Summary
Zerebrale Organoide bieten beispiellose Möglichkeiten zur Untersuchung der Organentwicklung und der Pathologie menschlicher Krankheiten. Obwohl mit zerebralen Organoid-Kultursystemen große Erfolge erzielt wurden, gibt es immer noch operative Schwierigkeiten bei der Anwendung dieser Technologie. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein zerebrales Organoidverfahren, das den Mediumswechsel und den Organoidtransfer erleichtert.
Abstract
Gegenwärtig ist die Technologie der zerebralen Organoidkultur noch kompliziert zu bedienen und in großem Maßstab schwer anzuwenden. Es ist notwendig, eine einfache und praktische Lösung zu finden. Daher wird in der vorliegenden Studie ein praktikables zerebrales Organoidprotokoll vorgeschlagen. Um die unvermeidbaren Unannehmlichkeiten beim Medienwechsel und Organoidtransfer in der Frühphase zu lösen, optimiert die aktuelle Forschung die Betriebstechnik durch Anwendung des Engineering-Prinzips. Eine Soft-Light-Lampe wurde verwendet, um die Proben des embryonalen Körpers (EB) seitlich zu beleuchten, so dass die EBs durch den verstärkten diffusen Reflexionseffekt mit bloßem Auge gesehen werden können. Unter Verwendung des Prinzips der durch Rotation erzeugten Sekundärströmung sammeln sich die Organoide in Richtung der Mitte des Bohrlochs, was die Durchführung eines Mediumwechsels oder Organoidtransfers erleichtert. Im Vergleich zur zerstreuten Zelle setzt sich der embryonale Körper schneller in der Pipette ab. Mit diesem Phänomen können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente auf einfache Weise effektiv entfernt werden, wodurch verhindert wird, dass EBs durch die Zentrifugation beschädigt werden. Diese Studie erleichtert die Operation der zerebralen Organoidkultur und hilft, die Anwendung von Gehirnorganoiden zu fördern.
Introduction
Im Vergleich zu zweidimensionalen (2D) Kultursystemen haben dreidimensionale (3D) Kultursysteme mehrere Vorteile, darunter die echte Replikation und effiziente Reproduktion komplexer Strukturen bestimmter Organe1. Daher sind zerebrale Organoide eine der wichtigen Hilfsmethoden für die Forschungsfelder Entwicklung des menschlichen Gehirns und Krankheit2, Wirkstoffscreening und Zelltherapie.
Die Kultivierung zerebraler Organoide durch die rotierende Suspensionsmethode ist förderlich für ihre Entwicklung und Reifung3. Obwohl zerebrale Organoid-Kultursysteme große Erfolge erzielt haben, stehen sie immer noch vor kritischen Herausforderungen, die ihre Anwendung einschränken. Beispielsweise ist die manuelle Kultivierung mit komplizierten Manipulationsschritten verbunden und stellt Hindernisse für die Erzielung großflächiger Anwendungen dar. Darüber hinaus sind in jedem Entwicklungsstadium der Kultur der zerebralen Organoide Veränderungen in verschiedenen Medien und Zytokinen erforderlich4. Im Frühstadium haben die Organoide oder EBs jedoch winzige Größen (ca. 200 μm bis 300 μm) und sind ohne entsprechende Apparatur visuell nahezu unzugänglich. Zwangsläufig wird eine gewisse Menge wertvoller Organoidproben weggespült, wenn das Medium gewechselt wird. Viele Techniken wurden erforscht, um dies in anderen Arten von Organoidkulturen zu überwinden, und einige Beispiele umfassen das Eintauchen ganzer Organoidchips in ein Kulturmedium für 3 Tage ohne Intervention5; Hinzufügen eines frischen Mediums durch das Deckglas, nachdem das alte Medium mit saugfähigem Papierabsorbiert wurde 5; oder die Anwendung komplexer mikrofluidischer Rohrleitungen für den Flüssigkeitsaustausch 6,7,8. Ein weiteres Hindernis, das im frühen Stadium der Organoidkultivierung auftritt, ist die Schwierigkeit, direkte Beobachtungen mit bloßem Auge zu erreichen, was zu schlechten Operationen führen kann, die zu Organoidschäden und -verlusten während der Organoidtransferschritte führen. Daher ist es notwendig, ein praktikableres Protokoll zu etablieren, das den Mediumswechsel und die Organoidübertragung zur Erzeugung von Organoiden erleichtert.
Um diese Probleme zu überwinden, wird ein entsprechend optimierter Betrieb auf der Grundlage von Engineering-Prinzipien vorgeschlagen, der viele Organoid-Verfahren erheblich und bequem erleichtert. Wenn in der Natur die Sonne durch einen Fensterspalt in ein Haus scheint, kann das bloße Auge den Staub sehen, der im Lichtstrahl tanzt. Aufgrund der diffusen Reflexion von Sonnenlicht auf Staub wird etwas Licht in den Augapfel gebrochen, um ein visuelles Bild zu erzeugen. Inspiriert vom Prinzip dieses Phänomens 9,10 machte diese Studie eine weiche Lichtlampe und beleuchtete die EBs seitlich. Es wurde festgestellt, dass EBs visuell klar sein können, ohne den Betrachtungsumfang zu beeinträchtigen. Eine zum Zentrum zeigende Sekundärströmung wird in der Flüssigkeit erzeugt, indem die Kulturplatte aufgrund von Wirbelströmen11 gedreht wird. Ursprünglich verstreute EBs sammeln sich in der Mitte der Platte an. Auf dieser Grundlage und dem Phänomen, dass die Sedimentationsgeschwindigkeit von Organoiden schneller ist als die von Zellen, wird eine einfache Operationsmethode des Mittelwechsels und des Organoidtransfers ohne Zentrifugation vorgeschlagen. Die Organoide im Kulturmedium können durch diesen Transfervorgang effektiv von freien Zellen und toten Zellfragmenten getrennt werden.
Hier wird ein Protokoll vorgeschlagen, das einfach zu bedienen ist, um zerebrale Organoide aus humanen pluripotenten Stammzellen zu erzeugen. Die Betriebstechnologie wurde durch die Anwendung des Engineering-Prinzips optimiert, wodurch Operationen in der 3D-Kultur so einfach und machbar wie in der 2D-Kultur wurden. Die verbesserte Flüssigkeitsaustauschmethode und der Organoidtransferbetrieb sind auch für andere Arten von Organoidkulturen und das Design von automatischen Kulturmaschinen hilfreich.
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Protocol
Das Protokoll wurde im Anschluss an die Erklärung von Helsinki durchgeführt. Die Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Dritten angeschlossenen Krankenhauses der Guangzhou Medical University erteilt (Medizinische und ethische Überprüfung [2021] Nr. 022). Vor dem Experiment wurde jedes Medium nach Jürgen A. Knoblichs Formel12 (Ergänzende Tabellen 1-4) hergestellt oder ein kommerziell erhältliches Cerebral Organoid Kit verwendet (siehe Materialtabelle). Die in dieser Studie verwendeten iPSCs wurden zuvor von unserem Labor festgelegt und haben eine informierte Ausnahme erhalten. Die SCA3-iPS-Zellen wurden von einer 31-jährigen weiblichen spinozerebellären Ataxie-Typ-3-Patientin (SCA3) generiert, die als 26/78-CAG-Wiederholungen im ATXN3-Gen13 genotypisiert wurde (Ergänzende Abbildung 1A). Die in einem früheren Artikel erwähnten normalen menschlichen iPSCs wurden als NC-iPSCs 14 ausgewählt, und das ATXN3-Gen wurde mit 14/14 CAG-Wiederholungen identifiziert (Ergänzende Abbildung 1B).
1. Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)
- Sammeln Sie 3 ml peripheres Blut durch Venenpunktion mit der informierten Zustimmung von Freiwilligen und Patienten.
- Isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen nach der Ficoll-Paque-Methode15.
- Richten Sie iPSCs gemäß dem Protokoll des Sendai Reprogramming Kit ein (siehe Materialverzeichnis).
- Kultivieren Sie die iPSCs mit mTeSR1-Medium in 35 mm Petrischale, die mit Matrigel (einer Basalmembranmatrix, siehe Materialtabelle) bedeckt sind. Wechseln Sie das Medium jeden Tag. Die iPSC-Wachstumsdichte darf 75% nicht überschreiten.
- Verdauen Sie die Zellen mit PSC-Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle) und subkulturieren Sie sie alle 3-5 Tage im Verhältnis 1:5.
ACHTUNG: Sendai-Virus wird hier verwendet. Es muss in der Biosicherheitskabine betrieben werden, und es müssen Selbstschutzmaßnahmen ergriffen werden. Es sollte klar sein, ob es im lokalen Land legal verwendet werden kann. Lokale Gesetze und Vorschriften zur biologischen Sicherheit müssen bei der Anwendung strikt befolgt werden.
2. EB-Vorbereitung (Tage 0-1)
- Entfernen Sie das mTeSR1-Medium mit einer Pipette aus den iPSCs und waschen Sie es 2x mit 1 ml 1x PBS.
- Entfernen Sie das PBS mit einer Pipette und fügen Sie 300 μL Zellablösungslösung hinzu (siehe Materialtabelle), um die iPSCs für 3-4 min bei 37 °C in einzelne Zellen zu verdauen.
- Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml EB-Bildungsmedium (Ergänzende Tabelle 1) und zentrifugieren Sie die Probe dann für 5 min bei 300 x g (Raumtemperatur).
- Behandeln Sie die spezielle 24-Well-Platte 5 Minuten lang mit Anti-Adhärenz-Spüllösung (500 μL / Well) vor (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Anti-Adhärenz-Spüllösung ist für eine optimale EB- und Sphäroidbildung unerlässlich. - Resuspendieren Sie die Zellen in EB-Bildungsmedium, das Y-27632 enthält (Endkonzentration, 10 μM, siehe Materialtabelle), mit einer Zelldichte von 1,5 x 106 Zellen/ml.
- Entfernen Sie die Anti-Adhärenz-Spüllösung und spülen Sie jede gut mit 2 ml EB-Bildungsmedium ab.
- Fügen Sie die Zellen zu den spezialisierten 24-Well-Platten mit einer Dichte von 3 x 106 Zellen/Well hinzu (Abbildung 1A, links).
HINWEIS: Normalerweise können in jedem Brunnen 300 EBs zubereitet werden. Diese Methode kann große Mengen von EBs der gleichen Größe vorbereiten. - Zentrieren Sie die Platte bei 100 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Verteilen Sie die Zellen in jeder Kammer gleichmäßig am unteren Rand der Platte (Abbildung 1A, rechts).
HINWEIS: Wenn es keine geeignete Zentrifuge gibt, kann die Platte auch direkt in den Inkubator für statische Kultur gelegt werden, aber die Formationszeit der EB-Kugel wird einige Stunden später sein als die unter normaler Zentrifugation. - Die Proben werden bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h inkubiert. Wenn im vorherigen Schritt keine Zentrifugation verwendet wurde, 36 h inkubieren. Halten Sie die Probe ruhig und nehmen Sie sie während dieser Zeit nicht aus dem Inkubator.
3. Vorbereitung der Soft-Light-Lampe (Tag 1)
- Verwenden Sie eine transparente Acrylplatte mit einer Dicke von 0,3-0,5 cm in der Größe von A5-Papier. Kleben Sie weiße Pads auf die Vorder- und Rückseite der Acrylplatte.
- Installieren Sie eine Reihe von LED-Weißleuchten am Rand der Platte, so dass die Lichter von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können (Ergänzende Abbildung 2A-F, Abbildung 1B).
HINWEIS: Da die Durchmesser von EBs im Frühstadium etwa 200 μm bis 300 μm betragen, ist es schwierig, sie mit bloßem Auge unter der Leuchtstofflampe sauberer Bänke deutlich zu beobachten. Im Gegensatz dazu können wir aufgrund der Verstärkung der diffusen Reflexion die EBs deutlich erkennen, indem wir seitlich beleuchtetes weiches Licht verwenden (Abbildung 1B, C). Eine 6-Well-Platte wird für EB-Kulturen in nachfolgenden Experimenten empfohlen. Um jedoch die visuelle Wirkung von weichem Licht besser zu zeigen, wird in dieser Studie manchmal Geschirr verwendet, um Bilder und Videos anstelle von Tellern aufzunehmen, also bitte nicht falsch verstehen. Die seitlich beleuchtete Weichlichtlampe kann auch für die 6-Well-Platte verwendet werden.
- Installieren Sie eine Reihe von LED-Weißleuchten am Rand der Platte, so dass die Lichter von der Seite der Acrylplatte eintreten und dann parallel herausschießen können (Ergänzende Abbildung 2A-F, Abbildung 1B).
4. EB-Übertragung und mittlerer Austausch (Tage 2-5)
- Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung vor und fügen Sie jedem Bohrloch 2 ml EB-Formationsmedium hinzu.
- Entfernen Sie die EBs zusammen mit dem Medium mit einer 1000 μL Breitrohr-Pipettenspitze (siehe Materialtabelle) und übertragen Sie sie auf die 6-Well Low Adhäsion Platte (~100 EBs/Well).
HINWEIS: Der Betriebsprozess verwendet eine Weichlichtlampe (in Schritt 3 erwähnt), um die Beobachtung der EBs zu erleichtern. Schalten Sie andere Innenlichtquellen aus, um den visuellen Effekt des weichen Lichts besser zu erzielen. - Jeden Tag durch die gleiche Menge an frischem EB-Formationsmedium ersetzen. Verwenden Sie den sekundären Fluss, um die EBs in der Mitte zu sammeln und das Medium zu wechseln.
- Saugen Sie das alte Medium ab, indem Sie langsam an den Rand des Brunnens pipettieren. Nicht zu stark saugen; Andernfalls werden die EBs zusammen entfernt. Fügen Sie dann frisches Medium hinzu, um die EBs wieder anzuhalten.
HINWEIS: Der prinzipielle Sekundärfluss (Abbildung 1D). Induzieren Sie einen Drallfluss, indem Sie die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn drehen. Aufgrund der Drallströmung wird eine sekundäre Strömung induziert, die auf das Zentrum gerichtet ist. Die EBs oder Organoide konvergieren aufgrund des durch Rotation erzeugten Sekundärflusses zum Zentrum des Bohrlochs, wonach der Mittelwechsel oder der Embryodentransfer leicht durchgeführt werden können.
- Saugen Sie das alte Medium ab, indem Sie langsam an den Rand des Brunnens pipettieren. Nicht zu stark saugen; Andernfalls werden die EBs zusammen entfernt. Fügen Sie dann frisches Medium hinzu, um die EBs wieder anzuhalten.
5. Überprüfung der Pluripotenz durch Etikettierung mit Pluripotenzmarker OCT4 (Tag 4)
HINWEIS: Wenn der Durchmesser der EBs größer als 300 μm ist, nehmen Sie mehrere EBs für die OCT4-Marker-Immunfluoreszenzfärbung, um ihre Pluripotenz zu erkennen.
- Fixieren Sie die EBs in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 30 min, gefolgt von 1x PBS 3x für 10 min jedes Mal.
- Übertragen Sie die EBs auf Raumtemperatur PBS mit 0,3% Triton X-100 und 3% BSA für 2 h, gefolgt von Waschen in PBS 3x für jeweils 10 Minuten.
HINWEIS: Nach der Behandlung mit Triton X-100 schwimmen die EBs auf der Flüssigkeitsoberfläche und können während der Reinigung leicht mit der Flüssigkeit abgesaugt werden. Eine Operation unter einem Stereomikroskop wird empfohlen. - Verdünnen Sie den primären Antikörper OCT4 (siehe Materialtabelle) mit 1 ml 1x PBS, das 1% BSA enthält, in einem Verhältnis von 1:200 und fügen Sie den EBs für die Inkubation bei 4 °C über Nacht hinzu, dann waschen Sie in PBS 3x für jedes Mal 10 Minuten.
- Verdünnen Sie den jeweiligen Sekundärantikörper (siehe Materialtabelle) mit 1x PBS bei 1:500 und geben Sie 1 ml zu den EBs.
- Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Stunden waschen Sie die Zellen in 1x PBS 3x für jeweils 10 Minuten.
- Entfernen Sie das PBS, fügen Sie 2 ml 1x PBS-Lösung hinzu, die 1 μg / ml DAPI enthält, inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten und waschen Sie dann PBS 3x für jedes Mal für 10 Minuten.
- Bewegen Sie den EB mit einer kleinen Menge Flüssigkeit auf den Objektträger, versiegeln Sie den Objektträger mit einem Deckglas, das mit handelsüblichem Vaseline (siehe Materialtabelle) am Rand beschichtet ist, und beobachten und sammeln Sie das Bild dann unter dem Fluoreszenz-Konfokalmikroskop.
HINWEIS: Der OCT4-Ausdruck steht für EB-Pluripotenz12. Wenn der Ausdruck von OCT4 weniger als 90% beträgt, sollten die EBs verworfen werden, und EBs sollten erneut vorbereitet werden.
6. Neuronale Induktion (Tage 5-7)
- Bereiten Sie eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung vor und fügen Sie 3 ml neuronales Induktionsmedium (Ergänzende Tabelle 2) zu jeder Vertiefung hinzu.
- Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein (in Schritt 3 erwähnt) und schalten Sie andere Innenlichtquellen aus.
- Übertragen Sie die EBs auf die 6-Well-Platte mit zugesetztem neuronalem Induktionsmedium (~ 100 EBs / Well). Fügen Sie dem neuen Brunnen so wenig wie möglich vom ursprünglichen Medium hinzu.
HINWEIS: Führen Sie einfache Fähigkeiten des Organoid-Transfers ein. Natürlich sinken die resuspendierten EBs unter Schwerkraft und mit einer relativ höheren Dichte als das Medium allmählich ab, indem sie die in Abbildung 1E gezeigte Operation anwenden. Somit können die EBs bequem übertragen werden. Da freie Zellen und abgestorbene Zellfragmente im Vergleich zu EBs langsamer absinken, können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente durch diese Sedimentationsmethode entfernt werden (Abbildung 1F). - Die Proben werden bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h inkubiert.
HINWEIS: Unter dem Mikroskop betrug der Durchmesser der EBs ungefähr 500 μm und der Rand war durchscheinend, was darauf hindeutet, dass sich eine neuroepitheliale Schicht gebildet hat. - Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
7. Einbettung in die Basalmembranmatrix (Tage 7-10)
- Legen Sie die Membranmatrix 60 Minuten im Voraus in einen 4 ° C-Kühlschrank, um sich aufzulösen. Berechnen Sie die Menge der benötigten Matrix im Voraus. Etwa 100 EBs wurden in 1,5 ml der Membranmatrix eingebettet.
- Schalten Sie das seitliche weiche Licht ein und schalten Sie die Lichtquelle auf der Oberseite der Konsole aus.
- Halten Sie die Membranmatrix auf Eis, um eine Erstarrung zu verhindern.
- Geben Sie jedes Mal eine kleine Menge EBs in eine 60-mm-Schale mit frischem Expansionsmedium (Ergänzende Tabelle 3). Reduzieren Sie die Anzahl der EBs, um das Entfernen eines einzelnen EBs zu erleichtern.
- Verwenden Sie dann eine neue 6-Well-Platte mit geringer Haftung. Saugen Sie jedes Mal eine einzelne EB (mit ca. 10 μL Medium) mit einer 200 μL Breitrohr-Pipettenspitze (siehe Materialtabelle) und fügen Sie sie dann auf den Boden der 6-Well-Platte hinzu, um Tröpfchen herzustellen. Verwenden Sie fünf Tröpfchen pro Well.
HINWEIS: Der Schlüssel besteht darin, den Bereich der Pipettenpistole auf 50 μL einzustellen und einen EB zu saugen und dann auf den Betrieb von Abbildung 1E zu verweisen. Wenn sich der EB an der Bohrung der Pipettenspitze absetzt, berührt die Spitze schnell den Brunnenboden der Platte und drückt etwa 10 μL Flüssigkeit aus, um ein Tröpfchen zu bilden. - Fügen Sie jedem Tropfen, der EB enthält, 15 μL der Membranmatrix hinzu und mischen Sie ihn schnell. Betten Sie den EB-Ball in die Mitte des Tröpfchens ein.
HINWEIS: EBs dürfen nicht mit einer Standardpipettenspitze abgesaugt werden, die die EB beschädigt. Stattdessen muss die 200-μL-Breitrohr-Pipettenspitze verwendet werden. - Legen Sie die 6-Well-Platte für 30 min in einen 37 ° C-Inkubator und erstarren Sie die Membranmatrixtröpfchen, die EBs enthalten.
- Fügen Sie 3 ml des Erweiterungsmediums zu jeder Vertiefung hinzu und blasen Sie die in die Matrix eingebetteten EBs vorsichtig auf, um sie zu suspendieren.
- 3 Tage bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
HINWEIS: Wenn Knospen auf der Oberfläche von EB beobachtet werden, bedeutet dies, dass ein expandiertes Neuroepithel gebildet wurde16.
8. Organoidreifung (Tage 10-40)
- Entfernen Sie vorsichtig das ursprüngliche Medium und fügen Sie 3 ml Reifemedium (Ergänzende Tabelle 4) zu jeder Vertiefung hinzu.
- Legen Sie die Organoidplatte auf einen horizontalen Schüttler in einem 37 °C Inkubator.
- Fahren Sie fort, die Kultur horizontal zu drehen. Stellen Sie den Shaker auf die entsprechende Geschwindigkeit ein.
HINWEIS: Bei der Kultivierung von zerebralen Organoiden auf einer 6-Well-Platte ist eine relative Zentrifugalkraft (RCF) von 0,11808 x g nach Angaben des Herstellers des horizontalen Schüttlers angemessener (siehe Materialtabelle). Gemäß der Umrechnung zwischen der relativen Fliehkraft und der Drehzahl17,18 ist RCF = 1.118 x 10−5 × R × rpm2, wobei RCF = relative Zentrifugalkraft (g), rpm = Umdrehungen pro Minute (r/min) und R = Rotationsradius (cm), auch als Schüttelwurf bezeichnet. Die Schüttelwurfparameter verschiedener Shaker können unterschiedlich sein. Daher kann geschätzt werden, dass die Drehzahl rpm = 299 x (RCF/R)1/2 beträgt. - Wechseln Sie das frische Reifungsmedium alle 2-3 Tage.
- Nach 20-30 Tagen die zerebralen Organoide allmählich bis zur Reife kultivieren.
HINWEIS: Während dieser Zeit können Organoide für Experimente und Nachweise verwendet werden, wie z.B. neuronale Markererkennung und Transkriptomsequenzierung 19,20,21.
9. Gefrorene Abschnitte und Immunfluoreszenz von zerebralen Organoiden
- Fixieren Sie die Organoide in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 16 h und waschen Sie sie dann 3x mit 1x PBS für jeweils 10 Minuten.
- Entfernen Sie das PBS und tauchen Sie die Organoide über Nacht bei 4 ° C in 30% Saccharose.
- Die Organoide in 10%/7,5% Gelatine/Saccharose bei 37 °C für 1 h einbetten und dann schnell in die Einbettform überführen.
- Fügen Sie Trockeneis zu 100% Ethanol hinzu, um eine Trockeneis- / Ethanolschlammung herzustellen, und legen Sie die Organoidproben zum schnellen Einfrieren hinein.
- Lagern Sie die gefrorenen Proben in einem −80 °C Gefrierschrank. Bei Bedarf machen Sie gefrorene Abschnitte mit einer Dicke von 20 μm.
- Weitere Informationen finden Sie in den Schritten 5.3.-5.5. für Immunfluoreszenz. Verwenden Sie den PAX6-Antikörper, um apikale Vorläuferzellen zu markieren, den TUJ1-Antikörper (siehe Materialtabelle), um neuronale Zellen22,23,24 zu markieren, und DAPI für die Kern-DNA-Färbung.
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Representative Results
Die vorliegende Studie induzierte iPS-Zellen (Abbildung 2B) in zerebrale Organoide (Abbildung 2C). Die in der Frühphase kultivierten EBs drückten den OCT4-Marker aus (Abbildung 2A), der auf eine gute Pluripotenz hindeutete. Im späteren Stadium entwickelten sich die EBs zu reifen zerebralen Organoiden (Abbildung 2D). Die Forschung kultivierte iPS-Zellen von normal gesunden Personen und SCA3-Patienten zu zerebralen Organoiden (Abbildung 3A). SCA3, auch bekannt als Machado-Joseph-Krankheit (MJD), ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch eine Polyglutaminexpansion im ATXN3-Gen25 verursacht wird. Die RNA-seq-Daten (hochgeladen in ein öffentliches Repositorium, siehe Materialverzeichnis) zeigten signifikante Unterschiede in den Genexpressionsprofilen zwischen der normalen zerebralen Organoidgruppe und der SCA3-zerebralen Organoidgruppe in Signalwegen wie Neurotransmittertransport, Synapsenbildung und Regulation (Abbildung 3B). Manschettenknöpfe-Software wurde verwendet, um das Genexpressionsniveau und die Differenz26 zu berechnen. DEseq2 wurde weiter verwendet, um die Daten27 zu analysieren.
Abbildung 1: Optimierte Mittelwechsel- und Übertragungsvorgänge von EBs . (A) EB-Vorbereitung. Die iPSCs wurden verdaut und zu den spezialisierten 24-Well-Platten hinzugefügt (links). Die Zellen bildeten EBs (rechts). Der Skalenbalken beträgt 400 μm. (B) Schematische Darstellung von seitlich beleuchtetem weichem Licht zur Unterstützung der Beobachtung von Organoiden. (C) Die EBs wurden mit verschiedenen Lichtquellen beobachtet. Gelber Pfeil: seitlich beleuchtetes Licht; roter Pfeil: dunkler Hintergrund; grüne Pfeile: EBs. (D) Eine Drallströmung wird induziert, indem die Schale entlang einer kreisförmigen Umlaufbahn gedreht wird. Durch die Drallströmung wird eine auf das Zentrum gerichtete Sekundärströmung induziert. Die EBs konvergieren zum Zentrum der Schale, angetrieben durch den durch Rotation erzeugten Sekundärfluss. Weiße Pfeile: EBs. (E) Organoid-Transfer. (I) Erstens wird eine großmaulige Pipettenspitze verwendet, um die Mischungslösung aufzusaugen, einschließlich der EBs und des Kulturmediums. (II) Dann, während die Pipette aufrecht gehalten wird, sinken die EBs allmählich unter den Schwerkrafteffekt und konvergieren zur Mündung der Pipettenspitze. (III) Da die Mündung der Pipettenspitze die flüssige (normalerweise das frische Medium) Oberfläche wieder berührt und aufgrund der Oberflächenspannung der Flüssigkeit (IV) die EBs schnell in das Medium sinken (kein zusätzliches Ausblasen durch manuelles Pipettieren erforderlich). Rote Linie: der Flüssigkeitsstand; gelbe Pfeile: EBs. (F) Da freie Zellen und abgestorbene Zellfragmente langsamer absinken als EBs, können die meisten freien Zellen und toten Zellfragmente durch die oben beschriebene Sedimentationsmethode entfernt werden, um den Embryodentransfer zu erleichtern. Der rote Kasten in der oberen rechten Ecke ist ein vergrößertes Bild. Der Maßstabsbalken beträgt 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Induktion von iPS-Zellen in zerebrale Organoide . (A) Immunfluoreszenzfärbung von EBs. OCT4: Oktamerbindungs-Transkriptionsfaktor-4; DAPI: DAPI-Dihydrochlorid. Der Skalenbalken beträgt 100 μm. (B) iPSCs. Der Skalenbalken beträgt 400 μm. (C) Zerebrale Organoide. Der Skalenbalken beträgt 200 μm. (D) Immunfluoreszenzfärbung von zerebralen Organoiden. PAX6: gepaarte Box 6 ist der Marker von apikalen Vorläuferzellen; TUJ1: Neuronen-spezifische Klasse III β-Tubulin ist ein neuronenspezifischer Marker. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Kultivierung von iPS-Zellen von gesunden Personen und SCA3-Patienten zu zerebralen Organoiden. (A) Verschiedene Stadien, die die Reifung von zerebralen Organoiden ab EBs abdecken. NC: normale Gruppe; SCA3: SCA3/MJD-Gruppe. Die Maßstäbe von Bildern mit niedriger und hoher Vergrößerung betragen 400 μm bzw. 200 μm. (B) GO-Anreicherungsanalyse-Diagramm von herunterregulierten, differentiell exprimierten Genen zwischen normalen Organoiden und SCA3-Organoiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Identifizierung von ATXN3-CAG-Wiederholungen durch Kapillarelektrophorese. (A) Bei dem SCA3-Patienten iPSC (SCA3-iPSC) wurde festgestellt, dass er 26/78 CAG-Wiederholungen im ATXN3-Gen aufweist. (B) Der normale menschliche iPSC (NC-iPSC) wurde mit 14/14 CAG-Wiederholungen im ATXN3-Gen identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Vorbereitung der Weichlichtlampe. (A) Das Netzteil und die LED-Leuchten wurden auf einer Seite der Acrylplatte installiert (wie in der rot gepunkteten Box gezeigt). Die Streuwellenlänge der LED-Weichlichtlampe beträgt 450-470 nm, der Lichtstrom 1300-1800 lm und der Farbwiedergabeindex 75-85 Ra. (B) Es wurde geprüft, ob die LED-Lampen normal leuchten können (wie im rot gepunkteten Kasten gezeigt). (C) Auf der Vorder- und Rückseite der Acrylplatte wurde ein weißes Pad angebracht (wie durch die roten Pfeile angezeigt). (D) Das Gesamtbild der Lampe mit weichem Licht. (E) Die Soft-Light-Lampe kann auch durch ein handelsübliches LED-Lackierlichtpad ohne Rahmen ersetzt werden, das normalerweise zum Tracking beim Kopieren von Skizzen verwendet wird. Eine Schicht weißer Folie muss direkt über das LED-Lackierlichtpad geklebt werden. f) Die weiche Lichtlampe bei der Arbeit. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung des EB-Bildungsmediums. In der Anfangsphase der EB-Bildung (in der Regel die ersten 2 Tage) müssen Y-27632 (50 μM) und bFGF (4 ng/ml) dem EB-Bildungsmedium hinzugefügt werden. Das Medium muss mit einer 0,2 μm Filtereinheit gefiltert und bei −20 °C gelagert werden . Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Zusammensetzung des neuronalen Induktionsmediums. Das Medium muss mit einer 0,2 μm Filtereinheit gefiltert und bei −20 °C gelagert werden . Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Zusammensetzung des Expansionsmediums. Eine 1:100-Verdünnung von 2-Mercaptoethanol wurde in DMEM-F12 hergestellt, und 87,5 μL davon wurden dem Expansionsmedium zugesetzt. B27 darf kein Vitamin A enthalten. Das Medium muss mit einer 0,2 μm Filtereinheit gefiltert und bei −20 °C gelagert werden . Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 4: Zusammensetzung des Reifemediums. Eine 1:100-Verdünnung von 2-Mercaptoethanol in DMEM-F12 wurde hergestellt und 87,5 μL davon wurden dem Reifungsmedium zugegeben. B27 darf kein Vitamin A enthalten. Das Medium muss mit einer 0,2 μm Filtereinheit gefiltert und bei −20 °C gelagert werden . Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Zerebrale Organoide eröffnen neue Wege für die medizinische Forschung. Viele nützliche Anwendungen dieser Technologie beginnen erst zu erforschen28. Diese Forschung ergab, dass die Ergebnisse der Transkriptomsequenzierung von genetisch kranken zerebralen Organoiden und normalen zerebralen Organoiden die Unterschiede zwischen Krankheit und Gesundheit widerspiegeln können. Zum Beispiel stimmen die Ergebnisse der RNA-seq-Datenanalyse (Abbildung 3B) mit vielen berichteten Studien zu SCA3-Erkrankungenüberein 29,30,31,32. Experimentelle Operationen wie Medium Change, EB-Transfer und Wrapping sind entscheidend für die Kultivierung von zerebralen Organoiden und die Bestimmung, ob Organoide mit guter Gleichmäßigkeit hergestellt werden können33,34. In dieser Studie wird ein zerebrales Organoidprotokoll eingeführt, das den Mediumswechsel und den Organoidtransfer erleichtert. Eine seitliche Weichlichtlampe kann den Betrieb der Organoidkultur erheblich unterstützen. Es ist jedoch nicht schwer zu machen, das LED-Lackierlichtpad und die einfache Verarbeitung können es auch ersetzen. Die einfache Flüssigkeitsaustauschmethode und der Organoidtransfer erleichtern den gesamten Kulturprozess. Die Anwendung von zerebralen Organoiden wird oft durch das Problem der schlechten Gleichmäßigkeitbeeinflusst 35. Der größte Unterschied zwischen dieser Studie und anderen Richtlinien für zerebrale Organoidkulturen besteht darin, dass der Fokus auf der Optimierung der Operation liegt, um das Experiment wiederholbarer zu machen.
Es ist sehr wichtig, die Stabilität des Kultursystems zu erhalten. Wenn die Bedingungen es erlauben, wird empfohlen, das kommerzielle zerebrale Organoidmedium zu priorisieren, was die großen Unterschiede in den experimentellen Ergebnissen in verschiedenen Chargen aufgrund der Instabilität des Mediums effektiv reduzieren kann. Darüber hinaus sollte die Lagerung des zerebralen Organoidmediums bei 4 °C nicht länger als 2 Wochen dauern; Andernfalls wird es die Stabilität des Kultursystems beeinträchtigen. Natürlich ist es auch wichtig sicherzustellen, dass die verwendeten iPSCs pluripotent und nicht differenziert sind. OCT4 Immunfluoreszenzdetektion kann verwendet werden. Wenn OCT4-positive Zellen weniger als 90% sind, wird empfohlen, sie wieder durch hochwertigere iPS-Zellen und zerebrale Organoide zu ersetzen.
Es gibt einige Einschränkungen in der zerebralen Organoidkulturtechnologie, die in dieser Studie eingeführt wurde. Zum Beispiel können zerebrale Organoide im späteren Entwicklungsstadium nicht intensiv kultiviert werden, was eine Verschwendung von Kulturraum ist. Dies ist auch ein dringendes Problem, das bei der Anwendung von zerebralen Organoiden gelöst werden muss. Wenn viele zerebrale Organoide eine hohle Expansion aufweisen, wird die Anzahl der Organoide in jedem Bohrloch reduziert, die mittlere Austauschfrequenz nimmt zu und die Organoide befinden sich in einem nichthypoxischen Zustand mit ausreichenden Nährstoffen.
Diese Studie ist eine operative Ergänzung zu vielen bestehenden zerebralen Organoid-Kulturmethoden 12,36,37 und sogar anderen Arten von Organkulturmethoden38,39. Dies wird dazu beitragen, in Zukunft automatisierte Organoid-Kultursysteme zu entwickeln und die Erforschung und Anwendung von Organoiden zu fördern. Wenn die Technologie zur Verstärkung der lichtdiffusen Reflexionswirkung von Organoiden im automatischen intelligenten Kultivierungssystem verwendet wird, kann sie theoretisch die hochpräzise Bildverstärkungskamera ersetzen, und es muss nur ein gewöhnliches Bilderkennungsgerät installiert werden. Darüber hinaus sind der Mediumaustausch und der Organoidtransfer durch Sekundärströmung, die durch Rotation und natürliche Sedimentation am Saugkopf erzeugt wird, theoretisch praktikabler als die Zentrifugation in zukünftigen automatischen Kulturanlagen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Natural Science Foundation of Guangdong Province (Grant No. 2020A0505100062), dem Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), der National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) und dem Guangzhou City Postdoctoral Research Grant Project (an Bangzhu Chen) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Chapter 7, Unit 7.1 (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W.
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L.
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, Pt 11 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B.
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
