Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.

Zusammenfassung

Verschiedene Biomaterial-Scaffolds wurden entwickelt, um die Zelladhäsion und -proliferation zu steuern, in der Hoffnung, spezifische Funktionen für In-vitro - und In-vivo-Anwendungen zu fördern. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren in diese Biomaterialgerüste erfolgt im Allgemeinen, um eine optimale Zellkulturumgebung zu schaffen, die die Zelldifferenzierung und ihre nachfolgenden Funktionen vermittelt. Die Wachstumsfaktoren in einem herkömmlichen Biomaterialgerüst sind jedoch typischerweise so konzipiert, dass sie bei der Implantation freigesetzt werden, was zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe oder die Zellen führen kann. Hier ist es der DNA-inspirierten Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) gelungen, eine hochlokalisierte Mikroumgebung mit einer Schicht-für-Schicht-Struktur für selbsttragende Knorpelgewebekonstrukte zu erreichen. JBNms sind selbstorganisierend aus Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts), Matrilin-3 und dem transformierenden Wachstumsfaktor beta-1 (TGF-β1) über Bioaffinität. Der JBNm wurde in einem TGF-β1:matrilin-3:JBNt-Verhältnis von 1:4:10 zusammengebaut, da dies das bestimmte Verhältnis war, bei dem eine ordnungsgemäße Montage in die Schicht-für-Schicht-Struktur erfolgen konnte. Zunächst wurde die TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung gegeben. Dann wurde diese Mischung mehrmals pipettiert, um eine ausreichende Homogenität vor der Zugabe der JBNt-Lösung zu gewährleisten. Dieser bildete Schicht für Schicht JBNm, nachdem er erneut mehrfach pipettiert hatte. Eine Vielzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Schicht-für-Schicht-JBNm-Struktur, JBNts allein, Matilin-3 allein und TGF-β1 allein zu charakterisieren. Die Bildung von JBNm wurde mit UV-Vis-Absorptionsspektren untersucht, und die Struktur des JBNm wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Da das innovative schichtweise JBNm-Gerüst auf molekularer Ebene gebildet wird, konnte der fluoreszierende Farbstoff JBNm beobachtet werden. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht des injizierbaren JBNm eingeschlossen, was die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in die Umgebung verhindern, die lokalisierte Chondrogenese fördern und eine antihypertrophe Mikroumgebung fördern kann.

Einleitung

Gerüste im Tissue Engineering spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Unterstützung der Zellanheftung und der anschließenden Gewebeentwicklung¹. Typischerweise verlassen sich konventionelle Gewebekonstrukte ohne Gerüst auf die Zellkulturumgebung und zusätzliche Wachstumsfaktoren, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Darüber hinaus ist diese Zugabe von bioaktiven Molekülen in Gerüste oft der bevorzugte Ansatz zur Steuerung der Zelldifferenzierung und -funktion ^2,3. Einige Gerüste können die biochemische Mikroumgebung nativer Gewebe unabhängig voneinander nachahmen, während....

Protokoll

1. Synthese von JBNts

1. Herstellung des JBNt-Monomers unter Verwendung zuvor veröffentlichter Methoden, die die Synthese einer Vielzahl von Verbindungen^{beinhalten 12}.
2. Reinigen Sie das rohe JBNt-Monomer, nachdem es mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule synthetisiert wurde. Verwenden Sie Lösungsmittel A: 100% Wasser, Lösungsmittel B: 100% Acetonitril und Lösungsmittel C: HCl-Wasserlösung mit pH = 1. Verwenden Sie eine Durchflussrate von 3 ml/min. Sammeln Sie den größten in der HPLC erhaltenen Peak nach 7,2 min.

2. Fert....

Ergebnisse

Nach dem Protokoll wurden JBNts erfolgreich synthetisiert und mit UV-Vis-Absorption und TEM charakterisiert. Das JBNm ist ein injizierbares festes Gerüst, das einen schnellen biomimetischen Prozess durchläuft. Nachdem JBNts zu einer Mischung aus TGF-β1/Matrilin-3-Lösung in einer physiologischen Umgebung gegeben wurden, bildete sich ein festes Weißmaschengerüst, das auf den erfolgreichen Zusammenbau von JBNm hinweist, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Dies wurde in den Charakterisierungsmethod.......

Diskussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine biomimetische Gerüstplattform, das JBNm, zu entwickeln, um die Einschränkungen herkömmlicher Gewebekonstrukte zu überwinden, die auf Zellkulturumgebungen angewiesen sind, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Das JBNm ist ein Schicht-für-Schicht-Strukturgerüst für ein selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt. Das innovative Design basiert auf neuartigen DNA-inspirierten Nanomaterialien, den JBNts. Das JBNm, bestehend aus JBNts³⁰, TGF-β1 und Matrilin-3, wird du.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 % Normales Ziegenserum	Thermo Fisher	50062Z	Wirkstoff zur Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen während der Färbung.
24-Well-Platte	Corning	07-200-740	24-Well-Platte für vergleichende Zellkulturen.
384-Well-Platte, schwarz, unbehandelt	Thermo Fisher	262260	384-Well-Platte, die für Absorptionsmessungen verwendet wird.
8-Well-Deckglas	Thermo Fisher	155409PK	8-Well-Deckglas für vergleichende Zellkulturen.
96-Well-Platte mit flachem Boden	Corning	07-200-91	96-Well-Platte für vergleichende Zellkulturen.
Unbehandelte 96-Well-Platte	Thermo Fisher	260895	96-Well-Platte, die für vergleichende Zellkulturen und Analysen verwendet wird.
Agarose Gel	Sigma-Aldrich	A9539	Hydrogel für die Zellkultur.
Agarose Gel	Sigma Aldrich	A9539	Hydrogel wird als Umgebung für die Zellkultur verwendet.
Alexa Fluor Mikroskaliges Proteinmarkierungskit	Thermo Fisher	A30006 (488) und A30007 (555)	Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung von Proteinen.
Anti-Collagen X Antikörper	Thermo Fisher	41-9771-82	Antikörper zur Färbung von Kollagen-X.
Bio-Rad PCR-Maschine	Bio-Rad-Gerät		zur Durchführung von PCR an Proben.
C28/I2 Chondrozyten-Zelllinien-Zellen			, die zur Analyse der proliferativen Fähigkeiten verschiedener Proben verwendet werden.
Zellzählkit 8	Milipore Sigma	96992	Zellproliferations-Assay.
Cell Profiler	Broad Institute		Software zur Analyse von Zellbildern.
Kryostat-Mikrotomgeräte			zur Herstellung dünner Probensegmente für die Verwendung in der Färbung und Mikroskopie.
DAPI	Invitrogen	D1306	Blaufluoreszierender Farbstoff, der an Adenin-Thymin-DNA-Regionen bindet.
Einwegküvetten	FISHER Scientific	14-955-128	Behälter für die Spektralphotometrie.
DMEM Zellkulturmedium	Thermo Fisher	10566032	Medien zur Unterstützung des Zellwachstums.
Fötales Rinderserum	GIBCO	A4766801	Serum, das in Zellkulturmedium zur Unterstützung des Zellwachstums verwendet wird.
Fluoromount-G Eindeckmedium	Thermo Fisher	00-4958-02	Lösung zum Einbetten von Objektträgern für die Immunfärbung.
Formaldehydverbindung			die verwendet wird, um Proben vor dem Mikrotoming zu fixieren.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper	Thermo Fisher	A16110	Antikörper für die Proteinfärbung.
Humane mesenchymale Stammzellen	LONZA	PT-2501	Zellen, die zur Analyse der Differenzierungsfähigkeiten verschiedener Proben verwendet werden.
Chondrogenes Medium für humanen mesenchymalen Stamm	LONZA	PT-3003	Zellmedium zur Förderung der chondrogenen Differenzierung.
ImageJ	National Institutes of Health		Bildanalysesoftware, die in Verbindung mit der Mikroskopie verwendet wird.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit für die PCR.
Janus-Base Nanotubes (JBNts)			Nanoröhren aus synthetischen Nukleobasen, die als Werkzeug für das Zellgerüst dienen.
LaB6 20-120 kV Transmission Elektronisches Mikroskop	Tecnai		Gerät zur Durchführung der Transmissionselektronenmikroskopie an einer Probe.
MATLAB	MathWorks		Statistische Software, die für die Modellierung und Datenanalyse verwendet wird.
Matrilin-3	Fisher Scientific	3017MN050	Strukturprotein, das als Adhäsionsstellen für Chondrozyten verwendet wird.
NanoDrop Spektralphotometer	Thermo Fisher		Gerät zur Messung der Absorptionswerte einer Probe.
Nikon A1R Konfokales Spektralmikroskop	Nikon	A1R HD25	Konfokales Mikroskop zur Analyse von Proben.
Nummer 1.5 Kammer Deckglas	Thermo Fisher	152250	Umgebung für sterile Zellkulturen und Bildgebung.
Reagenzverbindung			Verbindung, die zum Einbetten von Zellen vor dem Mikrotoming verwendet wird.
Paraformaldehyd	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Verbindung zur Fixierung von Zellen.
PDC-32G Plasmareiniger	Harrick Plasmareiniger		wird zur Vorbereitung von Gittern vor der Transmissionselektronenmikroskopie verwendet.
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15-140-148	Antibiotikum, das verwendet wird, um das Bakterienwachstum während der Zellkultur zu verhindern.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher 10010023		Lösung, die zum Waschen des Zellmediums verwendet wird und während des Experimentierens als Puffer dient.
Rhodamin-Phalloidin:	Invitrogen	R415	F-Aktinrot, Fluoreszenzfarbstoff.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit zum Filtern und Homogenisieren von Proben während der RNA-Extraktion.
Saccharoselösungslösung			, die zur Verarbeitung von Proben vor dem Mikrotoming verwendet wird.
TGF beta-1 ELISA Kit für den Menschen	Invitrogen	BMS249-4	Assay-Kit zur Bestimmung des Vorhandenseins von TGF-β 1 in einer Stichprobe.
TGF-Β 1	PEPROTECH	100-21C	Wachstumsfaktor zur Stimulierung der chondrogenen Differenzierung und Proliferation.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Compound zur Lyse von Zellen, die während des Färbeprozesses nicht fixiert sind.
TRIzol Reagenz	Thermo Fisher	15596026	Reagenz zur Isolierung von RNA
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipment zur Messung der Zetapotenzialwerte einer Probe.

, mit optimaler Schnitttemperatur .