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Methodenartikel

Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

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⸱

DOI:

10.3791/63984

⸱

6. Juli 2022

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.

Zusammenfassung

Verschiedene Biomaterial-Scaffolds wurden entwickelt, um die Zelladhäsion und -proliferation zu steuern, in der Hoffnung, spezifische Funktionen für In-vitro - und In-vivo-Anwendungen zu fördern. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren in diese Biomaterialgerüste erfolgt im Allgemeinen, um eine optimale Zellkulturumgebung zu schaffen, die die Zelldifferenzierung und ihre nachfolgenden Funktionen vermittelt. Die Wachstumsfaktoren in einem herkömmlichen Biomaterialgerüst sind jedoch typischerweise so konzipiert, dass sie bei der Implantation freigesetzt werden, was zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe oder die Zellen führen kann. Hier ist es der DNA-inspirierten Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) gelungen, eine hochlokalisierte Mikroumgebung mit einer Schicht-für-Schicht-Struktur für selbsttragende Knorpelgewebekonstrukte zu erreichen. JBNms sind selbstorganisierend aus Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts), Matrilin-3 und dem transformierenden Wachstumsfaktor beta-1 (TGF-β1) über Bioaffinität. Der JBNm wurde in einem TGF-β1:matrilin-3:JBNt-Verhältnis von 1:4:10 zusammengebaut, da dies das bestimmte Verhältnis war, bei dem eine ordnungsgemäße Montage in die Schicht-für-Schicht-Struktur erfolgen konnte. Zunächst wurde die TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung gegeben. Dann wurde diese Mischung mehrmals pipettiert, um eine ausreichende Homogenität vor der Zugabe der JBNt-Lösung zu gewährleisten. Dieser bildete Schicht für Schicht JBNm, nachdem er erneut mehrfach pipettiert hatte. Eine Vielzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Schicht-für-Schicht-JBNm-Struktur, JBNts allein, Matilin-3 allein und TGF-β1 allein zu charakterisieren. Die Bildung von JBNm wurde mit UV-Vis-Absorptionsspektren untersucht, und die Struktur des JBNm wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Da das innovative schichtweise JBNm-Gerüst auf molekularer Ebene gebildet wird, konnte der fluoreszierende Farbstoff JBNm beobachtet werden. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht des injizierbaren JBNm eingeschlossen, was die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in die Umgebung verhindern, die lokalisierte Chondrogenese fördern und eine antihypertrophe Mikroumgebung fördern kann.

Einleitung

Gerüste im Tissue Engineering spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Unterstützung der Zellanheftung und der anschließenden Gewebeentwicklung1. Typischerweise verlassen sich konventionelle Gewebekonstrukte ohne Gerüst auf die Zellkulturumgebung und zusätzliche Wachstumsfaktoren, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Darüber hinaus ist diese Zugabe von bioaktiven Molekülen in Gerüste oft der bevorzugte Ansatz zur Steuerung der Zelldifferenzierung und -funktion 2,3. Einige Gerüste können die biochemische Mikroumgebung nativer Gewebe unabhängig voneinander nachahmen, während andere die Zellfunktionen über Wachstumsfaktoren direkt beeinflussen können. Forscher stoßen jedoch häufig auf Herausforderungen bei der Auswahl von Gerüsten, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Differenzierung positiv beeinflussen und gleichzeitig eine optimale strukturelle Unterstützung und Stabilität über einen langen Zeitraum bietenkönnten 4,5. Die bioaktiven Moleküle sind oft lose an das Gerüst gebunden, was zu einer schnellen Freisetzung dieser Proteine bei der Implantation führt, was zu ihrer Freisetzung an unerwünschten Stellen führt. Dies gipfelt in Nebenwirkungen auf Gewebe oder Zellen, die nicht absichtlich gezielt angegriffen wurden 6,7.

Gerüste bestehen typischerweise aus polymeren Materialien. Die Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) ist eine biomimetische Gerüstplattform, die mit einer neuartigen Schicht-für-Schicht-Methode für selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt8 erstellt wurde. Diese neuartigen DNA-inspirierten Nanoröhren wurden Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts) genannt, da sie die Struktur und Oberflächenchemie von Kollagen in der extrazellulären Matrix (ECM) richtig nachahmen. Durch die Zugabe von bioaktiven Molekülen wie Matilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) kann das JBNm eine optimale Mikroumgebung schaffen, die dann die gewünschte Zell- und Gewebefunktionalität stimulieren kann9.

JBNts sind neuartige Nanoröhrchen, die aus synthetischen Versionen der Nukleobase Adenin und Thymin gewonnen werden. Die JBNts werden durch Selbstorganisation10 gebildet; Sechs synthetische Nukleobasen verbinden sich zu einem Ring, und diese Ringe unterliegen π-π-Stapelwechselwirkungen, um eine Nanoröhre von 200-300 μm Länge11 zu erzeugen. Diese Nanoröhrchen ähneln strukturell Kollagenproteinen; Durch die Nachahmung eines Aspekts der nativen Knorpelmikroumgebung wurde gezeigt, dass JBNts eine günstige Bindungsstelle für Chondrozyten und humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) bieten11,12,13,14. Da die Nanoröhrchen einer Selbstorganisation unterzogen werden und keinerlei Initiator (wie UV-Licht) benötigen, zeigen sie ein aufregendes Potenzial als injizierbares Gerüst für schwer zugängliche Defektbereiche15.

Matrilin-3 ist ein strukturelles extrazelluläres Matrixprotein, das im Knorpel vorkommt. Dieses Protein spielt eine bedeutende Rolle bei der Chondrogenese und der richtigen Knorpelfunktion16,17. Vor kurzem wurde es in Biomaterialgerüste aufgenommen, was die Chondrogenese ohne Hypertrophie fördert 9,18,19. Durch die Aufnahme dieses Proteins in das JBNm werden Knorpelzellen von einem Gerüst angezogen, das ähnliche Komponenten wie seine native Mikroumgebung enthält. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Matrilin-3 für die korrekte TGF-β1-Signalisierung innerhalb der Chondrozytenbenötigt wird 20. Wachstumsfaktoren fungieren als Signalmoleküle und verursachen spezifisches Wachstum einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Gewebes. Um eine optimale Knorpelregeneration zu erreichen, sind Matrilin-3 und TGF-β1 wesentliche Bestandteile innerhalb des JBNm. Die Zugabe von TGF-β1 in das schichtweise Gerüst kann die Knorpelregeneration in einem Gewebekonstrukt weiter fördern. TGF-β1 ist ein Wachstumsfaktor, der eingesetzt wird, um den Heilungsprozess von osteochondralen Defekten zu fördern und die Proliferation und Differenzierung von Chondrozyten und hMSC zu fördern21,22. Somit spielt TGF-β1 eine Schlüsselrolle bei der Knorpelregeneration JBNm (J/T/M JBNm)23 und fördert das richtige Wachstum, insbesondere wenn es innerhalb der JBNm-Schichten lokalisiert ist.

Wie bereits erwähnt, werden Wachstumsfaktoren typischerweise auf der Außenseite von Gerüsten ohne spezifische Einbaumethoden montiert. Hier wurde mit der präzise gestalteten Nanoarchitektur der Biomaterialien das JBNm für das spezifische Targeting von beabsichtigten Zellen und Geweben entwickelt. Das JBNm besteht aus TGF-β1, das auf JBNt-Oberflächen in der inneren Schicht und Matrilin-3 auf JBNt-Oberflächen in der äußeren Schicht24,25 haftet. Der Einbau von TGF-β1 in die innere Schicht der Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine stark lokalisierte Mikroumgebung entlang der JBNm-Fasern, wodurch ein homöostatisches Gewebekonstrukt mit einer viel langsameren Freisetzung des Proteins12 entsteht. Die Injektionsfähigkeit des JBNm macht es zu einem idealen Knorpelgewebekonstrukt für verschiedene zukünftige Biomaterialanwendungen26.

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Protokoll

1. Synthese von JBNts

  1. Herstellung des JBNt-Monomers unter Verwendung zuvor veröffentlichter Methoden, die die Synthese einer Vielzahl von Verbindungenbeinhalten 12.
  2. Reinigen Sie das rohe JBNt-Monomer, nachdem es mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule synthetisiert wurde. Verwenden Sie Lösungsmittel A: 100% Wasser, Lösungsmittel B: 100% Acetonitril und Lösungsmittel C: HCl-Wasserlösung mit pH = 1. Verwenden Sie eine Durchflussrate von 3 ml/min. Sammeln Sie den größten in der HPLC erhaltenen Peak nach 7,2 min.

2. Fertigung für JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

HINWEIS: Video 1 zeigt, dass der JBNm ein injizierbarer Feststoff ist, der in einer physiologischen Umgebung (Wasserlösung, kein UV-Licht, keine chemischen Zusätze und keine Erwärmung) gebildet wird und auch biologisch inspiriert ist.

  1. 8 μL 1 mg/ml TGF-β1 suspendiert in H2O auf32μL 1 mg/ml Matrilin-3 suspendiert inH2O. Pipette zugeben, um eine ordnungsgemäße Mischung dieser Proteine zu gewährleisten.
  2. 80 μL 1 mg/ml JBNts suspendiert inH2Ozur TGF-β1/Matrilin-3-Lösung zugeben. Pipetten Sie wiederholt, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Das Vorhandensein von weißen Flocken kann unmittelbar nach der Zugabe von JBNts beobachtet werden, was auf die Bildung des JBNm hinweist (Video 1).

3. Beobachtung von Proben mit UV-sichtbarer (UV-Vis) Absorption

HINWEIS: Die UV-Vis-Absorptionsspektren wurden untersucht, um die Assemblierung des JBNm zu charakterisieren. Diese Messung wurde für vier Kategorien analysiert: JBNts allein, Matrilin-3 allein, TGF-β1 allein und das gesamte Schicht-für-Schicht-JBNm, bestehend aus allen drei Teilen. Alle Anfangskonzentrationen sind inH2Osuspendiert.

  1. Für die JBNt-Gruppe werden 5 μL 1 mg/ml JBNts zu 50 μLH2Ohinzugefügt, um eine 90,9 μg/ml Lösung herzustellen.
  2. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 15 μLH2Ogegeben, um eine 7,3 μg/ml Lösung zu erhalten.
  3. Für die TGF-β1-Gruppe werden 10 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 45 μLH2Ogegeben, um eine 1,8 μg/ml Lösung herzustellen.
  4. Für die JBNm-Gruppe addieren Sie 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 10 μL 10 μg/mL TGF-β1. Rühren, um eine ordnungsgemäße Mischung sicherzustellen, und dann 5 μL 1 mg / ml JBNts zur Lösung hinzufügen und wiederholt pipettieren, um die Probe zu mischen.
  5. Messen Sie mit einem Spektralphotometer das Absorptionsspektrum jeder Gruppe.

4. Zetapotentialmessung von Proben

HINWEIS: Das Zeta-Potential wurde analysiert, um besser vorhersagen zu können, wie der JBNm mit in vivo Gewebe interagieren würde. Drei Gruppen wurden gemessen: Matrilin-3 allein, Matilin-3 mit TGF-β1 und das gesamte Schicht-für-Schicht-JBNm.

  1. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 160 μL 10 mg/ml Matrilin-3 zu 640 μLH2Ogegeben, um eine 800 μL Lösung herzustellen.
  2. Für die Matrilin-3/TGF-β1-Verbindung werden 160 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 40 μL 10 μg/ml TGF-β1 hinzugefügt. Pipetten Sie wiederholt, um die richtige Homogenität zu gewährleisten. Dann fügen Sie es zu 600 μLH2Ohinzu, was zu einer 800 μL Lösung führt.
  3. Für die JBNm-Gruppe fügen Sie 160 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 40 μL 10 μg/ml TGF-β1 hinzu. Pipette mehrmals, um die Proteine zu mischen. Dann 20 μL 1 mg/ml JBNts in die Lösung geben und pipetten, um die Homogenität zu gewährleisten. Schließlich wird die JBNm-Lösung zu 580 μLH2Ogegeben, um eine 800 μL-Lösung zu erhalten.
  4. Messen Sie die Zeta-Potentialwerte für die drei Gruppen.

5. Herstellung von JBNt/matrilin-3 Nanomatrix für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

HINWEIS: Die TEM-Charakterisierung wird durchgeführt, um die Morphologie von JBNts und JBNm zu charakterisieren.

  1. Führen Sie zwei Gitter in einen Plasmareiniger ein, um die Gitter vor der negativen Färbung der JBNts und JBNm gemäß den veröffentlichten Protokollen und den Protokollen des Herstellers12 ordnungsgemäß zu reinigen.
  2. Man kann eine 200 μg/ml JBNt-Lösung herstellen, indem man 10 μL 1 mg/ml JBNts mit 40 μL destilliertem Wasser mischt.
  3. Mischen Sie 30 μL 100 μg/ml Matrilin-3 mit 20 μL 100 μg/ml TGF-β1 und pipetten Sie mehrmals. Zur Herstellung der JBNm-Probe werden 10 μL 1 mg/ml JBNts in das Matilin-3/TGF-β1-Gemisch gegeben. Wieder wiederholt pipetten.
  4. 3 μL der JBNt-Lösung (200 μg/ml) und 3 μL der JBNm-Lösung auf getrennten Gittern zugeben und 2 min stehen lassen.
  5. Spülen Sie jedes Gitter mit 100 μL Uranylacetatlösung (0,5%). Verwenden Sie Filterpapiere, um die überschüssige Lösung zu entfernen und die Gitter an der Luft trocknen zu lassen.
  6. Bedienen Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, um die Proben richtig zu beobachten und zu charakterisieren, wie zuvorveröffentlicht 11,12.

6. Messung von Absorptionsspektren fluoreszenzmarkierter Proteine

HINWEIS: Die Struktur von JBNm wird durch Beobachtung der Strukturen des JBNm mit Absorptionsspektralanalyse verifiziert.

  1. Beschriften Sie den TGF-β1 mit einem Proteinmarkierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. 20 μL 20 μg/ml markiertes TGF-β1 zu 25 μLH2Ogeben, um eine 8,9 μg/ml Testlösung herzustellen.
  2. Beschriften Sie den Matrilin-3 mit einem separaten Beschriftungskätzchen. Man fügt 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 zu 25 μLH2Ohinzu, um eine 36 μg/ml Testlösung herzustellen.
    HINWEIS: Die fluoreszierende Farbstoffmarkierung des TGF-β1 ergab eine Endkonzentration von 20 μg/ml, während die Markierung des Matrilin-3 zu einer Endkonzentration von 80 μg/ml führte.
  3. Mischen Sie 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 mit 20 μL von 20 μg/ml markiertem TGF-β1 und 5 μLH2O, was zu einer markierten TGF-β1/Matrilin-3-Verbindung führt. Pipetten Sie die Mischung mehrmals, um sie zu mischen.
  4. Man gibt 5 μL 1 mg/ml JBNts zu 40 μLH2O, was zu einer 111 μg/ml Lösung führt.
  5. 20 μL 20 μg/mL markiertes TGF-β1 auf 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 geben und mehrmals pipettieren. Fügen Sie 5 μL 1 mg/ml JBNts zu der markierten TGF-β1/Matrilin-3-Lösung hinzu und pipetten Sie wiederholt, um die Verbindung richtig zu mischen.
    HINWEIS: Die Endkonzentrationen der JBNt-Proben, gekennzeichnet mit TGF-β1, und der markierten Matrilin-3-Proben betrugen 111 μg/ml, 8,9 μg/ml bzw. 36 μg/ml.
  6. Übertragen Sie jede Probengruppe (d. h. TGF-β1 (Schritt 6.1), beschriftete Matrilin-3 (Schritt 6.2), beschriftete TGF-β1/matrilin-3 (Schritt 6.3), JBNts (Schritt 6.4), JBNm (Schritt 6.5)) in ihre eigene Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Platte.
  7. Legen Sie die schwarze 384-Well-Platte in einen Multimode-Mikroplattenleser ein und messen Sie bei Anregungswellenlängen von 488 nm und 555 nm gemäß dem Protokoll des Herstellers.

7. In-vitro-Test der biologischen Funktion

  1. Zellhaftungstest an vorbeschichteten Deckglaskammern
    1. Bereiten Sie zwei Kammerdeckgläser mit fünf Probengruppen vor, da für jeden Zelltyp ein Deckglas verwendet wird.
    2. 1,25 μL 1 mg/ml JBNts zu 198,75 μL destilliertem Wasser geben, was zu einer 6,25 μg/ml Lösung führt.
    3. 10 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 190 μL destilliertem Wasser geben, was zu einer 0,5 μg/mLLösung führt.
    4. 2,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 197,5 μg/ml destilliertem Wasser geben, was zu einer 0,125 μg/ml Lösung führt.
    5. Für die JBNm-Gruppe 10 μL 10 μg/ml Matilin-3 zu 2,5 μL 10 μg/mLTGF-β1 geben und wiederholt pipettieren. 1,25 μL JBNts mit einer Konzentration von 1 mg/ml in die Mischungslösung geben und pipetten. Schließlich werden 186,25 μL destilliertes Wasser hinzugefügt, um eine 200 μL JBNm-Lösung zu erhalten.
      1. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe 200 μL destilliertes Wasser.
    6. Fügen Sie jede Probengruppe in eine eigene Vertiefung aus einem Kammerdeckglas Nr. 1,5 hinzu. Das Deckglas für 1 h in einen Gefrierschrank bei -80 °C geben und anschließend mit einem Gefriergerät gefriertrocknen.
    7. Samen Sie humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) und menschliche Chondrozytenzellen (10.000 Zellen pro Well) in jede Vertiefung der vorbereiteten Kammerdeckgläser.
    8. Die beiden Deckgläser für 4 h in einem 37 °C Inkubator inkubieren. Dann saugen Sie das Zellkulturmedium ab und spülen Sie zweimal mit PBS ab.
    9. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 5 min und entfernen und spülen Sie dann Proben mit PBS. Spülen Sie die Probe ein zweites Mal, um das 4% ige Paraformaldehyd vollständig zu entfernen.
    10. Zellen mit 100 μL 0,1% Triton-X für 10 min inkubieren und mit PBS waschen. Geben Sie 100 μL 0,165 μM Rhodamin-Phalloidin in jede Vertiefung. Warten Sie 30 Minuten und waschen Sie dann erneut mit PBS.
    11. Fügen Sie 0,1 μg/ml DAPI zu jeder Vertiefung hinzu, um die Kerne zu färben. Warten Sie 5 min und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS ab.
    12. Verwenden Sie ein spektrales konfokales Mikroskop, um die Zellmorphologie zu beobachten und fluoreszierende Bilder aufzunehmen.
    13. Analysieren Sie außerdem die Zellzahl und Morphologie mit Bildverarbeitungssoftware. Öffnen Sie die Software und laden Sie die Bilder. Fügen Sie einen Maßstabsbalken hinzu und kalibrieren Sie die Software. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem bestimmten Bereich für jede Probe. Verwenden Sie dann das Messwerkzeug, um Daten zur Zellmorphologie für jede Probe zu sammeln.
  2. Zellproliferation
    1. Bereiten Sie drei unbehandelte 96-Well-Platten vor und fügen Sie jeweils fünf Gruppen von Proben hinzu.
      1. Für die JBNt-Gruppe werden 3,75 μL 1 mg/ml JBNts zu 596,25 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer 600 μL JBNt-Lösung mit einer Konzentration von 6,25 μg/ml führt.
      2. Für die TGF-β1-Gruppe werden 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 592,5 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer Testlösung von 0,125 μg/ml führt.
      3. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 30 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 570 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer 0,5 μg/ml Testlösung führt.
      4. Für die JBNm-Gruppe 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 mit 30 μL 10 μg/ml Matilin-3 mischen und mehrmals pipettieren, gefolgt von Zugabe von 3,75 μL 1 mg/ml JBNts zur Lösung.
      5. JBNm-Lösung wird mit 558,75 μl destilliertem Wasser verdünnt, um die Endkonzentrationen von 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml bzw. 0,5 μg/ml für JBNt-, TGF-β1- und Matrilin-3-Proben zu erhalten.
      6. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe 600 μL destilliertes Wasser.
    2. Teilen Sie jede Probengruppe in sechs Vertiefungen auf (100 μL Probe pro Vertiefung).
    3. Die drei Platten mit allen Proben werden für 1 h in einen Gefrierschrank bei -80 °C gegeben und anschließend mit einem Gefriergerät gefriergetrocknet.
    4. Säen Sie hMSCs auf diese Platten und erhalten jeweils eine 100-μL-Zellsuspension (pro Vertiefung) mit 5.000 Zellen. Die drei Platten bei 37 °C für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage bei 5% CO2 inkubieren.
    5. 10 μL CCK-8-Lösung in jede Vertiefung mit den Zellen geben und bei 37 °C für weitere 2 h inkubieren.
    6. Messen Sie die Absorptionswerte jeder Vertiefung mit Multimode-Mikroplattenlesern bei 450 nm.
    7. Säen Sie einen bekannten Gradienten von hMSCs auf eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie für 4 h. Verwenden Sie den CCK-8-Assay, um die Absorptionswerte der bekannten Anzahl von Zellen zu messen und eine Standardkurve zu erstellen.
    8. Berechnen Sie die Zellproliferation mithilfe der Absorptionsstandardkurve.
  3. Stabilitätstest
    HINWEIS: Ein humanes TGF-β1-gezieltes ELISA-Kit wurde verwendet, um die prozentuale Freisetzung von TGF-β1 aus dem JBNm in einem Agarose-Hydrogel zu bestimmen.
    1. Bereiten Sie 2% Agarose vor, indem Sie 400 mg Agarosepulver zu 20 ml PBS geben und auf 100 °C erhitzen, um das Agarosepulver vollständig aufzulösen.
    2. Bereiten Sie das JBNm im gekühlten 2% igen Agarose-Hydrogel vor.
      1. Kombinieren Sie 10 μL 10 μg/ml TGF-β1, 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3, 5 μL 1 mg/ml JBNts und 195 μL PBS. Mischen Sie diese Lösung mit 250 μL 2% Agarose, wodurch das JBNm-Hydrogel entsteht.
    3. Fügen Sie 500 μL PBS hinzu, verwenden Sie es als Release-Lösung, und stellen Sie sicher, dass Sie es alle 3 Tage wechseln. Bewahren Sie jede freigegebene Lösung auf und lassen Sie die Probe 15 Tage lang ruhen.
    4. Verwenden Sie ein ELISA-Kit, um jede der erfassten Release-Lösungen zu testen, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
      ANMERKUNG: Durch Subtraktion der im PBS freigesetzten TGF-β1-Menge vom theoretischen Belastungswert von 100% kann die verbleibende Menge an TGF-β1 bestimmt werden.
  4. Zelldifferenzierungsanalyse mit PCR26.
    1. Es werden sieben Probengruppen vorbereitet, wobei jede Probe 20 μL Zellsuspension (4 x 104 Zellen), 30 μL der spezifischen Lösung (oder PBS, je nach Probengruppe) und 50 μL 2 Gew.-% Agarose enthält.
      1. Für die TGF-β1-Gruppe werden 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 25 μL PBS hinzugefügt, was zu einer 1,6 μg/ml Lösung führt.
      2. Für die Matrilin-3-Gruppe fügen Sie 20 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 10 μL PBS hinzu, was zu einer 6,7 μg/mL Lösung führt.
      3. Für die JBNt-Gruppe fügen Sie 2,5 μL 1 mg/ml JBNts zu 27,5 μL PBS hinzu, was zu einer 83,3 μg/ml Lösung führt.
      4. Für die J/T/M JBNm-Gruppe 10 μL 10 μg/ml Matrilin-3 auf 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zugeben und nach oben und unten pipettieren, um die Lösung zu mischen. Dann fügen Sie 2,5 μL 1 mg / ml JBNts hinzu und pipetten Sie erneut. Zum Schluss mit 2,5 μL PBS verdünnen.
      5. Verwenden Sie für jede Kontrollgruppe 30 μL PBS als Probe.
    2. Fügen Sie 0,5 ml Zellkulturmedium zu jeder Vertiefung hinzu und ersetzen Sie sie alle 3 Tage.
      1. Verwenden Sie für die Positivkontrollgruppe ein kommerziell erhältliches chondrogenes hMSC-Medium, das zugesetztes TGF-β1 enthält. Dieser zusätzliche TGF-β1 entspricht dem Betrag in den Gruppen TGF-β1 und J/T/M JBNm.
      2. Verwenden Sie für eine der Negativkontrollgruppen ein handelsübliches chondrogenes hMSC-Medium, das kein TGF-β1 enthält. Verwenden Sie für die andere Negativkontrollgruppe ein DMEM-Zellkulturmedium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält.
      3. Verwenden Sie für jede andere Gruppe ein kommerzielles chondrogenes hMSC-Zellkulturmedium ohne TGF-β1.
    3. Kultivieren Sie die Proben für 15 Tage.
    4. Extrahieren Sie die RNA der Proben und führen Sie eine PCR durch, um die Differenzierung der Proben wie zuvor beschriebenzu untersuchen 26.
  5. Immunfärbung für Typ-X-Kollagenexpressionstest
    1. Bereiten Sie sieben Agarose-basierte Proben auf die gleiche Weise vor wie die Zelldifferenzierung mit dem PCR-Methodenabschnitt (Schritt 7.4).
    2. Kultivieren Sie die Proben für 15 Tage.
    3. Die Proben 1 Tag lang mit 4% Formaldehyd fixieren, über Nacht in 30%iger Saccharoselösung einweichen und dann über Nacht bei -80 °C mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Fixieren Sie die Proben mit dem optimalen Schnitttemperatur-Compound-Reagenz (OCT), einer Mischung aus wasserlöslichen Glykolen und Harzen, bei -10 °C.
    4. Bedienen Sie ein Kryostat-Mikrotom, um 20 μm dicke gefrorene Abschnitte jeder Probe zu erhalten.
    5. Färben Sie jeden Abschnitt mit einem Anti-Collagen X-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:800 und einem fluoreszierenden sekundären Antikörper, der gemäß den Protokollen des Herstellers mit PBS verdünnt ist.
    6. Beobachten Sie jeden Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop mit einer Anregung von 488 nm und einer 40-fachen Vergrößerung des Okulars.

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Ergebnisse

Nach dem Protokoll wurden JBNts erfolgreich synthetisiert und mit UV-Vis-Absorption und TEM charakterisiert. Das JBNm ist ein injizierbares festes Gerüst, das einen schnellen biomimetischen Prozess durchläuft. Nachdem JBNts zu einer Mischung aus TGF-β1/Matrilin-3-Lösung in einer physiologischen Umgebung gegeben wurden, bildete sich ein festes Weißmaschengerüst, das auf den erfolgreichen Zusammenbau von JBNm hinweist, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Dies wurde in den Charakterisierungsmethod...

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Diskussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine biomimetische Gerüstplattform, das JBNm, zu entwickeln, um die Einschränkungen herkömmlicher Gewebekonstrukte zu überwinden, die auf Zellkulturumgebungen angewiesen sind, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Das JBNm ist ein Schicht-für-Schicht-Strukturgerüst für ein selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt. Das innovative Design basiert auf neuartigen DNA-inspirierten Nanomaterialien, den JBNts. Das JBNm, bestehend aus JBNts30, TGF-β1 und Matrilin-3, wird du...

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Offenlegungen

Dr. Yupeng Chen ist Mitbegründer von Eascra Biotech, Inc. und NanoDe Therapeutics, Inc.

Danksagungen

Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse 7R01AR072027 und 7R03AR069383, den NSF Career Award 1905785, die NSF 2025362 und die University of Connecticut unterstützt. Diese Arbeit wird teilweise auch durch den NIH-Zuschuss S10OD016435 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 % Normales ZiegenserumThermo Fisher50062ZWirkstoff zur Blockierung unspezifischer Antikörperbindungen während der Färbung.
24-Well-PlatteCorning07-200-74024-Well-Platte für vergleichende Zellkulturen.
384-Well-Platte, schwarz, unbehandeltThermo Fisher262260384-Well-Platte, die für Absorptionsmessungen verwendet wird.
8-Well-DeckglasThermo Fisher155409PK8-Well-Deckglas für vergleichende Zellkulturen.
96-Well-Platte mit flachem BodenCorning07-200-9196-Well-Platte für vergleichende Zellkulturen.
Unbehandelte 96-Well-PlatteThermo Fisher26089596-Well-Platte, die für vergleichende Zellkulturen und Analysen verwendet wird.
Agarose GelSigma-AldrichA9539Hydrogel für die Zellkultur.
Agarose GelSigma AldrichA9539Hydrogel wird als Umgebung für die Zellkultur verwendet.
Alexa Fluor Mikroskaliges ProteinmarkierungskitThermo FisherA30006 (488) und A30007 (555)Fluoreszenzfarbstoff zur Markierung von Proteinen.
Anti-Collagen X AntikörperThermo Fisher41-9771-82Antikörper zur Färbung von Kollagen-X.
Bio-Rad PCR-MaschineBio-Rad-Gerätzur Durchführung von PCR an Proben.
C28/I2 Chondrozyten-Zelllinien-Zellen, die zur Analyse der proliferativen Fähigkeiten verschiedener Proben verwendet werden.
Zellzählkit 8Milipore Sigma96992Zellproliferations-Assay.
Cell ProfilerBroad InstituteSoftware zur Analyse von Zellbildern.
Kryostat-Mikrotomgerätezur Herstellung dünner Probensegmente für die Verwendung in der Färbung und Mikroskopie.
DAPIInvitrogenD1306Blaufluoreszierender Farbstoff, der an Adenin-Thymin-DNA-Regionen bindet.
EinwegküvettenFISHER Scientific14-955-128Behälter für die Spektralphotometrie.
DMEM ZellkulturmediumThermo Fisher10566032Medien zur Unterstützung des Zellwachstums.
Fötales RinderserumGIBCOA4766801Serum, das in Zellkulturmedium zur Unterstützung des Zellwachstums verwendet wird.
Fluoromount-G EindeckmediumThermo Fisher00-4958-02Lösung zum Einbetten von Objektträgern für die Immunfärbung.
Formaldehydverbindungdie verwendet wird, um Proben vor dem Mikrotoming zu fixieren.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter SekundärantikörperThermo FisherA16110Antikörper für die Proteinfärbung.
Humane mesenchymale StammzellenLONZAPT-2501Zellen, die zur Analyse der Differenzierungsfähigkeiten verschiedener Proben verwendet werden.
Chondrogenes Medium für humanen mesenchymalen StammLONZAPT-3003Zellmedium zur Förderung der chondrogenen Differenzierung.
ImageJNational Institutes of HealthBildanalysesoftware, die in Verbindung mit der Mikroskopie verwendet wird.
itaq Universal SYBR Green One-Step KitBioRad1725150Kit für die PCR.
Janus-Base Nanotubes (JBNts)Nanoröhren aus synthetischen Nukleobasen, die als Werkzeug für das Zellgerüst dienen.
LaB6 20-120 kV Transmission Elektronisches MikroskopTecnaiGerät zur Durchführung der Transmissionselektronenmikroskopie an einer Probe.
MATLABMathWorksStatistische Software, die für die Modellierung und Datenanalyse verwendet wird.
Matrilin-3Fisher Scientific3017MN050Strukturprotein, das als Adhäsionsstellen für Chondrozyten verwendet wird.
NanoDrop SpektralphotometerThermo FisherGerät zur Messung der Absorptionswerte einer Probe.
Nikon A1R Konfokales SpektralmikroskopNikonA1R HD25Konfokales Mikroskop zur Analyse von Proben.
Nummer 1.5 Kammer DeckglasThermo Fisher152250Umgebung für sterile Zellkulturen und Bildgebung.
ReagenzverbindungVerbindung, die zum Einbetten von Zellen vor dem Mikrotoming verwendet wird.
ParaformaldehydThermo ScientificAAJ19943K2Verbindung zur Fixierung von Zellen.
PDC-32G PlasmareinigerHarrick Plasmareinigerwird zur Vorbereitung von Gittern vor der Transmissionselektronenmikroskopie verwendet.
Penicillin-StreptomycinGIBCO15-140-148Antibiotikum, das verwendet wird, um das Bakterienwachstum während der Zellkultur zu verhindern.
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermo Fisher 10010023Lösung, die zum Waschen des Zellmediums verwendet wird und während des Experimentierens als Puffer dient.
Rhodamin-Phalloidin:InvitrogenR415F-Aktinrot, Fluoreszenzfarbstoff.
Rneasy Plant Mini KitQIAGEN74904Kit zum Filtern und Homogenisieren von Proben während der RNA-Extraktion.
Saccharoselösungslösung, die zur Verarbeitung von Proben vor dem Mikrotoming verwendet wird.
TGF beta-1 ELISA Kit für den MenschenInvitrogenBMS249-4Assay-Kit zur Bestimmung des Vorhandenseins von TGF-β 1 in einer Stichprobe.
TGF-Β 1PEPROTECH100-21CWachstumsfaktor zur Stimulierung der chondrogenen Differenzierung und Proliferation.
Triton-XInvitrogenHFH10Compound zur Lyse von Zellen, die während des Färbeprozesses nicht fixiert sind.
TRIzol ReagenzThermo Fisher15596026Reagenz zur Isolierung von RNA
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalEquipment zur Messung der Zetapotenzialwerte einer Probe.
, mit optimaler Schnitttemperatur .

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