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Neuroscience

चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी में न्यूरोमस्कुलर जंक्शन के रूपात्मक लक्षणों की कल्पना करना

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63954
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल विभिन्न बायोमार्करों के साथ फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोक्नेमियस मांसपेशियों में प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों, पोस्ट-सिनैप्टिक रिसेप्टर्स और पेरी-सिनैप्टिक श्वान कोशिकाओं के बीच स्थानिक सहसंबंध की जांच करने के लिए एक विधि दिखाता है, अर्थात्, न्यूरोफिलामेंट 200, वेसिकुलर एसिटाइलकोलाइन ट्रांसपोर्टर, अल्फा-बंगारोटोक्सिन, और एस 100।

Abstract

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) मोटर न्यूरॉन से कंकाल की मांसपेशियों तक सिग्नल संचार के लिए एक जटिल संरचना है और इसमें तीन आवश्यक हिस्टोलॉजिकल घटक होते हैं: प्री-सिनैप्टिक मोटर एक्सॉन टर्मिनल, पोस्ट-सिनैप्टिक निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर), और पेरी-सिनैप्टिक श्वान कोशिकाएं (पीएससी)। एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं को प्रदर्शित करने के लिए, चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशियों को लक्ष्य-ऊतक के रूप में चुना गया था और विभिन्न प्रकार के बायोमार्करों के साथ कई फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग करके जांच की गई थी, जिसमें न्यूरोफिलामेंट 200 (एनएफ 200) और मोटर तंत्रिका फाइबर और उनके पूर्व-सिनैप्टिक टर्मिनलों के लिए वेसिकुलर एसिटाइलकोलाइन ट्रांसपोर्टर (वीएसीएचटी) और उनके पूर्व-अन्तर्ग्रथनी टर्मिनल, अल्फा-बंगारोटॉक्सिन (α-बीटीएक्स) शामिल हैं। और पीएससी के लिए एस 100। इस अध्ययन में, धुंधला दो समूहों में किया गया था: पहले समूह में, नमूनों को एनएफ 200, वीएसीएचटी और α-बीटीएक्स के साथ दाग दिया गया था, और दूसरे समूह में, नमूनों को एनएफ 200, α-बीटीएक्स और एस 100 के साथ दाग दिया गया था। यह दिखाया गया था कि दोनों प्रोटोकॉल एनएमजे की विस्तृत संरचना को प्रभावी ढंग से प्रदर्शित कर सकते हैं। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों, पोस्ट-सिनैप्टिक रिसेप्टर्स और पीएससी की रूपात्मक विशेषताओं को देखा गया था, और उनकी जेड-स्टैक छवियों को विभिन्न लेबलिंग के बीच स्थानिक सहसंबंध का विश्लेषण करने के लिए त्रि-आयामी पैटर्न में पुनर्निर्माण किया गया था। पद्धति के परिप्रेक्ष्य से, ये प्रोटोकॉल शारीरिक स्थितियों के तहत एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं की जांच के लिए एक मूल्यवान संदर्भ प्रदान करते हैं, जो एनएमजे के रोग संबंधी परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए भी उपयुक्त हो सकता है, जैसे परिधीय तंत्रिका चोट और उत्थान।

Introduction

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) 1,2,3,4 के तीन आवश्यक संरचनात्मक घटकों के रूप में, प्री-सिनैप्टिक मोटर एक्सॉन टर्मिनलों के रूपात्मक पहलुओं, निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) युक्त पोस्ट-सिनैप्टिक झिल्ली, और पेरी-सिनैप्टिक श्वान कोशिकाओं (पीएससी) की बड़े पैमाने पर जांच की गई है। कंकाल की मांसपेशियों के पतले वर्गों और पूरे माउंट नमूनों की जांच विभिन्न हिस्टोलॉजिकल तकनीकों के साथ की गई है, जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 5,6, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 7,8, और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी 9,10। यद्यपि एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं को विभिन्न पहलुओं से इन तकनीकों द्वारा प्रदर्शित किया गया है, तुलना के रूप में, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी अभी भी एनएमजे की विस्तृत आकृति विज्ञान की इमेजिंग के लिए एक आदर्श विकल्प है।

हाल ही में, एनएमजे के संरचनात्मक घटकों को दिखाने के लिए कई नई प्रौद्योगिकियां विकसित की गई हैं। उदाहरण के लिए, थाइ1-वाईएफपी ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट चूहों का उपयोग सीधे विवो और इन विट्रो10,11 में मोटर अक्षतंतु और मोटर अंत प्लेटों का निरीक्षण करने के लिए किया गया है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट α-बीटीएक्स के अंतःशिरा इंजेक्शन को जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट चूहों के पूरे माउंट कंकाल की मांसपेशियों में मोटर अंत प्लेटों के स्थानिक वितरण को प्रकट करने के लिए लागू किया गया है, प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी 9,12 के साथ परीक्षा के लिए ऊतक ऑप्टिकल समाशोधन उपचार का उपयोग करके। हालांकि, इन उन्नत तरीकों से देखे जा सकने वाले प्री- और पोस्ट-सिनैप्टिक तत्वों के अलावा, पीएससी को एक ही समय में प्रदर्शित नहीं किया जा सकता है।

साक्ष्य जमा करना इंगित करता है कि परिधीय ग्लियाल कोशिकाओं के रूप में पीएससी, एनएमजे के विकास और स्थिरता में योगदान देने वाले प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों के साथ निकटता से जुड़े हुए हैं, शारीरिक स्थिति के तहत एनएमजे की सिनैप्टिक गतिविधि का मॉडुलन, और तंत्रिका चोट 13,14,15 के बाद एनएमजे का उत्थान . एनएमजे के सेलुलर आर्किटेक्चर को ध्यान में रखते हुए, यह प्रोटोकॉल पीएससी, प्री- और पोस्ट-सिनैप्टिक तत्वों को एक साथ लेबल करने के लिए एक उचित उम्मीदवार है, और संभावित रूप से सामान्य और पैथोलॉजिकल स्थितियों के तहत एनएमजे की अखंडता और प्लास्टिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है। उदाहरण के लिए, एनएमजे की तीव्रता, आकृति विज्ञान और पोस्ट-सिनैप्टिक मोटर एंडप्लेट्स की मात्रा, एनएमजे के अंतर्वेशन और विघटन, और शारीरिक और रोग स्थिति की मांसपेशियों में पीएससी की संख्या की तुलना करें।

गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी बछड़े में उभार बनाने वाली सबसे बड़ी मांसपेशी है, जिसे आसानी से अंग से त्वचा और बाइसेप्स फेमोरिस मांसपेशियों को हटाकर विच्छेदित किया जाता है। मांसपेशियों को अक्सर मांसपेशियों के शोष, न्यूरोमस्कुलर अपघटन, मांसपेशियों के प्रदर्शन और मोटर यूनिट बल पूर्व विवो या विवो 16,17,18 का आकलन करने के लिए चुना जाता है। हालांकि, तकनीक विभिन्न कंकाल की मांसपेशियों से एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं को प्रकट करने के लिए भी उपयुक्त है। इसी समय, मोटी मांसपेशी अनुभाग पतली धाराओं 7,8 और छेड़ा मांसपेशी फाइबर19 की तुलना में एनएमजे की अधिक पूर्ण आकृति विज्ञान और मात्रा प्रकट कर सकते हैं।

इन अध्ययनों के अनुरूप, चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी को इस अध्ययन में लक्ष्य-ऊतक के रूप में चुना गया था और एनएमजे के संरचनात्मक घटकों के अनुसार विभिन्न प्रकार के बायोमार्कर के साथ कई फ्लोरोसेंट धुंधला के लिए 80 μm की मोटाई पर कटा हुआ था। यहां, न्यूरोफिलामेंट 200 (एनएफ 200) 20,21, वेसिकुलर एसिटाइलकोलाइन ट्रांसपोर्टर (वीएसीएचटी) 22, अल्फा-बंगरोटॉक्सिन (α-बीटीएक्स) 23,24, और एस 10025,26 का उपयोग क्रमशः तंत्रिका फाइबर, प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों, पोस्ट-सिनैप्टिक एसीएचआर और पीएससी को लेबल करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, मांसपेशियों के ऊतकों और सेलुलर नाभिक की पृष्ठभूमि को फालोइडिन और डीएपीआई के साथ आगे बढ़ाया गया था।

इस अध्ययन में, हम मोटे निश्चित नमूनों पर अपने संबंधित बायोमार्कर के साथ एनएमजे के सेलुलर आर्किटेक्चर को एक साथ धुंधला करने के लिए एक परिष्कृत प्रोटोकॉल विकसित करने की उम्मीद करते हैं, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में उपयोग के लिए अधिक सुविधाजनक है और पीएससी की विस्तृत संरचना पर बहुत अधिक जानकारी प्राप्त करने में मदद करता है, पूर्व और बाद के अन्तर्ग्रथनी तत्व, साथ ही साथ एक दूसरे के लिए उनके स्थानिक सहसंबंध। पद्धति के परिप्रेक्ष्य से, इस प्रोटोकॉल को सामान्य और रोग स्थितियों के तहत एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं का मूल्यांकन करने में लाभ हो सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन को एक्यूपंक्चर और मोक्सीबस्टन संस्थान की आचार समिति, चीनी चिकित्सा विज्ञान अकादमी (अनुमोदन संख्या 2021-04-15-1) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड (नेशनल एकेडमी प्रेस, वाशिंगटन, डीसी, 1996) के अनुसार आयोजित किया गया था। तीन वयस्क नर चूहों (स्प्रैग-डॉली, वजन 230 ± 15 ग्राम) का उपयोग किया गया था। चूहों को नियंत्रित तापमान और आर्द्रता के साथ और भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ 12 घंटे के प्रकाश / अंधेरे चक्र में रखा गया था। इस अध्ययन के लिए उपकरणों और सामग्रियों को चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. छिड़काव

  1. चूहों की इच्छामृत्यु को प्रेरित करने के लिए इंट्रापेरिटोनियल रूप से 250 मिलीग्राम / किग्रा ट्राइब्रोमोइथेनॉल समाधान इंजेक्ट करें।
  2. एक बार श्वास बंद हो जाने के बाद, कैंची और संदंश का उपयोग करके हृदय तक पहुंचने के लिए वक्ष गुहा खोलें। महाधमनी की ओर बाएं कार्डियक वेंट्रिकल से एक अंतःशिरा कैथेटर डालें, और फिर दाएं ऑरिकल को काट लें।
  3. हुड में प्रयोगात्मक चूहों को छिड़कें। 0.9% सामान्य खारा के 100 मिलीलीटर के साथ छिड़काव करके शुरू करें जब तक कि दाहिने ऑरिकल से बाहर निकलने वाला रक्त स्पष्ट न हो जाए, फिर पूंछ को मोड़ना मुश्किल होने तक लगभग 10 मिनट तक 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी, पीएच 7.4) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 250-300 एमएल के साथ छिड़कना जारी रखें।

2. क्षेत्रीय शरीर रचना विज्ञान

  1. छिड़काव के बाद, एक सर्जिकल ब्लेड (चित्रा 2 ए) का उपयोग करके द्विपक्षीय हिंद अंग की त्वचा को हटा दें और द्विपक्षीय कटिस्नायुशूल तंत्रिका और औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी (चित्रा 2 बी) का पर्दाफाश करें।
  2. एक ब्लेड (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके हिंद अंग से द्विपक्षीय औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें और 2 घंटे के लिए 0.1 एम पीबी में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 10 एमएल में पूरी मांसपेशियों को ठीक करें।
  3. समाधान से मांसपेशियों को निकालें और मांसपेशियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए 0.1 एम पीबी में 25% सुक्रोज के 10 मिलीलीटर में क्रायोप्रोटेक्ट करें जब तक कि मांसपेशी पूरी तरह से समाधान में डूब न जाए।

3. मांसपेशियों का क्रायोसेक्शनिंग

  1. एक बार मांसपेशियों के ऊतकों को समाधान में डुबो दिया जाता है, तो जमे हुए अनुभाग माध्यम का उपयोग करके स्लाइडिंग माइक्रोटोम सिस्टम के ठंड चरण पर इसे ठीक करें। 80 μm की मोटाई पर मांसपेशियों की लंबी धुरी के साथ क्षैतिज रूप से मांसपेशी स्लाइस करें।
  2. ब्रश का उपयोग करके 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) के 10 एमएल के साथ छह-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में एक व्यवस्थित फैशन में सात क्रायो-सेक्शन रखें।
    नोट: अनुभागों को क्रम में रखा जाता है ताकि विभिन्न कुओं में अनुभाग आसन्न हों, जो विभिन्न दागों के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्गों को अधिक सुसंगत बनाता है।

4. एनएफ 200, वीएसीएचटी, α-बीटीएक्स और फा के साथ कई फ्लोरोसेंट धुंधला

नोट: एनएफ 200, वीएसीएचटी, α-बीटीएक्स और फा के साथ कई फ्लोरोसेंट धुंधला क्रमशः तंत्रिका फाइबर, प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों, पोस्ट-सिनैप्टिक निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स और मांसपेशियों के तंतुओं को प्रकट करने के लिए लागू किया गया था।

  1. 30 मिनट के लिए 20 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 10% ट्राइटन एक्स -100 (0.5%) और सामान्य गधा सीरम (3%) के 45 μL युक्त 0.1 एम पीबी के 1.5 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से चार वर्गों सेते हैं।
  2. खरगोश एंटी-एनएफ 200 (1: 1,000), बकरी एंटी-वीएसीटी (1: 500) युक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के मिश्रित समाधान के 1.5 मिलीलीटर में वर्गों को 1% सामान्य गधा सीरम, और 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के साथ 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) में स्थानांतरित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं। अगले दिन, 20 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) में प्रत्येक 5 मिनट के लिए वर्गों 3x धो लें।
  3. गधा विरोधी खरगोश एएफ 488 (1: 500) और गधा विरोधी बकरी एएफ 546 (1: 500) युक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रित समाधान के 1.5 मिलीलीटर में वर्गों सेते हैं, साथ ही α-बीटीएक्स, एएफ 647 (1: 500), और फालोइडिन 350 (1: 500) के बायोमार्कर 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) में 1% सामान्य सीरम गधे और 0.5% प्रकाश से रक्षा करें।
  4. 0.1 एम पीबी (पीएच 7.4) में प्रत्येक 5 मिनट के लिए 3x धोने के बाद, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट। अवलोकन के लिए आसुत जल में 50% ग्लिसरीन का उपयोग करके अनुभागों पर कवर ग्लास लागू करें।

5. एनएफ 200, एस 100, α-बीटीएक्स और डीएपीआई के साथ कई फ्लोरोसेंट धुंधला

नोट: प्रक्रियाएं चरण 4 के समान हैं; मुख्य अंतर प्राथमिक एंटीबॉडी और उनके संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी के बीच है।

  1. निम्नलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: चिकन एंटी-एनएफ 200 (1: 6,000), चरण 4.2 में खरगोश एंटी-एस 100 (1: 2,500) और उनके संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी: गधा एंटी-चिकन एएफ 488 (1: 500) और गधा विरोधी खरगोश एएफ 546 (1: 500), साथ ही α-बीटीएक्स एएफ 647 (1: 500) के बायोमार्कर

6. अवलोकन और विश्लेषण

  1. नमूने का निरीक्षण करें और निम्नलिखित उद्देश्य लेंस से लैस एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके छवियां लें: 0.75 के एनए के साथ 20 एक्स लेंस और 0.95 के एनए के साथ 40 एक्स लेंस।
  2. 350 एनएम (फा), 488 एनएम (एनएफ 200), 546 एनएम (वीएसीएचटी और एस 100), 647 एनएम (α-बीटीएक्स), या डीएपीआई के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें जो कई फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना है। छवि कैप्चर के रिज़ॉल्यूशन को 640 x 640 पिक्सेल पर सेट करें।
    नोट: 640 x 640 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन चुना जाता है क्योंकि छवियों को जेड-स्टैक में कैप्चर किया गया था। 1024 x 1024 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन के परिणामस्वरूप जेड-स्टैक में धीमी इमेजिंग और फोटोब्लीचिंग होती है।
  3. फोकल प्लेन शुरू करें और फोकल प्लेन को समाप्त करें। चरण आकार या तो 1 μm या 2 μm पर सेट करें। गहराई पैटर्न, छवि कैप्चर और जेड श्रृंखला चुनें।
  4. 20x पर ली गई निचली आवर्धन छवियों के लिए, 105 μm पिनहोल का उपयोग करके प्रत्येक 80 μm मोटी अनुभाग से 2 μm चरण आकार में 40 छवियों (Z-स्टैक) को कैप्चर करें। एक एकल इन-फोकस में सभी छवियों को एकीकृत करने के लिए जेड अक्ष पर प्रक्षेपण /स्थलाकृति मोड और तीव्रता प्रक्षेपण चुनें।
  5. 40x पर ली गई उच्च आवर्धन छवियों के लिए, ज़ूम सेट के साथ प्रत्येक 80 μm मोटी अनुभाग से 1 μm चरण आकार में 80 छवियों (Z-स्टैक) को कैप्चर करें और 105 μm पिनहोल। सभी छवियों को एक ही इन-फोकस में एकीकृत करें।
  6. छवि प्रसंस्करण प्रणाली के साथ त्रि-आयामी पैटर्न में छवियों का पुनर्निर्माण करें जैसा कि पहले27 में वर्णित है।

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Representative Results

कई फ्लोरोसेंट धुंधला होने के बाद, इसी लेबलिंग को एनएफ 200-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर, वीएसीएचटी-पॉजिटिव प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों, α-बीटीएक्स-पॉजिटिव पोस्ट-सिनैप्टिक एसीएचआर, एस 100-पॉजिटिव पीएससी, फालोइडिन-पॉजिटिव मांसपेशियों फाइबर, और डीएपीआई-लेबल वाले सेलुलर नाभिक के साथ चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशियों के 80 μm मोटी वर्गों पर व्यवस्थित रूप से प्रदर्शित किया गया था।

यह दिखाया गया था कि एनएफ 200-पॉजिटिव तंत्रिका फाइबर बंडल में भाग गए और वीएसीएचटी-पॉजिटिव प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों को शाखाएं दीं जो α-बीटीएक्स-पॉजिटिव पोस्ट-सिनैप्टिक एसीएचआर (चित्रा 3) के साथ एक दर्पण संबंध बनाती हैं। इसके अलावा, एस 100-पॉजिटिव पीएससी को पूर्व-अन्तर्ग्रथनी टर्मिनलों (चित्रा 4) के करीब एनएफ 200-पॉजिटिव तंत्रिका तंतुओं के आसपास पाया गया था।

छवि-पुनर्निर्माण का लाभ उठाकर, तंत्रिका तंतुओं, पूर्व-अन्तर्ग्रथनी टर्मिनलों, पीएससी और पोस्ट-सिनैप्टिक एसीएचआर के स्थानिक सहसंबंध को आगे एक त्रि-आयामी पैटर्न में प्रदर्शित किया गया था जो विभिन्न दृष्टिकोणों (चित्रा 3 सी, सी 1 और चित्रा 4 सी, सी 1) से एनएमजे की विस्तृत रूपात्मक विशेषताओं को दर्शाता है।

Figure 1
चित्र 1. विभिन्न प्रोटोकॉल चरणों की छवियाँ। (ए) चूहे को हुड में घुमाएं। (बी) चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशियों को विच्छेदित करें। (सी) स्लाइडिंग माइक्रोटोम सिस्टम के ठंड चरण पर मांसपेशियों के ऊतकों को काटें। (डी) एक छह अच्छी तरह से पकवान में व्यवस्थित ऊतक वर्गों ले लीजिए। (ई) शेकर पर फ्लोरोसेंट धुंधला। (एफ) माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट। (जी) 50% ग्लिसरीन वाले वर्गों में कवरलिप्स लागू करें। (एच) एक कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम के साथ नमूनों का निरीक्षण करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशियों को विच्छेदन के लिए क्षेत्रीय शरीर रचना विज्ञान की प्रक्रिया। (ए) चूहे के हिंद अंग में मांसपेशियों का बाहरी दृश्य। (बी) औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी और इसके अंतर्वेशन के अंदरूनी दृश्य। (सी) चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशियों को विच्छेदन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3. "चूहे के औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशियों पर तंत्रिका फाइबर, प्री-सिनैप्टिक टर्मिनल, पोस्ट-सिनैप्टिक निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स और मांसपेशियों के फाइबर का स्थानिक सहसंबंध"। (ए) चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी से प्रतिनिधि छवि न्यूरोफिलामेंट 200 (एनएफ 200), वेसिकुलर एसिटाइलकोलाइन ट्रांसपोर्टर (वीएसीएचटी), अल्फा-बंगरोटॉक्सिन (α-बीटीएक्स), और फालोइडिन (फा) के साथ कई फ्लोरोसेंट धुंधला दिखा रही है। (बी) पैनल ए (एरोहेड) से आवर्धित छवि विभिन्न लेबलिंग को विस्तार से दिखाती है। बी 1-बी 4: पैनल बी एनएफ 200 (बी 1), वीएसीएचटी (बी 2), α-बीटीएक्स (बी 3), और फा (बी 4) के साथ अलग से दिखाया गया है। (सी) पैनल बी से समायोजित छवियां फ्रेम के साथ (सी) में 3 डी पैटर्न के सामने के दृश्य और (सी 1) में पीछे का दृश्य दिखाती हैं। बी 1-बी 4 के लिए बी के समान स्केल बार कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4. "चूहे के औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशियों पर तंत्रिका तंतुओं, पेरी-सिनैप्टिक श्वान कोशिकाओं, पोस्ट-सिनैप्टिक निकोटिनिक एसिटाइलकोलाइन रिसेप्टर्स और सेलुलर नाभिक का स्थानिक सहसंबंध"। (ए) चूहे औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी से प्रतिनिधि छवि न्यूरोफिलामेंट 200 (एनएफ 200), श्वान सेल मार्कर (एस 100), अल्फा-बंगरोटॉक्सिन (α-बीटीएक्स), और सेलुलर न्यूक्लियस मार्कर 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल डाइहाइड्रोक्लोराइड (डीएपीआई) के साथ कई फ्लोरोसेंट धुंधला दिखा रही है। (बी) पैनल ए (एरोहेड) से आवर्धित छवि विभिन्न लेबलिंग को विस्तार से दिखाती है। बी 1-बी 4: एनएफ 200 (बी 1), एस 100 (बी 2), α-बीटीएक्स (बी 3), और डीएपीआई (बी 4) के साथ पैनल बी को अलग से दिखाएं। (सी) (सी) में 3 डी पैटर्न में फ्रेम के साथ पैनल बी से समायोजित छवियां और (सी 1) में एस 100 लेबलिंग के बिना दृश्य। बी 1-बी 4 के लिए बी के समान स्केल बार कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हमने चूहे के औसत दर्जे का गैस्ट्रोक्नेमियस मांसपेशी के मोटे वर्गों पर एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं को प्रकट करने के लिए मांसपेशियों के स्लाइस के सफल कई धुंधला प्रदर्शन करने और फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के उपयोग के लिए आवश्यक तकनीकी विवरणों का वर्णन किया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, पीएससी और पूर्व और बाद के अन्तर्ग्रथनी तत्वों के ठीक विवरण और स्थानिक सहसंबंध का विश्लेषण और सराहना कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के तहत की जा सकती है, और आगे त्रि-आयामी पैटर्न में पुनर्निर्माण किया जा सकता है। यहां, एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं को प्रकट करने के लिए विभिन्न प्रकार के बायोमार्करों का उपयोग किया गया था, जिसमें, एनएफ 200 माइलिनेटेड अक्षतंतु20,21 पर अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, प्री-सिनैप्टिकटर्मिनल22 पर संचित वीएसीएचटी, α-बीटीएक्स पोस्ट-सिनैप्टिक एसीएचआर23,24 पर प्रदर्शित किया जाता है, और एस 100 पीएससी25,26 पर दिखाया गया है . हमारे परिणामों और पिछले अध्ययनों से उन लोगों को एक साथ लेना इंगित करता है कि इन बायोमार्करों को एक दूसरे के साथ अपने स्थानिक संबंधों का आकलन करने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार एनएमजे के संरचनात्मक तत्वों को लेबल करने के लिए स्वतंत्र रूप से जोड़ा जा सकता है 1,28,29।

इस तकनीक के साथ आदर्श इमेजिंग प्राप्त करने के लिए, पोस्ट-फिक्स समय एक महत्वपूर्ण मुद्दा है जिस पर ध्यान दिया जाना चाहिए क्योंकि ओवर-फिक्सेशन उच्च पृष्ठभूमि का कारण बन सकता है। इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है कि फिक्स समाधान में पोस्ट-फिक्स समय 2 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए। इसके अलावा, मांसपेशियों के वर्गों में अधिक एनएमजे का निरीक्षण करने के लिए, 80 μm की मोटाई पर लंबी धुरी के साथ क्षैतिज रूप से मांसपेशियों को टुकड़ा करना महत्वपूर्ण है, जो एनएमजे में प्री-सिनैप्टिक टर्मिनलों, पोस्ट-सिनैप्टिक एसीएचआर और पीएससी के स्थानिक सहसंबंध को व्यापक रूप से प्रदर्शित कर सकता है। यहां, इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि एक स्लाइडिंग माइक्रोटोम मांसपेशियों के ऊतकों को टुकड़ा करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण है। इसी तरह, मोटे वर्गों को प्राप्त करने के लिए क्रायोस्टैट और वाइब्रेटोम का भी उपयोग किया जा सकता है।

संक्षेप में, एनएमजे की रूपात्मक विशेषताओं का व्यापक रूप से विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके द्वि-आयामी हिस्टोलॉजिकल वर्गों से त्रि-आयामी पूरे-माउंट ऊतक तक अध्ययन किया गया है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी के साथ परीक्षा के लिए श्रमसाध्य और समय लेने वाले ऊतक उपचार को ध्यान में रखते हुए, मोटे ऊतक अनुभाग पर कई फ्लोरोसेंट धुंधला अभी भी कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एनएमजे के स्टीरियोलॉजिकल आर्किटेक्चर का प्रभावी ढंग से पता लगाने के लिए एक सुविधाजनक दृष्टिकोण है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को सीएसीएमएस इनोवेशन फंड द्वारा वित्त पोषित किया गया था (सं। सीआई 2021 ए 03407), चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 82004299), और केंद्रीय लोक कल्याण अनुसंधान संस्थानों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (सं। जेडजेड 13-वाईक्यू -068; जेडजेड 14-वाईक्यू -032; जेडजेड 14-वाईक्यू -034; जेडजेड 201914001; जेडजेड 202017006; जेडजेड 202017015)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride ThermoFisher D3571
Confocal laser scanning microscope Olympus FV1200
Donkey anti-chicken AF488 Jackson 149973 (703-545-155)
Donkey anti-goat AF546 ThermoFisher A11056
Donkey anti-rabbit AF488 ThermoFisher A21206
Donkey anti-rabbit AF546 ThermoFisher A10040
Frozen Section Medium ThermoFisher Neg-50 Colorless
Microscope cover glass Citotest 10212450C
Microtome Yamato REM-710
Neurofilament 200 Sigma-Aldrich N4142 Rabbit
Neurofilament 200 Abcam ab4680 Chicken
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch Laboratories 017-000-12 10 ml
Normal saline Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd H37022750 250 ml
Paraformaldehyde Macklin P804536 500g
Phalloidin AF350 ThermoFisher A22281
Precision peristaltic pump Longer BT100-2J
S100-β Abcam ab52642 Rabbit
Sodium phosphate dbasic dodecahydrate Macklin S818118 500g
Sodium phosphate monobasic dihydrate Macklin S817463 500g
Sucrose Macklin S818046 500g
Superfrost plus microscope slides ThermoFisher 4951PLUS-001E
Triton X-100 Solarbio Life Sciences 9002-93-1 100 ml
Vesicular Acetylcholine Transporter Milipore ANB100 Goat
α-bungarotoxin AF647 conjugate ThermoFisher B35450

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183 न्यूरोमस्कुलर जंक्शन मोटर न्यूरॉन कंकाल की मांसपेशी पेरी-सिनैप्टिक श्वान सेल प्री-सिनैप्टिक टर्मिनल पोस्ट-सिनैप्टिक रिसेप्टर्स औसत दर्जे का गैस्ट्रोनेमियस मांसपेशी
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