Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה של המאפיינים המורפולוגיים של צומת נוירומוסקולרי בשריר גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63954
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

הפרוטוקול מראה שיטה לבחינת קורלציה מרחבית בין ההדקים הקדם-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים ותאי שוואן הפרי-סינפטיים בשריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית עם סמנים ביולוגיים שונים, כלומר נוירופילמנט 200, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי, אלפא-בונגארוטוקסין ו-S100.

Abstract

הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ) הוא מבנה מורכב המשרת את תקשורת האותות מהנוירון המוטורי לשריר השלד ומורכב משלושה מרכיבים היסטולוגיים חיוניים: מסופי האקסון המוטורי הטרום-סינפטיים, קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים (AchRs) ותאי שוואן פרי-סינפטיים (PSCs). על מנת להדגים את המאפיינים המורפולוגיים של NMJ, שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה נבחר כרקמה המטרה ונבדק על ידי שימוש בכתמים פלואורסצנטיים מרובים עם סוגים שונים של סמנים ביולוגיים, כולל נוירופילמנט 200 (NF200) וטרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי (VAChT) עבור סיבי העצב המוטוריים וההדקים הטרום-סינפטיים שלהם, אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX) עבור ה-AchRs הניקוטיניים הפוסט-סינפטיים, ו-S100 עבור ה-PSCs. במחקר זה בוצעו הכתמים בשתי קבוצות: בקבוצה הראשונה, הדגימות הוכתמו ב-NF200, VAChT ו-α-BTX, ובקבוצה השנייה הוכתמו הדגימות ב-NF200, α-BTX ו-S100. הוכח כי שני הפרוטוקולים יכולים להדגים ביעילות את המבנה המפורט של NMJ. באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי, נראו מאפיינים מורפולוגיים של ההדקים הטרום-סינפטיים, הקולטנים הפוסט-סינפטיים וה-PSC, ותמונות ערימות ה-Z שלהם שוחזרו בתבנית תלת-ממדית כדי לנתח עוד יותר את המתאם המרחבי בין התוויות השונות. מנקודת המבט של המתודולוגיה, פרוטוקולים אלה מספקים התייחסות רבת ערך לחקר המאפיינים המורפולוגיים של NMJ בתנאים פיזיולוגיים, אשר עשויים להתאים גם להעריך את השינוי הפתולוגי של NMJ, כגון פגיעה בעצבים היקפיים והתחדשות.

Introduction

כשלושה מרכיבים מבניים חיוניים של הצומת הנוירומוסקולרי (NMJ)1,2,3,4, נחקרו בהרחבה היבטים מורפולוגיים של מסופי האקסון המוטורי הקדם-סינפטי, הממברנה הפוסט-סינפטית המכילה קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (AchRs) ותאי שוואן פרי-סינפטיים (PSCs). מקטעים דקים ודגימות שלמות של שרירי השלד נבדקו בטכניקות היסטולוגיות שונות, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים 5,6, מיקרוסקופיה קונפוקלית 7,8 ומיקרוסקופיה של יריעות אור 9,10. למרות המאפיינים המורפולוגיים של NMJ הודגמו על ידי טכניקות אלה מהיבטים שונים, כהשוואה, מיקרוסקופיה קונפוקלית היא עדיין בחירה אידיאלית להדמיה של המורפולוגיה המפורטת של NMJ.

לאחרונה פותחו טכנולוגיות חדשות רבות להצגת הרכיבים המבניים של NMJ. לדוגמה, עכברים פלואורסצנטיים מהונדסים thy1-YFP שימשו ישירות לצפייה באקסונים מוטוריים ובלוחות קצה מנועים in vivo וב- in vitro10,11. בנוסף, הזרקה תוך ורידית של α-BTX פלואורסצנטיים יושמה כדי לחשוף את ההתפלגות המרחבית של לוחות קצה מוטוריים בשרירי שלד בהרכבה מלאה של עכברים פלואורסצנטיים מסוג פראי ומהונדס, על ידי שימוש בטיפול בפינוי אופטי של רקמות לבדיקה עם מיקרוסקופיה של יריעות אור 9,12. עם זאת, מלבד האלמנטים הטרום-סינפטיים והפוסט-סינפטיים שניתן לצפות בהם בשיטות מתקדמות אלה, לא ניתן להדגים את ה-PSCs בו-זמנית.

עדויות מצטברות מצביעות על כך ש- PSCs, כתאי הגליה ההיקפיים, קשורים קשר הדוק עם ההדקים הטרום-סינפטיים התורמים להתפתחות וליציבות של NMJ, לאפנון הפעילות הסינפטית של ה- NMJ במצב הפיזיולוגי, ולהתחדשות של ה- NMJ לאחר פגיעה עצבית 13,14,15 . בהתחשב בארכיטקטורה התאית של NMJ, פרוטוקול זה הוא מועמד ראוי לתייג בו זמנית את PSCs, אלמנטים טרום ואחרי סינפטיים, והוא עשוי לשמש להערכת השלמות והפלסטיות של NMJ בתנאים נורמליים ופתולוגיים. לדוגמה, השווה את עוצמת NMJ, המורפולוגיה והנפח של לוחות קצה מוטוריים פוסט-סינפטיים, עצבנות וניתוק עצבים של NMJ, ומספר PSCs בשרירים בעלי מצב פיזיולוגי ופתולוגי.

שריר הגסטרוקנמיוס הוא השריר הגדול ביותר היוצר את הבליטה בשוק, אשר מנותח בקלות על ידי הסרת העור ושריר הירך האחורי מהגפיים. השריר נבחר לעתים קרובות כדי להעריך ניוון שרירים, ניוון עצבימוסקולרי, ביצועי שרירים וכוח יחידה מוטורית ex vivo או in vivo 16,17,18. עם זאת, הטכניקה מתאימה גם לחשיפת המאפיינים המורפולוגיים של NMJ משרירי שלד שונים. יחד עם זאת, מקטעי השרירים העבים יכולים לחשוף מורפולוגיה מלאה יותר וכמות של NMJ בהשוואה למקטעים דקים 7,8 וסיבי שרירמתגרים 19.

בהתאם למחקרים אלה, שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה נבחר כרקמת המטרה במחקר זה ונפרס בעובי של 80 מיקרומטר לצורך צביעה פלואורסצנטית מרובה עם סוגים שונים של סמנים ביולוגיים בהתאם למרכיבים המבניים של NMJ. כאן, נוירופילמנט 200 (NF200)20,21, טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי (VAChT)22, אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX)23,24, ו-S10025,26 שימשו לסימון סיבי עצב, מסופים טרום-סינפטיים, AchRs פוסט-סינפטיים ו-PSCs בהתאמה. בנוסף, הרקע של רקמת השרירים וגרעיני התאים הוכתמו עוד יותר עם פאלואידין ו-DAPI.

במחקר זה, אנו מצפים לפתח פרוטוקול מעודן להכתמת הארכיטקטורה התאית של NMJ בו-זמנית עם הסמנים הביולוגיים המתאימים להם על דגימות קבועות עבות יותר, אשר נוח יותר לשימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ומסייע להשיג מידע רב יותר על המבנה המפורט של PSCs, אלמנטים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, כמו גם על המתאם המרחבי שלהם זה לזה. מנקודת המבט של המתודולוגיה, פרוטוקול זה עשוי להועיל להעריך את המאפיינים המורפולוגיים של NMJ בתנאים נורמליים ופתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ומוקסיבוסציה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (אישור מס '2021-04-15-1). כל ההליכים נערכו בהתאם למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון הבירה, 1996). נעשה שימוש בשלוש חולדות זכרים בוגרים (ספראג-דאולי, משקל 230 ± 15 גרם). החולדות שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם טמפרטורה ולחות מבוקרות ועם גישה חופשית למזון ולמים. המכשירים והחומרים של מחקר זה מוצגים באיור 1.

1. פרפוזיה

  1. הזריקו 250 מ"ג/ק"ג תמיסת טריברומואתנול תוך-צפקית כדי לגרום להמתת חסד של החולדות.
  2. לאחר הפסקת הנשימה, פתחו את חלל בית החזה כדי לגשת ללב באמצעות מספריים ומלקחיים. החדירו קטטר תוך ורידי מחדר הלב השמאלי לכיוון אבי העורקים, ולאחר מכן חתכו את האוריקל הימני.
  3. מכניסים את החולדות הניסיוניות למכסה המנוע. התחילו ב-100 מ"ל של 0.9% מי מלח רגילים עד שהדם היוצא מהאוריקל הימני יהיה צלול, ואז המשיכו לחדור עם 250-300 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 מ' חיץ פוספט (PB, pH 7.4) במשך כ-10 דקות עד שיהיה קשה לכופף את הזנב.

2. אנטומיה אזורית

  1. לאחר הזלוף, הסירו את העור של הגפה האחורית הדו-צדדית באמצעות להב כירורגי (איור 2A) וחשפו את העצב הסיאטי הדו-צדדי ואת שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי (איור 2B).
  2. נתחו בזהירות את שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי הדו-צדדי מהגפה האחורית באמצעות להב (איור 2C) ולאחר מכן תיקנו את השריר כולו ב-10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-0.1 M PB למשך שעתיים.
  3. הסר את השריר מהתמיסה והגן על השריר ב-10 מ"ל של 25% סוכרוז ב-0.1 M PB במשך יום אחד ב-4 מעלות צלזיוס עד שהשריר שקוע לחלוטין בתמיסה.

3. קריו-וסט של השריר

  1. לאחר שהרקמה השרירית שקועה בתמיסה, לתקן אותה בשלב הקפאה של מערכת מיקרוטום הזזה באמצעות מדיום חתך קפוא. פורסים את השריר אופקית לאורך הציר הארוך של השריר בעובי של 80 מיקרומטר.
  2. הניחו שבעה מקטעי קריו לבאר בצורה מסודרת בצלחת תרבית בת שש בארות עם 10 מ"ל של 0.1 M PB (pH 7.4) באמצעות מברשת.
    הערה: המקטעים ממוקמים לפי הסדר כך שהקטעים בבארות שונות יהיו סמוכים, מה שהופך את החלקים המשמשים לכתמים שונים לעקביים יותר.

4. כתמים פלואורסצנטיים מרובים עם NF200, VAChT, α-BTX ו-Pha

הערה: כתמים פלואורסצנטיים מרובים עם NF200, VAChT, α-BTX ו- Pha יושמו כדי לחשוף את סיבי העצב, ההדקים הטרום-סינפטיים, קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים וסיבי שרירים, בהתאמה.

  1. דגירה של ארבעה חלקים לכל באר עם 1.5 מ"ל של 0.1 M PB המכילים 75 μL של 10% Triton X-100 (0.5%) ו-45 μL של סרום חמור רגיל (3%) על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד למשך 30 דקות.
  2. מעבירים את החלקים ל-1.5 מ"ל של תמיסה מעורבת של נוגדנים ראשוניים המכילים אנטי-NF200 ארנב (1:1,000), אנטי-VAChT עזים (1:500) ב-0.1 M PB (pH 7.4) עם 1% סרום חמורים רגיל, ו-0.5% טריטון X-100, ודגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את הקטעים 3x למשך 5 דקות כל אחד ב-0.1 M PB (pH 7.4) על שייקר מסלולי ב-20 סל"ד.
  3. דגירו את החלקים ב-1.5 מ"ל של תמיסה מעורבת של נוגדנים משניים המכילים חמור נגד ארנב AF488 (1:500) ונגד חמורים AF546 (1:500), כמו גם את הסמנים הביולוגיים של α-BTX, AF647 (1:500) ופאלואידין 350 (1:500) ב-0.1 M PB (pH 7.4) המכיל 1% סרום חמורים רגיל ו-0.5% טריטון X-100 למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הגן מפני אור.
  4. לאחר שטיפה של 3x במשך 5 דקות כל אחד ב-0.1 M PB (pH 7.4), הרכיבו את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ. יש למרוח זכוכית כיסוי על החלקים באמצעות 50% גליצרין במים מזוקקים לתצפית.

5. צביעה פלואורסצנטית מרובה עם NF200, S100, α-BTX ו-DAPI

הערה: ההליכים דומים לאלה של שלב 4; ההבדל העיקרי הוא בין הנוגדנים הראשוניים לבין הנוגדנים המשניים המתאימים להם.

  1. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: נגד עוף נגד NF200 (1:6,000), אנטי-S100 ארנב (1:2,500) בשלב 4.2 והנוגדנים המשניים המתאימים להם: חמור נגד עוף AF488 (1:500) וחמור נגד ארנב AF546 (1:500), כמו גם הסמנים הביולוגיים של α-BTX AF647 (1:500) ו- DAPI (1:50000) בשלב 4.3.

6. תצפית וניתוח

  1. צפו בדגימה וצלמו תמונות באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית המצוידת בעדשות האובייקטיביות הבאות: עדשת 20x עם עדשת NA של 0.75 ו-40x עם NA של 0.95.
  2. השתמש באורכי גל של עירור ופליטה של 350 ננומטר (Pha), 488 ננומטר (NF200), 546 ננומטר (VAChT ו- S100), 647 ננומטר (α-BTX), או DAPI המתאים לצביעה הפלואורסצנטית המרובה. הגדר את הרזולוציה של לכידת תמונה ל- 640 x 640 פיקסלים.
    הערה: הרזולוציה של 640 x 640 פיקסלים נבחרה מכיוון שהתמונות צולמו בערימות Z. רזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים גורמת להדמיה איטית ולהלבנת תמונות בערימות Z.
  3. הגדר את מישור המוקד ההתחלתי ואת מישור המוקד הסופי. הגדר את גודל הצעד ל- 1 μm או 2 μm. בחר תבנית עומק, לכידת תמונה וסדרת Z.
  4. עבור תמונות ההגדלה התחתונה שצולמו ב-20x, צלם 40 תמונות (Z-stacks) בגודל צעד של 2 מיקרומטר מכל מקטע בעובי 80 מיקרומטר באמצעות חור סיכה של 105 מיקרומטר. בחר את מצב ההקרנה/טופוגרפיה ואת הקרנת העוצמה מעל ציר Z כדי לשלב את כל התמונות במוקד יחיד.
  5. עבור תמונות ההגדלה הגבוהה יותר שצולמו ב-40x, צלם 80 תמונות (Z-stacks) בגודל צעד של 1 מיקרומטר מכל מקטע בעובי 80 מיקרומטר עם זום המוגדר ל-2 וחור סיכה של 105 מיקרומטר. שלב את כל התמונות במוקד אחד.
  6. שחזר את התמונות בתבנית התלת-ממדית באמצעות מערכת עיבוד התמונה כפי שתואר קודם לכןב-27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר צביעה פלואורסצנטית מרובה, התווית המתאימה הודגמה בצורה מסודרת על החלקים בעובי של 80 מיקרומטר של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה עם סיבי עצב חיוביים ל-NF200, מסופים קדם-סינפטיים חיוביים ל-VAChT, AchRs פוסט-סינפטיים חיוביים α-BTX, PSCs חיוביים ל-S100, סיבי שרירים חיוביים לפאלואידין וגרעיני תאים המסומנים ב-DAPI (איור 3 ואיור 4).

הוכח כי סיבי עצב חיוביים של NF200 רצו בחבילה וחילקו ענפים למסופים הקדם-סינפטיים החיוביים של VAChT שיצרו קשר מראה עם ה-AchRs הפוסט-סינפטיים החיוביים α-BTX (איור 3). בנוסף, PSCs חיוביים ל-S100 זוהו סביב סיבי העצב החיוביים ל-NF200 קרוב לטרמינלים הטרום-סינפטיים (איור 4).

על-ידי ניצול שחזור התמונה, המתאם המרחבי של סיבי העצב, ההדקים הקדם-סינפטיים, ה-PSCs וה-AchRs הפוסט-סינפטיים הוצג עוד יותר בתבנית תלת-ממדית המציגה את המאפיינים המורפולוגיים המפורטים של NMJ מנקודות מבט שונות (איור 3C,C1 ואיור 4C,C1).

Figure 1
איור 1. תמונות של שלבי הפרוטוקול השונים. (א) להחדיר את החולדה למכסה המנוע. (B) לנתח את שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. (C) לחתוך את רקמת השרירים בשלב הקפאה של מערכת מיקרוטום הזזה. (ד) לאסוף חלקי רקמות בצורה מסודרת בצלחת בת שש בארות. (E) צביעה פלואורסצנטית על השייקר. (ו) לתלות את הקטעים על שקופיות מיקרוסקופ. (G) יש למרוח כיסויים על החלקים המכילים 50% גליצרין. (H) התבונן בדגימות באמצעות מערכת הדמיה קונפוקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2. הליך של אנטומיה אזורית לניתוח שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. (A) מבט מבחוץ על השרירים בגפה האחורית של החולדה. (B) מבט מבפנים על שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי ועל העצבנות שלו. (C) ניתוח שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3. קורלציה מרחבית של סיבי העצב, מסופים טרום-סינפטיים, קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים וסיבי שרירים על שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. (A) תמונה מייצגת משריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה המציגה את הכתמים הפלואורסצנטיים המרובים עם נוירופילמנט 200 (NF200), טרנספורטר אצטילכולין שלפוחיתי (VAChT), אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX) ופלואידין (Pha). (B) התמונה המוגדלת מלוח A (ראש חץ) המציגה את התוויות השונות בפירוט. B1-B4: לוח B מוצג בנפרד עם NF200 (B1), VAChT (B2), α-BTX (B3) ו-Pha (B4). (C) התמונות המותאמות מחלונית B עם המסגרת המציגה את התצוגה הקדמית של התבנית התלת-ממדית ב-(C) ואת התצוגה האחורית ב-(C1). אותו סרגל קנה מידה עבור B1-B4 כמו ב- B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
תרשים 4. קורלציה מרחבית של סיבי העצב, תאי שוואן פרי-סינפטיים, קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פוסט-סינפטיים וגרעיני תאים על שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. (A) תמונה מייצגת משריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה המציגה את הכתמים הפלואורסצנטיים המרובים עם נוירופילמנט 200 (NF200), סמן תאי שוואן (S100), אלפא-בונגארוטוקסין (α-BTX) וסמן גרעין התא 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול דיהידרוכלוריד (DAPI). (B) התמונה המוגדלת מלוח A (ראש חץ) המציגה את התוויות השונות בפירוט. B1-B4: הצג לוח B בנפרד עם NF200 (B1), S100 (B2), α-BTX (B3) ו- DAPI (B4). (C) התמונות המותאמות מלוח B עם המסגרת בתבנית תלת-ממדית ב-(C) והתצוגה ללא תיוג S100 ב-(C1). אותו סרגל קנה מידה עבור B1-B4 כמו ב- B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תיארנו את הפרטים הטכניים הנדרשים לביצוע צביעה מרובה מוצלחת של פרוסות שרירים ושימוש באימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית לחשיפת המאפיינים המורפולוגיים של NMJ על החלקים העבים של שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של החולדה. על ידי שימוש בגישה זו, ניתן לנתח ולהעריך את הפרטים הקטנים והמתאם המרחבי של ה-PSCs והאלמנטים הטרום-סינפטיים והפוסט-סינפטיים תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית, ולשחזר אותם עוד יותר בתבנית תלת-ממדית. כאן, סוגים שונים של סמנים ביולוגיים שימשו כדי לחשוף את המאפיינים המורפולוגיים של NMJ, שבו, NF200 מתבטא מאוד על האקסונים המיאלינים20,21, VAChT שנצבר במסופים הטרום-סינפטיים22, α-BTX מוצג על AchRs פוסט-סינפטי23,24, ו- S100 מוצג ב- PSCs25,26 . אם ניקח יחד את התוצאות שלנו ואלה ממחקרים קודמים, ניתן לשלב סמנים ביולוגיים אלה באופן חופשי כדי לתייג את האלמנטים המבניים של NMJ על פי התכנון הניסויי להערכת הקשר המרחבי שלהם זה לזה 1,28,29.

כדי להשיג הדמיה אידיאלית בטכניקה זו, הזמן שלאחר התיקון הוא נושא חשוב שיש לשים לב אליו מכיוון שקיבוע יתר עלול לגרום לרקע גבוה. לכן, מומלץ כי הזמן שלאחר התיקון לא צריך להיות מעל 2 שעות בפתרון התיקון. בנוסף, על מנת לצפות ביותר NMJ בחתכים שריריים, חשוב לפרוס את השריר אופקית לאורך הציר הארוך בעובי של 80 מיקרומטר, מה שיכול להדגים באופן מקיף את המתאם המרחבי של ההדקים הטרום-סינפטיים, ה-AchRs הפוסט-סינפטיים וה-PSCs ב-NMJ. כאן, יש להדגיש כי מיקרוטום הזזה הוא כלי נוח לחיתוך רקמת השרירים. באופן דומה, קריוסטאט וויברטום יכולים לשמש גם כדי לקבל חלקים עבים.

לסיכום, המאפיינים המורפולוגיים של NMJ נחקרו באופן נרחב מקטעים היסטולוגיים דו-ממדיים לרקמות תלת-ממדיות של הר שלם על ידי שימוש בטכניקות שונות. בהתחשב בטיפולי הרקמות המייגעים וגוזלי הזמן לבדיקה עם מיקרוסקופיית אלקטרונים ומיקרוסקופיה של יריעות אור, כתמים פלואורסצנטיים מרובים על חלק הרקמה העבה יותר הם עדיין גישה נוחה לחקור ביעילות את הארכיטקטורה הסטריאולוגית של NMJ באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי קרן החדשנות CACMS (לא. CI2021A03407), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ' 82004299), וקרנות המחקר הבסיסיות עבור מכוני המחקר המרכזיים לרווחת הציבור (לא. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride ThermoFisher D3571
Confocal laser scanning microscope Olympus FV1200
Donkey anti-chicken AF488 Jackson 149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546 ThermoFisher A11056
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher A21206
Donkey anti-rabbit AF546 ThermoFisher A10040
Frozen Section Medium ThermoFisher Neg-50 Colorless
Microscope cover glass Citotest 10212450C
Microtome Yamato REM-710
Neurofilament 200 Sigma-Aldrich N4142 Rabbit
Neurofilament 200 Abcam ab4680 Chicken
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch Laboratories 017-000-12 10 ml
Normal saline Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd H37022750 250 ml
Paraformaldehyde Macklin P804536 500g
Phalloidin AF350 ThermoFisher A22281
Precision peristaltic pump Longer BT100-2J
S100-β Abcam ab52642 Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrate Macklin S818118 500g
Sodium phosphate monobasic dihydrate Macklin S817463 500g
Sucrose Macklin S818046 500g
Superfrost plus microscope slides ThermoFisher 4951PLUS-001E
Triton X-100 Solarbio Life Sciences 9002-93-1 100 ml
Vesicular Acetylcholine Transporter Milipore ANB100 Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugate ThermoFisher B35450

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
  2. Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
  3. Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
  4. Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
  5. Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
  6. Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).
  7. Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
  8. Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
  9. Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
  10. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  11. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  12. Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
  13. Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
  14. Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
  15. Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
  16. Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
  17. Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
  18. Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
  19. Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
  20. Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
  21. Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
  22. Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).
  23. Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
  24. Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
  25. Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
  26. Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
  27. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  28. Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. Molecular architecture of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).
  29. Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).

Tags

מדעי המוח גיליון 183 צומת עצבי-שרירי נוירון מוטורי שרירי שלד תא שוואן פרי-סינפטי מסופים טרום-סינפטיים קולטנים פוסט-סינפטיים שריר גסטרוקנמיוס מדיאלי
הדמיה של המאפיינים המורפולוגיים של צומת נוירומוסקולרי בשריר גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, J., Wu, S., Wang, J., Wang, Y., … More

Cui, J., Wu, S., Wang, J., Wang, Y., Su, Y., Xu, D., Liu, Y., Gao, J., Jing, X., Bai, W. Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63954, doi:10.3791/63954 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter