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Methodenartikel

Erleichterung der zerebralen Organoidkultur durch seitliche Weichlichtbeleuchtung

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DOI:

10.3791/63989

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6. Juni 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences, Wuyi University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Zerebrale Organoide bieten beispiellose Möglichkeiten zur Untersuchung der Organentwicklung und der Pathologie menschlicher Krankheiten. Obwohl mit zerebralen Organoid-Kultursystemen große Erfolge erzielt wurden, gibt es immer noch operative Schwierigkeiten bei der Anwendung dieser Technologie. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein zerebrales Organoidverfahren, das den Mediumswechsel und den Organoidtransfer erleichtert.

Zusammenfassung

Gegenwärtig ist die Technologie der zerebralen Organoidkultur noch kompliziert zu bedienen und in großem Maßstab schwer anzuwenden. Es ist notwendig, eine einfache und praktische Lösung zu finden. Daher wird in der vorliegenden Studie ein praktikables zerebrales Organoidprotokoll vorgeschlagen. Um die unvermeidbaren Unannehmlichkeiten beim Medienwechsel und Organoidtransfer in der Frühphase zu lösen, optimiert die aktuelle Forschung die Betriebstechnik durch Anwendung des Engineering-Prinzips. Eine Soft-Light-Lampe wurde verwendet, um die Proben des embryonalen Körpers (EB) seitlich zu beleuchten, so dass die EBs durch den verstärkten diffusen Reflexionseffekt mit bloßem Auge gesehen werden können. Unter Verwendung des Prinzips der durch Rotation erzeugten Sekundärströmung sammeln sich die Organoide in Richtung der Mitte des Bohrlochs, was die Durchführung eines Mediumwechsels oder Organoidtransfers erleichtert. Im Vergleich zur zerstreuten Zelle setzt sich der embryonale Körper schneller in der Pipette ab. Mit diesem Phänomen können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente auf einfache Weise effektiv entfernt werden, wodurch verhindert wird, dass EBs durch die Zentrifugation beschädigt werden. Diese Studie erleichtert die Operation der zerebralen Organoidkultur und hilft, die Anwendung von Gehirnorganoiden zu fördern.

Einleitung

Im Vergleich zu zweidimensionalen (2D) Kultursystemen haben dreidimensionale (3D) Kultursysteme mehrere Vorteile, darunter die echte Replikation und effiziente Reproduktion komplexer Strukturen bestimmter Organe1. Daher sind zerebrale Organoide eine der wichtigen Hilfsmethoden für die Forschungsfelder Entwicklung des menschlichen Gehirns und Krankheit2, Wirkstoffscreening und Zelltherapie.

Die Kultivierung zerebraler Organoide durch die rotierende Suspensionsmethode ist förderlich für ihre Entwicklung und Reifung3. Obwohl zerebrale Organoid-Kultursysteme große Erfolge erzielt haben, stehen sie immer noch vor kritischen Herausforderungen, die ihre Anwendung einschränken. Beispielsweise ist die manuelle Kultivierung mit komplizierten Manipulationsschritten verbunden und stellt Hindernisse für die Erzielung großflächiger Anwendungen dar. Darüber hinaus sind in jedem Entwicklungsstadium der Kultur der zerebralen Organoide Veränderungen in verschiedenen Medien und Zytokinen erforderlich4. Im Frühstadium haben die Organoide oder EBs jedoch winzige Größen (ca. 200 μm bis 300 μm) und sind ohne entsprechende Apparatur visuell nahezu unzugänglich. Zwangsläufig wird eine gewisse Menge wertvoller Organoidproben weggespült, wenn das Medium gewechselt wird. Viele Techniken wurden erforscht, um dies in anderen Arten von Organoidkulturen zu überwinden, und einige Beispiele umfassen das Eintauchen ganzer Organoidchips in ein Kulturmedium für 3 Tage ohne Intervention5; Hinzufügen eines frischen Mediums durch das Deckglas, nachdem das alte Medium mit saugfähigem Papierabsorbiert wurde 5; oder die Anwendung komplexer mikrofluidischer Rohrleitungen für den Flüssigkeitsaustausch 6,7,8. Ein weiteres Hindernis, das im frühen Stadium der Organoidkultivierung auftritt, ist die Schwierigkeit, direkte Beobachtungen mit bloßem Auge zu erreichen, was zu schlechten Operationen führen kann, die zu Organoidschäden und -verlusten während der Organoidtransferschritte führen. Daher ist es notwendig, ein praktikableres Protokoll zu etablieren, das den Mediumswechsel und die Organoidübertragung zur Erzeugung von Organoiden erleichtert.

Um diese Probleme zu überwinden, wird ein entsprechend optimierter Betrieb auf der Grundlage von Engineering-Prinzipien vorgeschlagen, der viele Organoid-Verfahren erheblich und bequem erleichtert. Wenn in der Natur die Sonne durch einen Fensterspalt in ein Haus scheint, kann das bloße Auge den Staub sehen, der im Lichtstrahl tanzt. Aufgrund der diffusen Reflexion von Sonnenlicht auf Staub wird etwas Licht in den Augapfel gebrochen, um ein visuelles Bild zu erzeugen. Inspiriert vom Prinzip dieses Phänomens 9,10 machte diese Studie eine weiche Lichtlampe und beleuchtete die EBs seitlich. Es wurde festgestellt, dass EBs visuell klar sein können, ohne den Betrachtungsumfang zu beeinträchtigen. Eine zum Zentrum zeigende Sekundärströmung wird in der Flüssigkeit erzeugt, indem die Kulturplatte aufgrund von Wirbelströmen11 gedreht wird. Ursprünglich verstreute EBs sammeln sich in der Mitte der Platte an. Auf dieser Grundlage und dem Phänomen, dass die Sedimentationsgeschwindigkeit von Organoiden schneller ist als die von Zellen, wird eine einfache Operationsmethode des Mittelwechsels und des Organoidtransfers ohne Zentrifugation vorgeschlagen. Die Organoide im Kulturmedium können durch diesen Transfervorgang effektiv von freien Zellen und toten Zellfragmenten getrennt werden.

Hier wird ein Protokoll vorgeschlagen, das einfach zu bedienen ist, um zerebrale Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen zu erzeugen. Die Betriebstechnologie wurde durch die Anwendung des Engineering-Prinzips optimiert, wodurch Operationen in der 3D-Kultur so einfach und machbar wie in der 2D-Kultur wurden. Die verbesserte Flüssigkeitsaustauschmethode und der Organoidtransferbetrieb sind auch für andere Arten von Organoidkulturen und das Design von automatischen Kulturmaschinen hilfreich.

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Protokoll

Das Protokoll wurde im Anschluss an die Erklärung von Helsinki durchgeführt. Die Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Dritten angeschlossenen Krankenhauses der Guangzhou Medical University erteilt (Medizinische und ethische Überprüfung [2021] Nr. 022). Vor dem Experiment wurde jedes Medium nach Jürgen A. Knoblichs Formel12 (Ergänzende Tabellen 1-4) hergestellt oder ein kommerziell erhältliches Cerebral Organoid Kit verwendet (siehe Materialtabelle). Die in dieser Studie verwendeten iPSCs wurden zuvor von unserem Labor festgelegt und haben eine informierte Ausnahme erhalten. Die SCA3-iPS-Zellen wurden von einer 31-jährigen weiblichen spinozerebellären Ataxie-Typ-3-Patientin (SCA3) generiert, die als 26/78-CAG-Wiederholungen im ATXN3-Gen13 genotypisiert wurde (Ergänzende Abbildung 1A). Die in einem früheren Artikel erwähnten normalen menschlichen iPSCs wurden als NC-iPSCs 14 ausgewählt, und das ATXN3-Gen wurde mit 14/14 CAG-Wiederholungen identifiziert (Ergänzende Abbildung 1B).

1. Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

  1. Sammeln Sie 3 ml peripheres Blut durch Venenpunktion mit der informierten Zustimmung von Freiwilligen und Patienten.
  2. Isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen nach der Ficoll-Paque-Methode15.
  3. Richten Sie iPSCs gemäß dem Protokoll des Sendai Reprogramming Kit ein (siehe Materialverzeichnis).
    1. Kultivieren Sie die iPSCs mit mTeSR1-Medium in 35 mm Petrischale, die mit Matrigel (einer Basalmembranmatrix, siehe Materialtabelle) bedeckt sind. Wechseln Sie das Medium jeden Tag. Die iPSC-Wachstumsdichte darf 75% nicht überschreiten.
    2. Verdauen Sie die Zellen mit PSC-Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und subkulturieren Sie sie alle 3-5 Tage im Verhältnis 1:5.
      ACHTUNG: Sendai-Virus wird hier verwendet. Es muss in der Biosicherheitskabine betrieben werden, und es müssen Selbstschutzmaßnahmen ergriffen werden. Es sollte klar sein, ob es im lokalen Land legal verwendet werden kann. Lokale Gesetze und Vorschriften zur biologischen Sicherheit müssen bei der Anwendung strikt befolgt werden.

2. EB-Vorbereitung (Tage 0-1)

  1. Entfernen Sie das mTeSR1-Medium mit einer Pipette aus den iPSCs und waschen Sie es 2x mit 1 ml 1x PBS.
  2. Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette und fügen Sie 300 μL Zellablösungslösung hinzu (siehe Materialtabelle), um die iPSCs für 3-4 min bei 37 °C in einzelne Zellen zu verdauen.
  3. Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml EB-Bildungsmedium (Ergänzende Tabelle 1) und zentrifugieren Sie die Probe dann für 5 min bei 300 x g (Raumtemperatur).
  4. Behandeln Sie die spezielle 24-Well-Platte 5 Minuten lang mit Anti-Adhärenz-Spüllösung (500 μL / Well) vor (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Anti-Adhärenz-Spüllösung ist für eine optimale EB- und Sphäroidbildung unerlässlich.
  5. Resuspendieren Sie die Zellen in EB-Bildungsmedium, das Y-27632 enthält (Endkonzentration, 10 μM, siehe Materialtabelle), mit einer Zelldichte von 1,5 x 106 Zellen/ml.
  6. Entfernen Sie die Anti-Adhärenz-Spüllösung und spülen Sie jede gut mit 2 ml EB-Bildungsmedium ab.
  7. Fügen Sie die Zellen zu den spezialisierten 24-Well-Platten mit einer Dichte von 3 x 106 Zellen/Well hinzu (Abbildung 1A, links).
    HINWEIS: Normalerweise können in jedem Brunnen 300 EBs zubereitet werden. Diese Methode kann große Mengen von EBs der gleichen Größe vorbereiten.
  8. Zentrieren Sie die Platte bei 100 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Verteilen Sie die Zellen in jeder Kammer gleichmäßig am unteren Rand der Platte (Abbildung 1A, rechts).
    HINWEIS: Wenn es keine geeignete Zentrifuge gibt, kann die Platte auch direkt in den Inkubator für statische Kultur gelegt werden, aber die Formationszeit der EB-Kugel wird einige Stunden später sein als die unter normaler Zentrifugation.
  9. Die Proben werden bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h inkubiert. Wenn im vorherigen Schritt keine Zentrifugation verwendet wurde, 36 h inkubieren. Halten Sie die Probe ruhig und nehmen Sie sie während dieser Zeit nicht aus dem Inkubator.

3. Vorbereitung der Soft-Light-Lampe (Tag 1)

  1. Verwenden Sie eine transparente Acrylplatte mit einer Dicke von 0,3-0,5 cm in der Größe von A5-Papier. Kleben Sie weiße Pads auf die Vorder- und Rückseite der Acrylplatte.
    1. Installieren Sie eine Reihe von LED-Weißleuchten am Rand der Platte, so dass die Lichter von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können (Ergänzende Abbildung 2A-F, Abbildung 1B).
      HINWEIS: Da die Durchmesser von EBs im Frühstadium etwa 200 μm bis 300 μm betragen, ist es schwierig, sie mit bloßem Auge unter der Leuchtstofflampe sauberer Bänke deutlich zu beobachten. Im Gegensatz dazu können wir aufgrund der Verstärkung der diffusen Reflexion die EBs deutlich erkennen, indem wir seitlich beleuchtetes weiches Licht verwenden (Abbildung 1B, C). Eine 6-Well-Platte wird für EB-Kulturen in nachfolgenden Experimenten empfohlen. Um jedoch die visuelle Wirkung von weichem Licht besser zu zeigen, wird in dieser Studie manchmal Geschirr verwendet, um Bilder und Videos anstelle von Tellern aufzunehmen, also bitte nicht falsch verstehen. Die seitlich beleuchtete Weichlichtlampe kann auch für die 6-Well-Platte verwendet werden.

4. EB-Übertragung und mittlerer Austausch (Tage 2-5)

  1. Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung vor und fügen Sie jedem Bohrloch 2 ml EB-Formationsmedium hinzu.
  2. Entfernen Sie die EBs zusammen mit dem Medium mit einer 1000 μL Breitrohr-Pipettenspitze (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie auf die 6-Well Low Adhäsion Platte (~100 EBs/Well).
    HINWEIS: Der Betriebsprozess verwendet eine Weichlichtlampe (in Schritt 3 erwähnt), um die Beobachtung der EBs zu erleichtern. Schalten Sie andere Innenlichtquellen aus, um den visuellen Effekt des weichen Lichts besser zu erzielen.
  3. Jeden Tag durch die gleiche Menge an frischem EB-Formationsmedium ersetzen. Verwenden Sie den sekundären Fluss, um die EBs in der Mitte zu sammeln und das Medium zu wechseln.
    1. Saugen Sie das alte Medium ab, indem Sie langsam an den Rand des Brunnens pipettieren. Nicht zu stark saugen; Andernfalls werden die EBs zusammen entfernt. Fügen Sie dann frisches Medium hinzu, um die EBs wieder anzuhalten.
      HINWEIS: Der prinzipielle Sekundärfluss (Abbildung 1D). Induzieren Sie einen Drallfluss, indem Sie die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn drehen. Aufgrund der Drallströmung wird eine sekundäre Strömung induziert, die auf das Zentrum gerichtet ist. Die EBs oder Organoide konvergieren aufgrund des durch Rotation erzeugten Sekundärflusses zum Zentrum des Bohrlochs, wonach der Mittelwechsel oder der Embryodentransfer leicht durchgeführt werden können.

5. Überprüfung der Pluripotenz durch Etikettierung mit Pluripotenzmarker OCT4 (Tag 4)

HINWEIS: Wenn der Durchmesser der EBs größer als 300 μm ist, nehmen Sie mehrere EBs für die OCT4-Marker-Immunfluoreszenzfärbung, um ihre Pluripotenz zu erkennen.

  1. Fixieren Sie die EBs in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 30 min, gefolgt von 1x PBS 3x für 10 min jedes Mal.
  2. Übertragen Sie die EBs auf Raumtemperatur PBS mit 0,3% Triton X-100 und 3% BSA für 2 h, gefolgt von Waschen in PBS 3x für jeweils 10 Minuten.
    HINWEIS: Nach der Behandlung mit Triton X-100 schwimmen die EBs auf der Flüssigkeitsoberfläche und können während der Reinigung leicht mit der Flüssigkeit abgesaugt werden. Eine Operation unter einem Stereomikroskop wird empfohlen.
  3. Verdünnen Sie den primären Antikörper OCT4 (siehe Materialtabelle) mit 1 ml 1x PBS, das 1% BSA enthält, in einem Verhältnis von 1:200 und fügen Sie den EBs für die Inkubation bei 4 °C über Nacht hinzu, dann waschen Sie in PBS 3x für jedes Mal 10 Minuten.
  4. Verdünnen Sie den jeweiligen Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) mit 1x PBS bei 1:500 und geben Sie 1 ml zu den EBs.
  5. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden waschen Sie die Zellen in 1x PBS 3x für jeweils 10 Minuten.
  6. Entfernen Sie das PBS, fügen Sie 2 ml 1x PBS-Lösung hinzu, die 1 μg / ml DAPI enthält, inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten und waschen Sie dann PBS 3x für jedes Mal für 10 Minuten.
  7. Bewegen Sie den EB mit einer kleinen Menge Flüssigkeit auf den Objektträger, versiegeln Sie den Objektträger mit einem Deckglas, das mit handelsüblichem Vaseline (siehe Materialtabelle) am Rand beschichtet ist, und beobachten und sammeln Sie das Bild dann unter dem Fluoreszenz-Konfokalmikroskop.
    HINWEIS: Der OCT4-Ausdruck steht für EB-Pluripotenz12. Wenn der Ausdruck von OCT4 weniger als 90% beträgt, sollten die EBs verworfen werden, und EBs sollten erneut vorbereitet werden.

6. Neuronale Induktion (Tage 5-7)

  1. Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung vor und fügen Sie 3 ml neuronales Induktionsmedium (Ergänzende Tabelle 2) zu jeder Vertiefung hinzu.
  2. Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein (in Schritt 3 erwähnt) und schalten Sie andere Innenlichtquellen aus.
  3. Übertragen Sie die EBs auf die 6-Well-Platte mit zugesetztem neuronalem Induktionsmedium (~ 100 EBs / Well). Fügen Sie dem neuen Brunnen so wenig wie möglich vom ursprünglichen Medium hinzu.
    HINWEIS: Führen Sie einfache Fähigkeiten des Organoid-Transfers ein. Natürlich sinken die resuspendierten EBs unter Schwerkraft und mit einer relativ höheren Dichte als das Medium allmählich ab, indem sie die in Abbildung 1E gezeigte Operation anwenden. Somit können die EBs bequem übertragen werden. Da freie Zellen und abgestorbene Zellfragmente im Vergleich zu EBs langsamer absinken, können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente durch diese Sedimentationsmethode entfernt werden (Abbildung 1F).
  4. Die Proben werden bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h inkubiert.
    HINWEIS: Unter dem Mikroskop betrug der Durchmesser der EBs ungefähr 500 μm und der Rand war durchscheinend, was darauf hindeutet, dass sich eine neuroepitheliale Schicht gebildet hat.
  5. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.

7. Einbettung in die Basalmembranmatrix (Tage 7-10)

  1. Legen Sie die Membranmatrix 60 Minuten im Voraus in einen 4 ° C-Kühlschrank, um sich aufzulösen. Berechnen Sie die Menge der benötigten Matrix im Voraus. Etwa 100 EBs wurden in 1,5 ml der Membranmatrix eingebettet.
  2. Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein und schalten Sie die Lichtquelle auf der Oberseite der Konsole aus.
  3. Halten Sie die Membranmatrix auf Eis, um eine Erstarrung zu verhindern.
  4. Geben Sie jedes Mal eine kleine Menge EBs in eine 60-mm-Schale mit frischem Expansionsmedium (Ergänzende Tabelle 3). Reduzieren Sie die Anzahl der EBs, um das Entfernen eines einzelnen EBs zu erleichtern.
  5. Verwenden Sie dann eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung. Saugen Sie jedes Mal eine einzelne EB (mit ca. 10 μL Medium) mit einer 200 μL Breitrohr-Pipettenspitze (siehe Materialtabelle) und fügen Sie sie dann auf den Boden der 6-Well-Platte hinzu, um Tröpfchen herzustellen. Verwenden Sie fünf Tröpfchen pro Well.
    HINWEIS: Der Schlüssel besteht darin, den Bereich der Pipettenpistole auf 50 μL einzustellen und einen EB zu saugen und dann auf den Betrieb von Abbildung 1E zu verweisen. Wenn sich der EB an der Bohrung der Pipettenspitze absetzt, berührt die Spitze schnell den Brunnenboden der Platte und drückt etwa 10 μL Flüssigkeit aus, um ein Tröpfchen zu bilden.
  6. Fügen Sie jedem Tropfen, der EB enthält, 15 μL der Membranmatrix hinzu und mischen Sie ihn schnell. Betten Sie den EB-Ball in die Mitte des Tröpfchens ein.
    HINWEIS: EBs dürfen nicht mit einer Standardpipettenspitze abgesaugt werden, die die EB beschädigt. Stattdessen muss die 200-μL-Breitrohr-Pipettenspitze verwendet werden.
  7. Legen Sie die 6-Well-Platte für 30 min in einen 37 ° C-Inkubator und erstarren Sie die Membranmatrixtröpfchen, die EBs enthalten.
  8. Fügen Sie 3 ml des Erweiterungsmediums zu jeder Vertiefung hinzu und blasen Sie die in die Matrix eingebetteten EBs vorsichtig auf, um sie zu suspendieren.
  9. 3 Tage bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
    HINWEIS: Wenn Knospen auf der Oberfläche von EB beobachtet werden, bedeutet dies, dass ein expandiertes Neuroepithel gebildet wurde16.

8. Organoidreifung (Tage 10-40)

  1. Entfernen Sie vorsichtig das ursprüngliche Medium und fügen Sie 3 ml Reifemedium (Ergänzende Tabelle 4) zu jeder Vertiefung hinzu.
  2. Legen Sie die Organoidplatte auf einen horizontalen Schüttler in einem 37 °C Inkubator.
  3. Fahren Sie fort, die Kultur horizontal zu drehen. Stellen Sie den Shaker auf die entsprechende Geschwindigkeit ein.
    HINWEIS: Bei der Kultivierung von zerebralen Organoiden auf einer 6-Well-Platte ist eine relative Zentrifugalkraft (RCF) von 0,11808 x g nach Angaben des Herstellers des horizontalen Schüttlers angemessener (siehe Materialtabelle). Gemäß der Umrechnung zwischen der relativen Fliehkraft und der Drehzahl17,18 ist RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm2, wobei RCF = relative Zentrifugalkraft (g), rpm = Umdrehungen pro Minute (r/min) und R = Rotationsradius (cm), auch als Schüttelwurf bezeichnet. Die Schüttelwurfparameter verschiedener Shaker können unterschiedlich sein. Daher kann geschätzt werden, dass die Drehzahl rpm = 299 x (RCF/R)1/2 beträgt.
  4. Wechseln Sie das frische Reifungsmedium alle 2-3 Tage.
  5. Nach 20-30 Tagen die zerebralen Organoide allmählich bis zur Reife kultivieren.
    HINWEIS: Während dieser Zeit können Organoide für Experimente und Nachweise verwendet werden, wie z.B. neuronale Markererkennung und Transkriptomsequenzierung 19,20,21.

9. Gefrorene Abschnitte und Immunfluoreszenz von zerebralen Organoiden

  1. Fixieren Sie die Organoide in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 16 h und waschen Sie sie dann 3x mit 1x PBS für jeweils 10 Minuten.
  2. Entfernen Sie das PBS und tauchen Sie die Organoide über Nacht bei 4 ° C in 30% Saccharose.
  3. Die Organoide in 10%/7,5% Gelatine/Saccharose bei 37 °C für 1 h einbetten und dann schnell in die Einbettform überführen.
  4. Fügen Sie Trockeneis zu 100% Ethanol hinzu, um eine Trockeneis- / Ethanolschlammung herzustellen, und legen Sie die Organoidproben zum schnellen Einfrieren hinein.
  5. Lagern Sie die gefrorenen Proben in einem −80 °C Gefrierschrank. Bei Bedarf machen Sie gefrorene Abschnitte mit einer Dicke von 20 μm.
  6. Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 5.3.-5.5. für Immunfluoreszenz. Verwenden Sie den PAX6-Antikörper, um apikale Vorläuferzellen zu markieren, den TUJ1-Antikörper (siehe Materialtabelle), um neuronale Zellen22,23,24 zu markieren, und DAPI für die Kern-DNA-Färbung.

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Ergebnisse

Die vorliegende Studie induzierte iPS-Zellen (Abbildung 2B) in zerebrale Organoide (Abbildung 2C). Die in der Frühphase kultivierten EBs drückten den OCT4-Marker aus (Abbildung 2A), der auf eine gute Pluripotenz hindeutete. Im späteren Stadium entwickelten sich die EBs zu reifen zerebralen Organoiden (Abbildung 2D). Die Forschung kultivierte iPS-Zellen von normal gesunden Personen und SCA3-Patienten zu ...

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Diskussion

Zerebrale Organoide eröffnen neue Wege für die medizinische Forschung. Viele nützliche Anwendungen dieser Technologie beginnen erst zu erforschen28. Diese Forschung ergab, dass die Ergebnisse der Transkriptomsequenzierung von genetisch kranken zerebralen Organoiden und normalen zerebralen Organoiden die Unterschiede zwischen Krankheit und Gesundheit widerspiegeln können. Zum Beispiel stimmen die Ergebnisse der RNA-seq-Datenanalyse (Abbildung 3B) mit vielen berichteten...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von der Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2020A0505100062), dem Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) und dem Guangzhou City Postdoctoral Research Grant Project (an Bangzhu Chen) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 μ m FilterNEST Biotechnology, China331001
1000 μ L Pipettenspitze mit breitem DurchgangThermo Fisher Scientific, USA9405163
200 μ L Pipettenspitze mit breiter BohrungThermo Fisher Scientific, USA9405020
2-MercaptoethanolMerck, Deutschland8057400005
4% ParaformaldehydServicebio, ChinaG1101
6-Well-Platte mit geringer AdhäsionNEST Biotechnology, China703011Es wird für EBs-Suspensionskulturen verwendet
Aaccute ZellablösungslösungSTEMCELL Technologies, Kanada07920Es wird verwendet, um iPSC in einzelne Zellen zu verdauen.
AggreWell800 24-Well-STEMCELLTechnologies, Kanada34811Mikroporöse Kulturplatte für die EBs-Vorbereitung.
Anti-Adhärenz-SpüllösungSTEMCELL Technologies, Kanada07010Spüllösung für Kulturgefäße zur Verhinderung der Zelladhäsion
B27-vit. Eine ErgänzungThermo Fisher Scientific, USA12587010
bFGFPeprotech, USAGMP100-18B
BSABeyotime Biotechnology, ChinaST025
ZentrifugeEppendorf, Deutschland5810 REs kann zum Zentrifugieren verschiedener Arten von Zentrifugenröhrchen, Reagenzflaschen und Arbeitsplatten verwendet werden.
DeckglasShitai Laboratory Equipment, China10212020C
DAPIBeyotime Biotechnology, ChinaC1002Wird für nukleare Färbungen verwendet. Nachdem DAPI mit doppelsträngiger DNA kombiniert wurde, betrug die maximale Anregungswellenlänge 364 nm und die maximale Emissionswellenlänge 454 nm.
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific, USA11330032
ES-Qualität FBSThermo Fisher Scientific, USA10270106
Ficoll PaqueGeneral Electric Company, USA17-5442-02Isolieren Sie die mononukleären Zellen des peripheren Blutes nach der Ficoll-Paque-Methode.
GelatineSangon Bioteach, ChinaA609764 Glutamax-Ergänzung
Thermo Fisher Scientific, USA35050061 Glutamax-Ergänzung
Thermo Fisher Scientific, USA17504044
Ziegen-Anti-Hühner-IgY  SekundärantikörperAbcam, UKab150171Ziege Anti-Hühner-IgG. Konjugation: Alexa Fluor 647. Bsp.: 652 nm, Em: 668 nm. Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden.
Ziegen-Anti-Maus-IgG-SekundärantikörperAbcam, UKab150120Ziegen-Anti-Maus-IgG. Konjugation: Alexa Fluor 594. Bsp.: 590 nm, Em: 617 nm. Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden.
Ziege Anti-Kaninchen IgG SekundärantikörperAbcam, UKab150077Ziege Anti-Kaninchen IgG. Konjugation: Alexa Fluor 488. Bsp.: 495 nm, Em: 519 nm. Bei einer Verdünnung von 1:500 verwenden.
HeparinMerck, DeutschlandH3149
HorizontalschüttlerServicebio, ChinaDS-H200Die relative Zentrifugalkraft (RCF) von 0,11808 x g ist laut Hersteller INFORS HT (Schweiz) besser geeignet.
InsulinMerck, DeutschlandI9278-5ML
KOSRThermo Fisher Scientific, USA10828028
MatrigelCorning, USA354277Matrigel verfestigt sich in der Umgebung über 4 & Grad; C, daher sollte es bei niedriger Temperatur unterverpackt werden.
MEM-NEAAThermo Fisher Scientific, USA11140050
mTeSR1STEMCELL Technologies, Kanada85850iPSC-Kulturmedium
N2-ErgänzungThermo Fisher Scientific, USA17502048
NeurobasalThermo Fisher Scientific, USA21103049
OCT4 PrimärantikörperAbcam, UKab19857Gastgeber: Hase. Auflösen mit 500 μ L PBS. Bei einer Verdünnung von 1:200 verwenden.
Pathologischer Gefrier-SlicerLeica, DeutschlandLeica CM1860
PAX6 PrimärantikörperAbcam, UKab78545Wirt: Maus. Bei einer Verdünnung von 1:100 verwenden.
PBSSTEMCELL Technologies, Kanada37350
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific, USA15140122
PSC-DissoziationslösungBeijing Saibei Biotechnology, ChinaCA3001500Enzymfreie Dissoziationslösung kann für den Verdau und die Passage von iPSCs verwendet werden.
Sendai Reprogramming KitThermo Fisher Scientific, USAA16518Etablieren Sie iPSC gemäß dem Protokoll des Sendai Reprogramming Kit.
Slide GlassShitai Laboratory Equipment, China188105W
Softlight-LampeNUTNUT NUT Eineinfaches selbstgebautes Gerät, siehe ergänzende Abbildung 2 zur Vorbereitung.
STEMdiff Cerebral Organoid KitSTEMCELL Technologies, Kanada8570enthalten: 1. EB-Bildungsmedium; 2. Induktionsmedium; 3. Expansionsmedium; 4. Reifemedium.
STEMdiff Cerebral Organoid MaturationKit STEMCELL Technologies, Kanada8571Reifungsmedium
SaccharoseSangon Bioteach, ChinaA502792
Triton X-100Merck, DeutschlandX100
TUJ1 PrimärantikörperAbcam, UKab41489Wirt: Huhn. Bei einer Verdünnung von 1:1000 verwenden.
VaselineSangon Bioteach, ChinaA510146
Y-27632STEMCELL Technologies, Kanada72302Bereiten Sie eine 5 mM Stammlösung in PBS vor, resuspendieren Sie 1 mg in 624 & micro; L von PBS.
Weblink
RohsequenzierungsdatenGenome Sequence Archive (Genomik, Proteomik & Bioinformatik 2021) im National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy ofSciences GSA-Human: HRA002430https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/

Referenzen

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  2. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
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