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Methodenartikel

Synthese von Graphen-Hydroxylapatit-Nanokompositen für den potenziellen Einsatz im Knochengewebe-Engineering

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DOI:

10.3791/63985

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27. Juli 2022

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1Department of Physics, Faculty of Science, Kasetsart University, 2Department of Microbiology, School of Science, RK. University, 3Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 4Defence Institute of Advanced Technology Campus, Navyukti Innovations Pvt. Ltd., 5Department of Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 6Department of Chemistry, Saveetha School of Engineering, Institute of Medical and Technical Science, Saveetha University, 7UFPI - Universidade Federal do Piauí

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Neuartige Nanokomposite aus Graphen-Nanobändern und Hydroxylapatit-Nanopartikeln wurden mittels Lösungsphasensynthese hergestellt. Wenn diese Hybriden in bioaktiven Gerüsten eingesetzt werden, können sie potenzielle Anwendungen im Tissue Engineering und in der Knochenregeneration aufweisen.

Zusammenfassung

Die Entwicklung neuartiger Materialien für das Knochengewebe-Engineering ist einer der wichtigsten Schwerpunkte der Nanomedizin. Mehrere Nanokomposite wurden mit Hydroxylapatit hergestellt, um die Zelladhärenz, -proliferation und -osteogenese zu erleichtern. In dieser Studie wurden erfolgreich hybride Nanokomposite unter Verwendung von Graphen-Nanobändern (GNRs) und Nanopartikeln aus Hydroxylapatit (nHAPs) entwickelt, die, wenn sie in bioaktiven Gerüsten eingesetzt werden, möglicherweise die Knochengeweberegeneration verbessern können. Diese Nanostrukturen können biokompatibel sein. Hier wurden zwei Ansätze zur Herstellung der neuartigen Materialien verwendet. In einem Ansatz wurde eine Kofunktionalisierungsstrategie verwendet, bei der nHAP gleichzeitig synthetisiert und mit GNRs konjugiert wurde, was zu Nanohybriden von nHAP auf GNR-Oberflächen (als nHAP / GNR bezeichnet) führte. Die hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) bestätigte, dass der nHAP/GNR-Verbund aus schlanken, dünnen Strukturen von GNRs (maximale Länge von 1,8 μm) mit diskreten Patches (150-250 nm) nadelartigem nHAP (40-50 nm Länge) besteht. Im anderen Ansatz wurde kommerziell erhältliches nHAP mit GNRs konjugiert, die GNR-beschichtetes nHAP (bezeichnet als GNR/nHAP) bildeten (d. h. mit einer entgegengesetzten Orientierung relativ zum nHAP/GNR-Nanohybrid). Der mit der letzteren Methode gebildete Nanohybrid zeigte nHAP-Nanosphären mit einem Durchmesser von 50 nm bis 70 nm, die mit einem Netzwerk von GNRs auf der Oberfläche bedeckt waren. Energiedispersive Spektren, Elementabbildung und Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FTIR) bestätigten die erfolgreiche Integration von nHAP und GNRs in beide Nanohybride. Die thermogravimetrische Analyse (TGA) ergab, dass der Verlust bei erhöhten Heiztemperaturen aufgrund des Vorhandenseins von GNRs 0,5% bzw. 0,98% für GNR/nHAP bzw. nHAP/GNR betrug. Die nHAP-GNR-Nanohybride mit entgegengesetzten Orientierungen stellen wichtige Materialien für den Einsatz in bioaktiven Gerüsten dar, um möglicherweise zelluläre Funktionen zur Verbesserung von Knochengewebe-Engineering-Anwendungen zu fördern.

Einleitung

Graphen hat plattenartige zweidimensionale Strukturen, die aus sp-hybridisiertem Kohlenstoff bestehen. Mehrere andere Allotrope können dem ausgedehnten Wabennetzwerk von Graphen zugeschrieben werden (z. B. bildet das Stapeln von Graphenschichten 3D-Graphit, während das Abrollen desselben Materials zur Bildung von 1D-Nanoröhrchenführt 1). Ebenso werden 0D-Fullerene durch Umhüllung2 gebildet. Graphen hat attraktive physikalisch-chemische und optoelektronische Eigenschaften, zu denen ein ambipolarer Feldeffekt und ein Quanten-Hall-Effekt bei Raumtemperaturgehören 3,4. Der Nachweis von Einzelmolekül-Adsorptionsereignissen und eine extrem hohe Trägermobilität tragen zu den attraktiven Eigenschaften von Graphen 5,6 bei. Darüber hinaus gelten Graphen-Nanobänder (GNRs) mit schmalen Breiten und einem großen mittleren freien Weg, niedrigem spezifischen Widerstand mit hoher Stromdichte und hoher Elektronenbeweglichkeit als vielversprechende Verbindungsmaterialien7. Daher werden GNRs für Anwendungen in einer Vielzahl von Geräten und in jüngster Zeit in der Nanomedizin erforscht, insbesondere in der Gewebezüchtung und Arzneimittelabgabe8.

Unter verschiedenen traumatischen Beschwerden gelten Knochenverletzungen als eine der schwierigsten aufgrund von Schwierigkeiten bei der Stabilisierung der Fraktur, der Regeneration und dem Ersatz durch neuen Knochen, dem Widerstand gegen Infektionen und der Neuausrichtung von Knochennicht-Verbindungen 9,10. Chirurgische Eingriffe bleiben die einzige Alternative für Oberschenkelschaftfrakturen. Es sei darauf hingewiesen, dass in Mittelamerika und Europa jedes Jahr fast 52 Millionen US-Dollar für die Behandlung von Knochenverletzungen ausgegebenwerden 11.

Bioaktive Gerüste für Knochengewebe-Engineering-Anwendungen können durch die Integration von Nano-Hydroxylapatit (nHAP) effektiver sein, da sie den mikro- und nanoarchitektonischen Eigenschaften des Knochens selbst ähneln12. HAP, chemisch dargestellt als Ca 10(PO4)6(OH)2 mit einem Ca/P-Molverhältnis von 1,67, ist am meisten bevorzugt für biomedizinische Anwendungen, insbesondere für die Behandlung von Parodontaldefekten, die Substitution von Hartgewebe und die Herstellung von Implantaten für orthopädische Operationen13,14. Daher kann die Herstellung von nHAP-basierten Biomaterialien, die mit GNRs verstärkt sind, eine überlegene Biokompatibilität besitzen und aufgrund ihrer Fähigkeit, die Osseointegration zu fördern und osteokonduktiv zu sein, von Vorteil sein15,16. Solche hybriden Kompositgerüste können biologische Eigenschaften wie Zelladhärenz, Ausbreitung, Proliferation und Differenzierung erhalten17. Hierin berichten wir über die Herstellung von zwei neuen Nanokompositen für das Knochengewebe-Engineering, indem wir die räumliche Anordnung von nHAP und GNRs rational verändern, wie in Abbildung 1 dargestellt. Hier wurden die chemischen und strukturellen Eigenschaften der beiden unterschiedlichen nHAP-GNR-Anordnungen bewertet.

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Protokoll

1. Synthese von nHAP durch Fällung

  1. Das makellose nHAP wird unter Verwendung von 50 ml des Reaktionsgemisches mit 1 M Ca(NO3)2∙4H2 Ound 0,67 M (NH4)H2PO4, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von NH4OH (25 %) synthetisiert, um einen pH-Wert um 1018 aufrechtzuerhalten.
  2. Danach das Reaktionsgemisch durch Ultraschallbestrahlung (UI) für 30 min (500 W Leistung und 20 kHz Ultraschallfrequenz) rühren.
  3. Lassen Sie die resultierende Lösung 120 h bei Raumtemperatur reifen, bis sich der weiße Niederschlag von nHAP absetzt. Gewinnen Sie das nHAP durch Zentrifugation bei 1398 x g für 5 min bei Raumtemperatur zurück.
  4. Waschen Sie den Niederschlag mit deionisiertem (DI) Wasser 3x und lyophilisieren Sie für 48 h. Lagern Sie das trockene Pulver bei 4 °C.

2. Herstellung von nHAP/GNR-Nanokompositen

HINWEIS: Im Folgenden werden zwei Ansätze zur Herstellung von nHAP/GNR (d. h. nHAP auf GNR-Oberflächen) und GNR/nHAP (GNR-beschichteten nHAP) Nanokompositen beschrieben, die zwei verschiedene räumliche Anordnungen von nHAP und GNRs darstellen (Abbildung 1).

  1. Synthese von nHAP/GNR
    1. Um das nHAP/GNRs-Nanokomposit herzustellen, verwenden Sie eine Kofunktionalisierungsstrategie, bei der nHAP wie folgt gleichzeitig synthetisiert und mit GNRs konjugiert werden kann.
    2. 5 mg GNR (Table of Materials) werden in einer Mischung aus 1 M Calciumnitrattetrahydrat [Ca(NO3)2·4H2O] und 0,67 M Diammoniumhydrogenphosphat [(NH 4)2 HPO4] zu einem 50 ml Endvolumen19 gelöst.
    3. Während dieser Reaktion fügen Sie 25% NH4OH tropfenweise hinzu, um den pH-Wert bei ~ 10 zu halten. Rühren Sie die resultierende Mischung durch UI für 30 min.
    4. Lassen Sie die Lösung nach Abschluss der Reaktion 120 h bei Raumtemperatur bis zur Reifung ungestört.
    5. Beobachten Sie die Bildung eines gallertartigen Niederschlags von nHAP, der die GNRs bedeckt, woraufhin sich ein weißer Niederschlag von nHAP / GNRs absetzt.
    6. Waschen Sie den Niederschlag 3x durch Zentrifugation bei 1398 x g für 5 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Redispergierung in DI-Wasser.
    7. Lyophilisieren Sie den zurückgewonnenen gewaschenen Niederschlag für 48 h. Lagern Sie das trockene Pulver bei 4 °C.
    8. Verwenden Sie makellose nHAP- und GNRs als Kontrollproben.
  2. Synthese von GNR/nHAP Nanokomposit
    1. Suspendieren Sie handelsübliche nHAP in einer Konzentration von 5 mg/ml in 50 ml DI-Wasser, ergänzt durch 5 mg GNR.
    2. Das resultierende Gemisch 30 min mittels UI rühren und danach 120 h bei Raumtemperatur ungestört lassen.
    3. Nach der Reifung wird der weiße Niederschlag des resultierenden GNR/nHAP durch Zentrifugation bei 1398 x g für 5 min bei Raumtemperatur zurückgewonnen.
    4. Waschen Sie die Probe 3x mit DI-Wasser, lyophilisieren Sie sie für 48 h und lagern Sie das trockene Pulver bei 4 ° C zur weiteren Verwendung.

3. Charakterisierung von nHAP, nHAP/GNR und GNR/nHAP

  1. Verwenden Sie ein hochauflösendes Transmissionselektronenmikroskop (HRTEM) (siehe Tabelle der Materialien), um die Morphologie und Größe der Nanokomposite zu charakterisieren11.
  2. Analysieren Sie die Elementzusammensetzung der Nanokomposite mittels energiedispersiver Spektroskopie (EDS) und führen Sie eine Elementkartierung mit dem Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM)11 durch.
  3. Führen Sie eine Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) für die sauberen Proben mit Wellenzahlen von 500-4000 cm−1 durch, um die chemischen Gruppen im Nanokomposit16 zu analysieren.
  4. Führen Sie eine Pulverröntgenbeugungsanalyse (XRD) des as-synthetisierten nHAP mit einer Röntgenwellenlänge von 1,5406 Å, Strom- und Spannungseinstellungen von 40 mA bzw. 40 kV und 2θ im Bereich von 20 ° bis 90 ° durch.
  5. Bewerten Sie die prozentuale Belastung der GNR im Nanokomposit mittels thermogravimetrischer Analyse (TGA), indem Sie die Proben von Raumtemperatur auf 1000 °C mit einer Rate von 10 °C/min unter Stickstofffluss erhitzen.

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Ergebnisse

HRTEM-Analyse
Einzeln waren GNRs schlanke, bambusähnliche Strukturen mit einigen Biegungen in einiger Entfernung, wie in Abbildung 2 beobachtet. Die längste GNR betrug 1,841 μm, während die kleinste gebogene GNR 497 nm betrug. Die Nanobänder zeigten oft eine sichtbare Variation der Breite, die an vielen Stellen auf Verdrehungen zurückzuführen ist, um spiralförmige Konfigurationen zu bilden. Eine solche unidirektionale Ausrichtung von GNRs kann dazu beitragen, attraktive M...

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Diskussion

Obwohl verschiedene Metalle, Polymere, Keramiken und ihre Kombinationen als orthopädische Implantate und Fixationszubehör erforscht wurden, gilt HAP aufgrund seiner chemischen Ähnlichkeit mit dem Knochen selbst und der daraus resultierenden hohen Zytokompatibilität als eines der am meisten bevorzugten Materialien20,21,22. In dieser Studie wurde die Orientierung von HAP variiert, was einen signifikanten Einfluss auf seine einziga...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Dr. Sougata Ghosh dankt dem Department of Science and Technology (DST), dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie, der indischen Regierung und dem Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Indien, für die Finanzierung im Rahmen des Post-Doctoral Overseas Fellowship in Nano Science and Technology (Ref. JNC / AO / A.0610.1 (4) 2019-2260 vom 19. August 2019). Dr. Sougata Ghosh dankt der Kasetsart University, Bangkok, Thailand, für ein Postdoktorandenstipendium und die Finanzierung im Rahmen des Reinventing University Program (Ref. Nr. 6501.0207/10870 vom 9. November 2021). Die Autoren danken der Kostas Advanced Nano-Characterization Facility (KANCF) für die Unterstützung bei den Charakterisierungsexperimenten. KANCF ist eine gemeinsame multidisziplinäre Forschungs- und Bildungseinrichtung innerhalb des Kostas Research Institute (KRI) an der Northeastern University.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ammoniumphosphat monobasischSigma-Aldrich216003-100GSynthese
Calciumnitrat-TetrahydratSigma-Aldrich237124Synthese
ZentrifugeHettichEBA 200SRecovery
Fourier-Transformations-InfrarotspektrometerBruckerVertex 70Charakterisierung
Graphen-NanobandSigma-Aldrich922714Synthesis
Hochauflösendes TransmissionselektronenmikroskopThermo Fisher ScientificThemis Titan 300Charakterisierung
MagnetrührerIKAC-MAG HS7 S68Funktionalisierung
MikropipettenTreffLab06H35687Reagenzienvorbereitung
pH-MessgerätEutech pH5+ECPH503PLUSK
Thermogravimetrischer Analysator TAInstrumentsSDT Q600Charakterisierung
UltraschallbadBandelinDT100Funktionalisierung
UniversalofenMemmertUF55Funktionalisierung
WaagePrecisaXB220AReagenzienvorbereitung
RöntgendiffraktometerBruckerD8-ErweiterteCharakterisierung

Referenzen

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