Summary
El protocolo muestra un método para examinar la correlación espacial entre los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y las células de Schwann perisinápticas en el músculo gastrocnemio medial de la rata utilizando inmunohistoquímica fluorescente con diferentes biomarcadores, a saber, neurofilamento 200, transportador vesicular de acetilcolina, alfa-bungarotoxina y S100.
Abstract
La unión neuromuscular (NMJ) es una estructura compleja que sirve para la comunicación de señales desde la neurona motora hasta el músculo esquelético y consta de tres componentes histológicos esenciales: los terminales axónicos motores presinápticos, los receptores nicotínicos de acetilcolina postsinápticos (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Con el fin de demostrar las características morfológicas de la NMJ, el músculo gastrocnemio medial de rata se seleccionó como tejido objetivo y se examinó mediante el uso de múltiples tinciones fluorescentes con varios tipos de biomarcadores, incluido el neurofilamento 200 (NF200) y el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) para las fibras nerviosas motoras y sus terminales presinápticas, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para las AchR nicotínicas postsinápticas, y S100 para los PSC. En este estudio, la tinción se realizó en dos grupos: en el primer grupo, las muestras se tiñeron con NF200, VAChT y α-BTX, y en el segundo grupo, las muestras se tiñeron con NF200, α-BTX y S100. Se demostró que ambos protocolos pueden demostrar efectivamente la estructura detallada de NMJ. Utilizando el microscopio confocal, se observaron las características morfológicas de los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y el PSC, y se reconstruyeron sus imágenes de pilas Z en un patrón tridimensional para analizar más a fondo la correlación espacial entre los diferentes etiquetados. Desde la perspectiva de la metodología, estos protocolos proporcionan una referencia valiosa para investigar las características morfológicas de la NMJ en condiciones fisiológicas, que también pueden ser adecuadas para evaluar la alteración patológica de la NMJ, como la lesión y regeneración de los nervios periféricos.
Introduction
Como tres componentes estructurales esenciales de la unión neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, se han investigado ampliamente los aspectos morfológicos de los terminales axónicos motores presinápticos, la membrana postsináptica que contiene receptores nicotínicos de acetilcolina (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Se han examinado secciones delgadas y especímenes de montaje entero de los músculos esqueléticos con diferentes técnicas histológicas, como la microscopía electrónica 5,6, la microscopía confocal 7,8 y la microscopía de lámina de luz 9,10. Aunque las características morfológicas de NMJ han sido demostradas por estas técnicas desde diferentes aspectos, como comparación, la microscopía confocal sigue siendo una opción ideal para la obtención de imágenes de la morfología detallada de NMJ.
Recientemente, se han desarrollado muchas tecnologías nuevas para mostrar los componentes estructurales de NMJ. Por ejemplo, los ratones fluorescentes transgénicos thy1-YFP se han utilizado directamente para observar axones motores y placas finales motoras in vivo e in vitro10,11. Además, se ha aplicado la inyección intravenosa de fluorescente α-BTX para revelar la distribución espacial de las placas terminales motoras en músculos esqueléticos de montaje completo de ratones fluorescentes de tipo salvaje y transgénicos, mediante el uso de tratamiento de limpieza óptica de tejidos para su examen con microscopía de lámina de luz 9,12. Sin embargo, además de los elementos pre y postsinápticos que pueden ser vistos por estos métodos avanzados, las PSC no se pueden demostrar al mismo tiempo.
La evidencia acumulada indica que las PSC, como las células gliales periféricas, están estrechamente asociadas con los terminales presinápticos que contribuyen al desarrollo y la estabilidad de la NMJ, la modulación de la actividad sináptica de la NMJ bajo la condición fisiológica y la regeneración de la NMJ después de una lesión nerviosa 13,14,15 . Teniendo en cuenta la arquitectura celular de NMJ, este protocolo es un candidato adecuado para etiquetar simultáneamente las PSC, elementos pre y postsinápticos, y se utiliza potencialmente para evaluar la integridad y plasticidad de la NMJ en condiciones normales y patológicas. Por ejemplo, compare la intensidad de NMJ, la morfología y el volumen de las placas terminales motoras postsinápticas, la inervación y la denervación de NMJ, y el número de PSC en músculos de estado fisiológico y patológico.
El músculo gastrocnemio es el músculo más grande que forma la protuberancia en la pantorrilla, que se disecciona fácilmente mediante la eliminación de la piel y el músculo bíceps femoral de la extremidad. El músculo a menudo se elige para evaluar la atrofia muscular, la degeneración neuromuscular, el rendimiento muscular y la fuerza de la unidad motora ex vivo o in vivo 16,17,18. Sin embargo, la técnica también es adecuada para revelar las características morfológicas de NMJ de varios músculos esqueléticos. Al mismo tiempo, las secciones musculares gruesas pueden revelar una morfología y cantidad más completas de NMJ en comparación con las secciones delgadas 7,8 y las fibras muscularesburladas 19.
En línea con estos estudios, el músculo gastrocnemio medial de rata fue seleccionado como tejido diana en este estudio y se cortó en rodajas a un grosor de 80 μm para múltiples tinciones fluorescentes con varios tipos de biomarcadores de acuerdo con los componentes estructurales de NMJ. Aquí, el neurofilamento 200 (NF200)20,21, el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT)22, la alfa-bungarotoxina (α-BTX)23,24 y el S10025,26 se utilizaron para etiquetar fibras nerviosas, terminales presinápticas, afrrómetros postsinápticos y PSC respectivamente. Además, el fondo del tejido muscular y los núcleos celulares se contrateñeron aún más con faloidina y DAPI.
En este estudio, esperamos desarrollar un protocolo refinado para teñir simultáneamente la arquitectura celular de NMJ con sus correspondientes biomarcadores en muestras fijas más gruesas, que es más conveniente para su uso en microscopía confocal y ayuda a obtener mucha más información sobre la estructura detallada de las PSC, elementos pre y postsinápticos, así como su correlación espacial entre sí. Desde la perspectiva de la metodología, este protocolo puede beneficiarse para evaluar las características morfológicas de NMJ en condiciones normales y patológicas.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión, Academia China de Ciencias Médicas Chinas (aprobación No. 2021-04-15-1). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Se utilizaron tres ratas macho adultas (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Las ratas fueron alojadas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con temperatura y humedad controladas y con libre acceso a alimentos y agua. Los instrumentos y materiales para este estudio se muestran en la Figura 1.
1. Perfusión
- Inyectar 250 mg/kg de solución de tribromoetanol por vía intraperitoneal para inducir la eutanasia de las ratas.
- Una vez que se detenga la respiración, abra la cavidad torácica para acceder al corazón con tijeras y fórceps. Inserte un catéter intravenoso desde el ventrículo cardíaco izquierdo hacia la aorta y luego corte la aurícula derecha.
- Perfunde las ratas experimentales en la capucha. Comience perfundiendo con 100 ml de solución salina normal al 0.9% hasta que la sangre que sale de la aurícula derecha esté clara, luego continúe perfundiendo con 250-300 ml de paraformaldehído al 4% en un tampón de fosfato de 0.1 M (PB, pH 7.4) durante aproximadamente 10 minutos hasta que la cola sea difícil de doblar.
2. Anatomía regional
- Después de la perfusión, retire la piel de la extremidad posterior bilateral con una cuchilla quirúrgica (Figura 2A) y exponga el nervio ciático bilateral y el músculo gastrocnemio medial (Figura 2B).
- Diseccionar el músculo gastrocnemio medial bilateral cuidadosamente de la extremidad posterior usando una cuchilla (Figura 2C) y post-fijar todo el músculo en 10 mL de paraformaldehído al 4% en 0.1 M PB durante 2 h.
- Retire el músculo de la solución y crioproteja el músculo en 10 ml de sacarosa al 25% en 0,1 M PB durante 1 día a 4 °C hasta que el músculo esté completamente sumergido en la solución.
3. Criomeccionación del músculo
- Una vez que el tejido muscular esté sumergido en la solución, fíjelo en una etapa de congelación de un sistema de microtomo deslizante utilizando un medio de sección congelado. Corte el músculo horizontalmente a lo largo del eje largo del músculo con un grosor de 80 μm.
- Coloque siete criodisecciones por pozo de manera ordenada en una placa de cultivo de seis pocillos con 10 ml de 0.1 M PB (pH 7.4) usando un cepillo.
NOTA: Las secciones se colocan en orden para que las secciones en diferentes pozos sean adyacentes, lo que hace que las secciones utilizadas para diferentes manchas sean más consistentes.
4. Tinción fluorescente múltiple con NF200, VAChT, α-BTX y Pha
NOTA: Se aplicó tinción fluorescente múltiple con NF200, VAChT, α-BTX y Pha para revelar las fibras nerviosas, terminales presinápticos, receptores nicotínicos de acetilcolina postsinápticos y fibras musculares, respectivamente.
- Incubar cuatro secciones por pozo con 1,5 mL de 0,1 M PB que contengan 75 μL de Tritón X-100 al 10% (0,5%) y 45 μL de suero normal de burro (3%) en un agitador orbital a 20 rpm durante 30 min.
- Transfiera las secciones a 1,5 ml de solución mixta de anticuerpos primarios que contengan anti-NF200 de conejo (1:1.000), anti-VAChT de cabra (1:500) en 0,1 M pb (pH 7,4) con suero de burro normal al 1%, y 0,5% de Tritón X-100, e incube durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, lave las secciones 3x durante 5 min cada una en 0.1 M PB (pH 7.4) en un agitador orbital a 20 rpm.
- Incubar las secciones en 1,5 ml de solución mixta de anticuerpos secundarios que contengan anti-conejo AF488 (1:500) y burro anti-cabra AF546 (1:500), así como los biomarcadores de α-BTX, AF647 (1:500) y faloidina 350 (1:500) en 0,1 M PB (pH 7,4) que contengan 1% de suero normal de burro y 0,5% de Tritón X-100 durante 1 h a temperatura ambiente. Proteger de la luz.
- Después de lavar 3x durante 5 min cada uno en 0.1 M PB (pH 7.4), monte las secciones en portaobjetos de microscopio. Aplique vidrio de cubierta a las secciones usando 50% de glicerina en agua destilada para observación.
5. Tinción fluorescente múltiple con NF200, S100, α-BTX y DAPI
NOTA: Los procedimientos son similares a los del paso 4; la principal diferencia es entre los anticuerpos primarios y sus correspondientes anticuerpos secundarios.
- Utilice los siguientes anticuerpos primarios: pollo anti-NF200 (1:6.000), conejo anti-S100 (1:2.500) en el paso 4.2 y sus correspondientes anticuerpos secundarios: burro anti-pollo AF488 (1:500) y burro anti-conejo AF546 (1:500), así como los biomarcadores de α-BTX AF647 (1:500) y DAPI (1:50000) en el paso 4.3.
6. Observación y análisis
- Observe la muestra y tome imágenes utilizando un sistema de imagen confocal equipado con las siguientes lentes objetivo: lente 20x con NA de 0.75 y lente 40x con NA de 0.95.
- Utilice longitudes de onda de excitación y emisión de 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT y S100), 647 nm (α-BTX) o DAPI correspondientes a la tinción fluorescente múltiple. Establezca la resolución de captura de imagen en 640 x 640 píxeles.
NOTA: La resolución de 640 x 640 píxeles se elige porque las imágenes se capturaron en pilas Z. Una resolución de 1024 x 1024 píxeles da como resultado imágenes lentas y fotoblanqueo en pilas Z. - Establezca el plano focal de inicio y el plano focal final. Establezca el tamaño del paso en 1 μm o 2 μm. Elija el patrón de profundidad, la captura de imágenes y la serie Z.
- Para las imágenes de menor aumento tomadas a 20x, capture 40 imágenes (pilas Z) en un tamaño de paso de 2 μm de cada sección de 80 μm de espesor utilizando un agujero de alfiler de 105 μm. Elija el modo de proyección/topografía y la proyección de intensidad sobre el eje Z para integrar todas las imágenes en un solo enfoque.
- Para las imágenes de mayor aumento tomadas a 40x, capture 80 imágenes (pilas Z) en un tamaño de paso de 1 μm de cada sección de 80 μm de grosor con zoom establecido en 2 y un agujero de alfiler de 105 μm. Integre todas las imágenes en un solo enfoque.
- Reconstruir las imágenes en el patrón tridimensional con el sistema de procesamiento de imágenes como se describió anteriormente en27.
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Representative Results
Después de múltiples tinciones fluorescentes, el etiquetado correspondiente se demostró ordenadamente en las secciones de 80 μm de espesor del músculo gastrocnemio medial de rata con fibras nerviosas NF200 positivas, terminales presinápticos VAChT positivos, AchRs postsinápticas positivas α-BTX, PSC S100 positivas, fibras musculares positivas para faloidinas y núcleos celulares marcados con DAPI (Figura 3 y Figura 4).
Se demostró que las fibras nerviosas NF200 positivas corrían en haz y daban ramas a los terminales presinápticos VAChT-positivos que formaban una relación espejo con los AchR post-sinápticos α-BTX-positivos (Figura 3). Además, se detectaron PSC S100 positivos alrededor de las fibras nerviosas NF200 positivas cerca de los terminales presinápticos (Figura 4).
Al aprovechar la reconstrucción de la imagen, la correlación espacial de las fibras nerviosas, terminales presinápticos, PSC y AchR postsinápticas se exhibió en un patrón tridimensional que muestra las características morfológicas detalladas de NMJ desde diferentes perspectivas (Figura 3C, C1 y Figura 4C, C1).
Figura 1. Imágenes de los distintos pasos del protocolo. (A) Perfundir la rata en la capucha. (B) Diseccionar el músculo gastrocnemio medial de la rata. (C) Cortar el tejido muscular en una etapa de congelación del sistema de microtomo deslizante. (D) Recolectar secciones de tejido ordenadamente en un plato de seis pocillos. (E) Tinción fluorescente en el agitador. (F) Monte las secciones en portaobjetos de microscopio. (G) Aplicar fundas a las secciones con 50% de glicerina. (H) Observar las muestras con un sistema de imágenes confocales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Procedimiento de anatomía regional para diseccionar el músculo gastrocnemio medial de rata. (A) Vista exterior de los músculos de la extremidad posterior de la rata. (B) Vista interior del músculo gastrocnemio medial y su inervación. (C) Disección del músculo gastrocnemio medial de la rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Correlación espacial de las fibras nerviosas, terminales presinápticos, receptores nicotínicos de acetilcolina postsinápticos y fibras musculares en el músculo gastrocnemio medial de la rata. (A) Imagen representativa del músculo gastrocnemio medial de rata que muestra la tinción fluorescente múltiple con neurofilamento 200 (NF200), transportador vesicular de acetilcolina (VAChT), alfa-bungarotoxina (α-BTX) y faloidina (Pha). (B) La imagen ampliada del panel A (punta de flecha) que muestra los diversos etiquetados en detalle. B1-B4: el panel B se muestra por separado con NF200 (B1), VAChT (B2), α-BTX (B3) y Pha (B4). (C) Las imágenes ajustadas del panel B con el marco que muestra la vista frontal del patrón 3D en (C) y la vista posterior en (C1). Misma barra de escala para B1-B4 que en B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Correlación espacial de las fibras nerviosas, las células de Schwann perisinápticas, los receptores nicotínicos de acetilcolina postsinápticos y los núcleos celulares en el músculo gastrocnemio medial de la rata. (A) Imagen representativa del músculo gastrocnemio medial de rata que muestra la tinción fluorescente múltiple con neurofilamento 200 (NF200), marcador celular de Schwann (S100), alfa-bungarotoxina (α-BTX) y marcador de núcleo celular 4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato (DAPI). (B) La imagen ampliada del panel A (punta de flecha) que muestra los diversos etiquetados en detalle. B1-B4: muestre el panel B por separado con NF200 (B1), S100 (B2), α-BTX (B3) y DAPI (B4). (C) Las imágenes ajustadas del panel B con el marco en un patrón 3D en (C) y la vista sin etiquetado S100 en (C1). Misma barra de escala para B1-B4 que en B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para realizar con éxito la tinción múltiple de cortes musculares y el uso de inmunohistoquímica fluorescente para revelar las características morfológicas de NMJ en las secciones gruesas del músculo gastrocnemio medial de rata. Mediante el uso de este enfoque, los detalles finos y la correlación espacial de las PSC y los elementos pre y postsinápticos pueden analizarse y apreciarse bajo microscopía confocal, y reconstruirse aún más en un patrón tridimensional. Aquí, se utilizaron varios tipos de biomarcadores para revelar las características morfológicas de NMJ, en las cuales, NF200 se expresa altamente en los axones mielinizados20,21, VAChT acumulado en los terminales presinápticos22, α-BTX se exhibe en los AchR post-sinápticos23,24, y S100 se muestra en los PSCs25,26 . Tomando en conjunto nuestros resultados y los de estudios previos indica que estos biomarcadores pueden combinarse libremente para etiquetar los elementos estructurales de NMJ según el diseño experimental para evaluar su relación espacial entre sí 1,28,29.
Para obtener imágenes ideales con esta técnica, el tiempo posterior a la fijación es un problema importante al que se debe prestar atención porque la fijación excesiva puede causar un alto fondo. Por lo tanto, se recomienda que el tiempo posterior a la fijación no sea superior a 2 h en la solución de reparación. Además, para observar más NMJ en las secciones musculares, es fundamental cortar el músculo horizontalmente a lo largo del eje largo a un grosor de 80 μm, lo que puede demostrar de manera integral la correlación espacial de los terminales presinápticos, las AFcr postsinápticas y las PSC en el NMJ. Aquí, debe enfatizarse que un microtomo deslizante es una herramienta conveniente para cortar el tejido muscular. Del mismo modo, un criostato y un vibratomo también se pueden usar para obtener secciones gruesas.
En resumen, las características morfológicas de NMJ han sido ampliamente estudiadas desde secciones histológicas bidimensionales hasta tejido tridimensional de montaje completo mediante el uso de diferentes técnicas. Teniendo en cuenta los laboriosos y lentos tratamientos tisulares para el examen con microscopía electrónica y microscopía de lámina de luz, la tinción fluorescente múltiple en la sección de tejido más grueso sigue siendo un enfoque conveniente para explorar eficazmente la arquitectura estereológica de NMJ mediante el uso de microscopía confocal.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado por el Fondo de Innovación del CACMS (No. CI2021A03407), La Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82004299) y los Fondos de Investigación Fundamental para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
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