Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.
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Methodenartikel
Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EVs) im Zusammenhang mit bakteriellen Infektionen hat sich als neuer Weg zum Verständnis der mikrobiellen Physiologie herauskristallisiert. Insbesondere Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EVs spielen eine Rolle bei der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern und der Reaktion auf Umweltstress. Mtb EVs sind auch stark antigen und zeigen Potenzial als Impfstoffkomponenten. Die gebräuchlichste Methode zur Reinigung von Mtb-EVs ist die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Dieser Prozess hat mehrere Einschränkungen, einschließlich geringem Durchsatz, geringer Ausbeute, Abhängigkeit von teurer Ausrüstung, technischen Herausforderungen und kann sich negativ auf die resultierende Vorbereitung auswirken. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) ist eine sanftere alternative Methode, die viele der Einschränkungen der Ultrazentrifugation bekämpft. Dieses Protokoll zeigt, dass SEC für die Mtb EV-Anreicherung wirksam ist und qualitativ hochwertige Mtb EV-Präparate mit erhöhtem Ertrag auf schnelle und skalierbare Weise produziert. Darüber hinaus zeigt ein Vergleich mit der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durch Quantifizierungs- und Qualifizierungsverfahren die Vorteile von SEC. Während die Bewertung der EV-Menge (Nanopartikel-Tracking-Analyse), des Phänotyps (Transmissionselektronenmikroskopie) und des Inhalts (Western Blotting) auf Mtb-EVs zugeschnitten ist, kann der bereitgestellte Workflow auf andere Mykobakterien angewendet werden.
Einleitung
Die Freisetzung extrazellulärer Vesikel (EV) durch Krankheitserreger kann der Schlüssel zur Erschließung neuer Technologien zur Bekämpfung von Infektionskrankheitensein 1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ist ein Erreger von hoher Tragweite, der etwa ein Drittel der Weltbevölkerung infiziert und jedes Jahr Millionen von Menschen das Leben fordert2. Die EV-Produktion durch Mtb ist gut dokumentiert, aber schwer fassbar in der Biogenese und den verschiedenen Rollen (d.h. immunstimulierend, immunsuppressiv, Eisen- und Nährstoffakquisition) dieser EVs im Zusammenhang mit der Infektion
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Protokoll
Das Institutional Biosafety Committee der Colorado State University genehmigte die vorliegende Studie (19-046B). Die Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis und die Ernte von EV-reichen Kulturüberständen wurden von geschultem Personal in einem High-Containment-Labor durchgeführt. Die Materialien wurden aus dem High-Containment-Bereich entfernt, nachdem eine gültige Inaktivierungsmethode durchgeführt, bestätigt und durch institutionelle Biosicherheitsrichtlinien genehmigt wurde. Während der Replikation des Protokolls, wenn eine validierte Inaktivierungs- oder Sterilfiltrationsmethode nicht möglich ist, müssen die folgenden Verfahren in einem High-Containme....
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Ergebnisse
Kulturfiltratprotein (CFP) aus Mycobacterium tuberculosis (Mtb) wurde konzentriert, quantifiziert und dann 3 mg Material auf eine SEC-Säule (Size Exclusion Chromatography) aufgetragen. Die Protein- und Partikelkonzentrationen wurden von BCA bzw. NTA aufgezählt. Die erwarteten Bereiche für die Protein- und Partikelrückgewinnung sowie die genauen Werte, die für diese Ergebnisse erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Werte, die viel höher als diese Bereiche sind, können auf Verunreinigungen.......
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Diskussion
Mycobacterium tuberculosis extrazelluläre Vesikel sind stark antigene Reservoirs, die sie als attraktiven Weg für die Entwicklung von Diagnosewerkzeugen und zukünftigen Impfstoffendarstellen 4,19,20. In der Vergangenheit wurde die Dichtegradienten-Ultrazentrifugation verwendet, um Mtb-EVs von anderem löslichen, sezernierten Materialzu trennen 8. Während dieser Prozess effektiv ist, ist er auch ze.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir möchten uns für die Unterstützung des College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award und des College Research Council Shared Research Program für NKG und die Finanzierung durch ATCC (Award # 2016-0550-0002) für KMD bedanken. Wir möchten auch Anne Simpson für die technische Unterstützung und BEI Resources, NIAID, NIH für die folgenden Reagenzien danken: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763), IT-54 (produziert in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (produziert in vitro), NR-49223 und Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (produzi....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 20x MES SDS Laufpuffer | ThermoFisher Scientific | NP0002 | |
| 96-Well-Platte | Corning | 15705-066 | |
| Automatischer Fraktionssammler | IZON Science | AFC-V1-USD | |
| BenchMark Vorgefärbte Proteinleiter | Invitrogen | 10748010 | |
| Tischzentrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Centricon Plus - 70 Zentrifugalfilter, 100 kDa Cutoff | Millipore Sigma UFC710008 | Ultrafiltrationsgerät, das in Schritt 1.1 verwendet | |
| Elektroblotting-System | ThermoFisher Scientific | 09-528-135 | |
| EM Grade Paraformaldehyd | Elektronenmikroskopie Sciences | 15714-S | |
| Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids | Elektronenmikroskopie Sciences | FCF200H-Cu-TA | |
| Ziege Anti-Maus IgG H& L (alkalische Phosphatase), ganzes Molekül, 1 mL | AbCam | ab6790 | Sekundärantikörper |
| JEM-1400 Transmissionselektronenmikroskop | JOEL | ||
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Mikroplatten-Reader | BIOTEK | Epoch | |
| Monoklonales Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3814c) | BEI Resources | NR-49223 | Primärer Antikörper |
| Monoklonaler Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gen Rv3763) | BEI Resources | NR-13792 | Primärer Antikörper |
| Monocolonaler Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Klon CS-35 | BEI Resources | NR-13811 | Primärer Antikörper |
| NanoClean 1070 | Fischione Instruments | Für die Plasmareinigung des TEM-Gitters | |
| Nanosight ausgestattet mit Spritzenpumpe und Computer mit NanoSight NTA-Software | Malvern Panalytical | NS300 | |
| Nitrozellulosemembran, Rolle, 0,2 μ m | BioRad | 1620112 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gele | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Calcium und | Magnesium Corning | 21-040-CV | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| PowerPac Basic Netzteil | BioRad | 1645050 | |
| qEV Original 35 nm 5/pk | IZON Science | SP5-USD | SEC Säule |
| SDS Probenpuffer | Boster | AR1112 | Hauseigenes Rezept, das in diesem Verfahren verwendet wird, dieses Produkt ist jedoch gleichwertig |
| SDS-PAGE Gelkammer ThermoFisher | Scientific | EI0001 | |
| Sigmafast BCIP/NBT | Millipore Sigma | B5655 | |
| Silberfleck Plus Kit | BioRad | 1610449 | Inhouse-Protokoll, das in diesem Verfahren verwendet wird, dieses Kit ist jedoch gleichwertig |
| Uranylacetate | Electron Micron Microscopy Sciences | 22400 |
Referenzen
- Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond. FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).
- World Health Organization. GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021. World Health Organization. , (2021).
- Prados-R....
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Nachdrucke und Genehmigungen
