Methodenartikel

Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie

DOI:

10.3791/63895

⸱

19. Mai 2022

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1Mycobacteria Research Laboratories, Department of Microbiology Immunology & Pathology, Colorado State University, 2BioMARC, Infectious Disease Research Center, Colorado State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.

Zusammenfassung

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Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EVs) im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen hat sich als neuer Weg zum Verständnis der mikrobiellen Physiologie herauskristallisiert. Insbesondere Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs spielen eine Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern und der Reaktion auf Umweltstress. Mtb EVs sind auch stark antigen und zeigen Potenzial als Impfstoffkomponenten. Die gebräuchlichste Methode zur Reinigung von Mtb-EVs ist die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Dieser Prozess hat mehrere Einschränkungen, einschließlich geringem Durchsatz, geringer Ausbeute, Abhängigkeit von teurer Ausrüstung, technischen Herausforderungen und kann sich negativ auf die resultierende Vorbereitung auswirken. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist eine sanftere alternative Methode, die viele der Einschränkungen der Ultrazentrifugation bekämpft. Dieses Protokoll zeigt, dass SEC für die Mtb EV-Anreicherung wirksam ist und qualitativ hochwertige Mtb EV-Präparate mit erhöhtem Ertrag auf schnelle und skalierbare Weise produziert. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durch Quantifizierungs- und Qualifizierungsverfahren die Vorteile von SEC. Während die Bewertung der EV-Menge (Nanopartikel-Tracking-Analyse), des Phänotyps (Transmissionselektronenmikroskopie) und des Inhalts (Western Blotting) auf Mtb-EVs zugeschnitten ist, kann der bereitgestellte Workflow auf andere Mykobakterien angewendet werden.

Einleitung

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Die Freisetzung extrazellulärer Vesikel (EV) durch Krankheitserreger kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Technologien zur Bekämpfung von Infektionskrankheitensein 1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein Erreger von hoher Tragweite, der etwa ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert und jedes Jahr Millionen von Menschen das Leben fordert2. Die EV-Produktion durch Mtb ist gut dokumentiert, aber schwer fassbar in der Biogenese und den verschiedenen Rollen (d.h. immunstimulierend, immunsuppressiv, Eisen- und Nährstoffakquisition) dieser EVs im Zusammenhang mit der Infektion

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Protokoll

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Das Institutional Biosafety Committee der Colorado State University genehmigte die vorliegende Studie (19-046B). Die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis und die Ernte von EV-reichen Kulturüberständen wurden von geschultem Personal in einem High-Containment-Labor durchgeführt. Die Materialien wurden aus dem High-Containment-Bereich entfernt, nachdem eine gültige Inaktivierungsmethode durchgeführt, bestätigt und durch institutionelle Biosicherheitsrichtlinien genehmigt wurde. Während der Replikation des Protokolls, wenn eine validierte Inaktivierungs- oder Sterilfiltrationsmethode nicht möglich ist, müssen die folgenden Verfahren in einem High-Containme....

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Ergebnisse

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Kulturfiltratprotein (CFP) aus Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wurde konzentriert, quantifiziert und dann 3 mg Material auf eine SEC-Säule (Size Exclusion Chromatography) aufgetragen. Die Protein- und Partikelkonzentrationen wurden von BCA bzw. NTA aufgezählt. Die erwarteten Bereiche für die Protein- und Partikelrückgewinnung sowie die genauen Werte, die für diese Ergebnisse erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Werte, die viel höher als diese Bereiche sind, können auf Verunreinigungen.......

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Diskussion

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Mycobacterium tuberculosis extrazelluläre Vesikel sind stark antigene Reservoirs, die sie als attraktiven Weg für die Entwicklung von Diagnosewerkzeugen und zukünftigen Impfstoffendarstellen 4,19,20. In der Vergangenheit wurde die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet, um Mtb-EVs von anderem löslichen, sezernierten Materialzu trennen 8. Während dieser Prozess effektiv ist, ist er auch ze.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir möchten uns für die Unterstützung des College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award und des College Research Council Shared Research Program für NKG und die Finanzierung durch ATCC (Award # 2016-0550-0002) für KMD bedanken. Wir möchten auch Anne Simpson für die technische Unterstützung und BEI Resources, NIAID, NIH für die folgenden Reagenzien danken: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763), IT-54 (produziert in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produziert in vitro), NR-49223 und Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzi....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
20x MES SDS LaufpufferThermoFisher ScientificNP0002
96-Well-PlatteCorning15705-066
Automatischer FraktionssammlerIZON ScienceAFC-V1-USD
BenchMark Vorgefärbte ProteinleiterInvitrogen10748010
TischzentrifugeBeckman CoulterAllegra 6R
Centricon Plus - 70 Zentrifugalfilter, 100 kDa CutoffMillipore Sigma UFC710008Ultrafiltrationsgerät, das in Schritt 1.1 verwendet
Elektroblotting-SystemThermoFisher Scientific09-528-135
EM Grade ParaformaldehydElektronenmikroskopie Sciences15714-S
Formvar/Carbon 200 mesh Cu GridsElektronenmikroskopie SciencesFCF200H-Cu-TA
Ziege Anti-Maus IgG H& L (alkalische Phosphatase), ganzes Molekül, 1 mLAbCamab6790Sekundärantikörper
JEM-1400 TransmissionselektronenmikroskopJOEL
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23235
Mikroplatten-ReaderBIOTEKEpoch
Monoklonales Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3814c)BEI ResourcesNR-49223Primärer Antikörper
Monoklonaler Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763)BEI ResourcesNR-13792Primärer Antikörper
Monocolonaler Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Klon CS-35BEI ResourcesNR-13811Primärer Antikörper
NanoClean 1070Fischione InstrumentsFür die Plasmareinigung des TEM-Gitters
Nanosight ausgestattet mit Spritzenpumpe und Computer mit NanoSight NTA-SoftwareMalvern PanalyticalNS300
Nitrozellulosemembran, Rolle, 0,2 μ mBioRad1620112
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein GeleThermoFisher ScientificNP0323BOX
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Calcium undMagnesium Corning21-040-CV
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225
PowerPac Basic NetzteilBioRad1645050
qEV Original 35 nm 5/pkIZON ScienceSP5-USDSEC Säule
SDS ProbenpufferBosterAR1112Hauseigenes Rezept, das in diesem Verfahren verwendet wird, dieses Produkt ist jedoch gleichwertig
SDS-PAGE Gelkammer ThermoFisherScientificEI0001
Sigmafast BCIP/NBTMillipore SigmaB5655
Silberfleck Plus KitBioRad1610449Inhouse-Protokoll, das in diesem Verfahren verwendet wird, dieses Kit ist jedoch gleichwertig
UranylacetateElectron Micron Microscopy Sciences22400
wird

Referenzen

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  1. Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
  2. World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
  3. Prados-R....

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Schlagwörter

Mycobacterium Tuberculosis EVsExtracellular VesiclesSize Exclusion ChromatographyDensity Gradient UltracentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisTransmission Electron MicroscopyWestern BlotProtein QuantificationSDS PAGEHost Pathogen Interaction

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