund der insgesamt hohen Viskosität und der scherdünnenden Eigenschaften von granularen Hydrogeltinten werden typischerweise schneckenbasierte Extrusionsdrucker verwendet.
  2. Print-Design
    HINWEIS: Die Repetier Host-Software (im Folgenden als 3D-Drucksoftware bezeichnet) wird für 3D-Druckanwendungen verwendet (Schritte 5.2-5.3).
    1. Erstellen Sie die Druckentwürfe mit CAD-Software (Computer Aided Design). Benutzer können neuartige Designs von Grund auf neu erstellen oder bereits vorhandene Designs ändern, z. B. aus Patientengewebescans oder von anderen Benutzern. Weitere Informationen zur Erstellung von CAD-Konstruktionen finden Sie unter den folgenden Referenzen41,42,43.
    2. Um CAD-Modelle in G-Code zu verarbeiten, stellen Sie sicher, dass die CAD-Datei im Format ".stl" (Supplemental File 1) gespeichert und in die 3D-Drucksoftware hochgeladen wird, indem Sie die Schaltfläche Laden im oberen Bereich oder Datei > Laden in der Menüleiste auswählen. Dieser G-Code definiert den Druckpfad für die Abscheidung der Tinte. Eine Beispiel-STL-Datei eines Hohlzylinders wurde in die ergänzenden Dateien aufgenommen.
    3. Sobald eine STL-Datei in die 3D-Drucksoftware hochgeladen wurde, navigieren Sie zum Slicer-Bedienfeld und wählen Sie Slic3r als Slicer-Option. Hier können Einstellungen wie Düsendurchmesser, Schichthöhe, Druckgeschwindigkeit und Extrusionsrate basierend auf der Tintencharakterisierung und den gewünschten Druckergebnissen angepasst werden. In diesem Protokoll wird eine 18 G Nadel (Innendurchmesser von 838 μm) verwendet. Die Schichthöhe ist auf 1 mm, die Druckgeschwindigkeit auf 8 mm/s und die Durchflussrate auf 9 μL/s eingestellt, basierend auf der vorherigen Optimierung39. Numerische Werte von Parametern können um ± 20% angepasst werden, um Variationen in den Eigenschaften von granularen Hydrogeltinten Rechnung zu tragen.
      HINWEIS: Es ist wichtig zu beachten, dass diese Einstellungen und das Druckdesign möglicherweise durch iterative experimentelle Tests angepasst werden müssen, abhängig von Anpassungen an der Tintenformulierung, der gewünschten Druckauflösung oder der verwendeten Druckplattform. Weitere Informationen zu diesen Parametern sowie zur Charakterisierung von Druckeinstellungen mit einer neuartigen Farbrezeptur finden Sie unter anderen Referenzen40,44,45,46.
  3. Extrusionsdruck mit fragmentierten granularen Hydrogelen
    1. Zum Beladen von Spritzen mit fragmentierten körnigen Hydrogelen siehe 4.2.4 sowie Abbildung 4 und Abbildung 5.
    2. Entfernen Sie die Spitzenkappe und ersetzen Sie sie durch eine Nadel Ihrer Wahl.
    3. Laden Sie die Spritze in die Druckplattform Ihrer Wahl. Hier kommt ein speziell angefertigter schneckenbasierter Extrusionsdrucker zum Einsatz.
      HINWEIS: Informationen zum Erstellen von benutzerdefinierten Bioprintern finden Sie unter Andere Referenzen44,47.
    4. Laden Sie die vorbereitete G-Code-Datei aus der Planungsphase in die 3D-Drucksoftware. Navigieren Sie zum Bedienfeld "Druckvorschau" und drücken Sie auf Drucken.
    5. Sobald die Druckabscheidung abgeschlossen ist, setzen Sie die fragmentierten granularen Hydrogelkonstrukte UV-Licht aus, um sie zu vernetzen und zu stabilisieren.
    6. Sobald die Vernetzung abgeschlossen ist, verarbeiten Sie die Probe, indem Sie sie dreimal in PBS waschen.

figure-protocol-5
Abbildung 5: Überblick über den Extrusionsdruck mit fragmentierten Granulathydrogelen. Die Abbildung zeigt (A) mit einem Spatel fragmentiertes granulares Hydrogel in einen Spritzenzylinder, (B) das Anbringen einer stumpfen Nadel (18 G gezeigt) und das Schieben der Probe nach oben, (C) eine Grafik, die die Verbindung zu Computersoftware zum Drucken darstellt, und (D) die Vervollständigung des Drucks eines sternförmigen Konstrukts mit fragmentiertem granuliertem Hydrogel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Repräsentative Ergebnisse dieser Protokolle sind in Abbildung 3 und Abbildung 6 dargestellt. Die Extrusionsfragmentierung ergibt Mikrogele mit gezackten Polygonformen mit Durchmessern von 10-300 μm (Abbildung 3). Darüber hinaus reicht die Zirkularität von 0,2 (nicht kreisförmig) bis fast 1 (perfekter Kreis), und das Seitenverhältnis reicht von 1 bis 3 (Abbildung 3). Diese Parameter beschreiben die unreg...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin werden Verfahren zur Herstellung granularer Hydrogele unter Verwendung von extrusionsfragmentierten Mikrogelen und zum Verpacken entweder durch Zentrifugation oder vakuumgetriebene Filtration beschrieben. Im Vergleich zu anderen Mikrogelherstellungsmethoden (z. B. Mikrofluidik, Batch-Emulsionen, Elektrospritzen, Photolithographie) ist die Herstellung von Extrusionsfragmentierung von Mikrogelen sehr schnell, kostengünstig, leicht skalierbar und für eine Vielzahl von Hydrogelsystemen zugänglich. Darüber hinaus ist d...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation durch das UPenn MRSEC-Programm (DMR-1720530) und Graduiertenforschungsstipendien (für V.G.M und M.E.P.) und die National Institutes of Health (R01AR077362 bis J.A.B.) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Konisches Zentrifugenröhrchen aus 15 ml KunststoffCorning430766
30 G NT Premium Series DosierspitzeJensen GlobalJG30-0.5HPXDie hier aufgeführte Katalognummer gilt für 30 G, 0,5" Nadel. Es stehen verschiedene Größen zur Verfügung.
BD Einwegspritzen mit Luer-Lok-Spitzen (3 mL)Fisher Scientific14-823-435gilt für eine 3-ml-Spritze. Es sind verschiedene Größen erhältlich (14-823-XXX).
Schwarze MappenVerschiedene Anbieter
Einweg-Sondennadel zur Verwendung mit Spritzen und Dosiermaschinen (18 G, 0,5")Grainger5FVH5Die hier aufgeführte Katalognummer gilt für 18 G, 0,5" Nadel. Es stehen verschiedene Größen zur Verfügung.
Einweg-Sondennadel zur Verwendung mit Spritzen und Dosiermaschinen (23 g, 0,5")Grainger5FVJ3
Einweg-Sondennadel zur Verwendung mit Spritzen und Dosiermaschinen (27 g, 1,5") Grainger5FVL0
Dulbecco's phosphatgepufferte KochsalzlösungFisher Scientific14190-250Die hier aufgeführte Katalognummer gilt für einen Karton mit 10 x 500 ml-Flaschen.
Durapore Membranfilter, 0,22 & Mikro; mMilliporeGVWP04700
Epifluoreszierendes oder konfokales MikroskopVerschiedene AnbieterZur Visualisierung von Mikrogelen und körnigen Hydrogelen
Eppendorf Snap-Cap Mikrozentrifuge Safe-Lock TubesFisher Scientific05-402-25
ExtrusionsdruckerSonderanfertigungenAndere Extrusionsdrucker können verwendet werden, wie z.B. kommerziell erhältliches BIOX.
FilteradapterFisher Scientific05-888-107Die hier aufgeführte Katalognummer gilt für einen Satz mehrerer Größen. Es sind verschiedene Größen erhältlich (05-888-XXX).
FilterkolbenVerschiedene Hersteller
Fluorescein Isothiocyanat-Dextran (2 MDa)Sigma-Aldrich52471
Glasmikroskop-ObjektträgerVerschiedene Anbieter
ImageJNational Institutes of Health"Partikel analysieren" Informationslink: https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html
LaptopVerschiedene Anbieter
Luer-Lock-SpitzenkappenIntegrierte Dispensin-Lösungen9991329
Metallspatel zum SchöpfenVerschiedene Anbieter
MikrozentrifugeVerschiedene Anbietereine Geschwindigkeit von bis zu 18.000 x g
erreichen Microscoft ExeclMicrosoftEs können auch andere Programme verwendet werden, wie z. B. Google Slides.
OmniCure S2000 Spot UV-HärtungssystemExcelitas TechnologiesS2000Auf Wunsch können verschiedene Lichtsysteme zur Herstellung von Bulk-Hydrogelen verwendet werden.
Buchner-Trichter aus Porzellan mit festem LochblechFisher ScientificFB966Cgilt für Platten mit einem Durchmesser von 56 mm. Es stehen verschiedene Größen zur Verfügung.
RadiometerVerschiedene Anbieter
Repetier HostHot-World GmbH & Co. KG3D-Drucksoftware
Schraubenbasierter ExtrusionsdruckerVerschiedene AnbieterIn dieser Studie wurde ein speziell modifizierter 3D-FDM-Drucker (Velleman K8200) verwendet. Viele Alternativen stehen zur Verfügung.
Solidworks/CAD-SoftwareDassault Systè können auch andere Programme verwendet werden, wie z.B. Blender oder TinkerCAD.
Schlauch zum Verbinden der Filterflasche mit der VakuumleitungVerschiedene Anbieter
UV-Augenschutz (z. B. Schutzbrillen)Verschiedene Anbieter
Die hier aufgeführte Katalognummer von Kann Die hier aufgeführte Katalognummer von Es

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  2. Qazi, T. H., Burdick, J. A. Granular hydrogels for endogenous tissue repair. Biomaterials and Biosystems. 1, 100008(2021).
  3. Riley, L., Schirmer, L., Segura, T. Granular hydrogels: emergent properties of jammed hydrogel microparticles and their applications in tissue repair and regeneration. Current Opinion in Biotechnology. 60, 1-8 (2019).
  4. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076(2019).
  5. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  6. Xin, S., Chimene, D., Garza, J. E., Gaharwar, A. K., Alge, D. L. Clickable PEG hydrogel microspheres as building blocks for 3D bioprinting. Biomaterials Science. 7 (3), 1179-1187 (2019).
  7. Hirsch, M., Charlet, A., Amstad, E. 3D printing of strong and tough double network granular hydrogels. Advanced Functional Materials. 31 (5), 2005929(2021).
  8. Seymour, A. J., Shin, S., Heilshorn, S. C. 3D printing of microgel scaffolds with tunable void fraction to promote cell infiltration. Advanced Healthcare Materials. 10 (18), 2100644(2021).
  9. Xin, S., et al. Generalizing hydrogel microparticles into a new class of bioinks for extrusion bioprinting. Science Advances. 7 (42), (2021).
  10. de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).
  11. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2021).
  12. Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1-8 (2018).
  13. Hsu, R. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520(2019).
  14. Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
  15. Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
  16. Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 1-12 (2021).
  17. Feng, Q., et al. Engineering the cellular mechanical microenvironment to regulate stem cell chondrogenesis: Insights from a microgel model. Acta Biomaterialia. 113, 393-406 (2020).
  18. Caldwell, A. S., Rao, V. V., Golden, A. C., Anseth, K. S. Porous bio-click microgel scaffolds control hMSC interactions and promote their secretory properties. Biomaterials. 232, 119725(2020).
  19. Muir, V. G., Qazi, T., Shen, J., Groll, J., Burdick, J. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  20. Jivan, F., et al. Sequential thiol-ene and tetrazine click reactions for the polymerization and functionalization of hydrogel microparticles. Biomacromolecules. 17 (11), 3516-3523 (2016).
  21. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in microporous annealed particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  22. Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
  23. Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1-7 (2018).
  24. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  25. Xin, S., Gregory, C. A., Alge, D. L. Interplay between degradability and integrin signaling on mesenchymal stem cell function within poly(ethylene glycol) based microporous annealed particle hydrogels. Acta Biomaterialia. 101, 227-236 (2020).
  26. Yao, M. H., et al. Directed self-assembly of polypeptide-engineered physical microgels for building porous cell-laden hydrogels. Chemical Communications. 50 (66), 9405-9408 (2014).
  27. Han, Y. L., et al. Directed self-assembly of microscale hydrogels by electrostatic interaction. Biofabrication. 5 (3), 035004(2013).
  28. Gehlen, D. B., et al. Granular cellulose nanofibril hydrogel scaffolds for 3D cell cultivation. Macromolecular Rapid Communications. 41 (18), 2000191(2020).
  29. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).
  30. Hsu, C. C., et al. Increased connectivity of hiPSC-derived neural networks in multiphase granular hydrogel scaffolds. Bioactive Materials. 9, 358-372 (2021).
  31. Feig, V. R., et al. Conducting polymer-based granular hydrogels for injectable 3D cell scaffolds. Advanced Materials Technologies. 6 (6), 2100162(2021).
  32. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Advanced Functional Materials. 30 (13), 1-10 (2020).
  33. Sinclair, A., et al. Self-healing zwitterionic microgels as a versatile platform for malleable cell constructs and injectable therapies. Advanced Materials. 30 (39), 1803087(2018).
  34. Kessel, B., et al. 3D bioprinting of macroporous materials based on entangled hydrogel microstrands. Advanced Science. 7 (18), 2001419(2020).
  35. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758(2015).
  36. Koetting, M. C., Guido, J. F., Gupta, M., Zhang, A., Peppas, N. A. pH-responsive and enzymatically-responsive hydrogel microparticles for the oral delivery of therapeutic proteins: Effects of protein size, crosslinking density, and hydrogel degradation on protein delivery. Journal of Controlled Release. 221, 18-25 (2016).
  37. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  38. Gramlich, W. M., Kim, I. L., Burdick, J. A. Synthesis and orthogonal photopatterning of hyaluronic acid hydrogels with thiol-norbornene chemistry. Biomaterials. 34 (38), 9803-9811 (2013).
  39. Muir, V. G., et al. Sticking together: Injectable granular hydrogels with increased functionality via dynamic covalent inter-particle crosslinking. Small. , 2201115(2022).
  40. Qazi, T. H., Muir, V. G., Burdick, J. A. Methods to characterize granular hydrogel rheological properties, porosity, and cell invasion. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2022).
  41. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  42. Pakhomova, C., Popov, D., Maltsev, E., Akhatov, I., Pasko, A. Software for bioprinting. International Journal of Bioprinting. 6 (3), 41-61 (2020).
  43. Junk, S., Kuen, C. Review of open source and freeware CAD systems for use with 3D-printing. Procedia CIRP. 50, 430-435 (2016).
  44. Bessler, N., et al. Nydus one syringe extruder (NOSE): A Prusa i3 3D printer conversion for bioprinting applications utilizing the FRESH-method. HardwareX. 6, 00069(2019).
  45. Skardal, A., et al. Bioprinting cellularized constructs using a tissue-specific hydrogel bioink. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53606(2016).
  46. Thayer, P. S., Orrhult, L. S., Martínez, H. Bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56372(2018).
  47. Pusch, K., Hinton, T. J., Feinberg, A. W. Large volume syringe pump extruder for desktop 3D printers. HardwareX. 3, 49-61 (2018).
  48. Ding, A., et al. Jammed micro-flake hydrogel for 4D living cell bioprinting. Advanced Materials. 34 (15), 2109394(2022).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Granular HydrogelsHydrogel FragmentationMicrogel FabricationExtrusion FragmentationBulk HydrogelsVacuum FiltrationCentrifugation MethodInjectable Hydrogels3D Printing InksBiomedical Applications

Verwandte Artikel