Optische Klarheit ist ein großer Vorteil für die zellbiologische und physiologische Arbeit im Zebrafisch. Es werden robuste Methoden zur Messung des Zellwachstums in einzelnen Tieren beschrieben, die neue Einblicke in die Integration des Wachstums von Skelettmuskeln und benachbarten Geweben in das Wachstum des gesamten Körpers ermöglichen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Echtzeit- und wiederholte Messung des Skelettmuskelwachstums bei einzelnen lebenden Zebrafischen, die einer veränderten elektrischen Aktivität ausgesetzt sind
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine Reihe von Methoden kann verwendet werden, um einzelne Zellen im ganzen Körper von lebenden embryonalen, larven oder juvenilen Zebrafischen sichtbar zu machen. Wir zeigen, dass lebende Fische mit fluoreszenzmarkierten Plasmamembranen in einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop gescannt werden können, um das Volumen des Muskelgewebes und die Anzahl der vorhandenen Muskelfasern zu bestimmen. Effiziente Ansätze zur Messung der Zellanzahl und -größe in lebenden Tieren im Zeitverlauf werden beschrieben und anhand aufwändigerer Segmentierungsmethoden validiert. Es werden Methoden beschrieben, die die Steuerung der elektrischen und damit kontraktilen Muskelaktivität erlauben. Der Verlust der kontraktilen Aktivität der Skelettmuskulatur reduzierte das Muskelwachstum stark. Bei Larven wird ein Protokoll beschrieben, das die Wiedereinführung einer strukturierten, elektrisch evozierten kontraktilen Aktivität ermöglicht. Die beschriebenen Methoden minimieren den Effekt interindividueller Variabilität und erlauben es, die Wirkung von elektrischen, genetischen, medikamentösen oder Umweltreizen auf eine Vielzahl von zellulären und physiologischen Wachstumsparametern im Kontext des lebenden Organismus zu analysieren. Anschließend kann eine Langzeitnachbeobachtung der gemessenen Effekte einer definierten Frühlebensintervention auf Individuen durchgeführt werden.
Einleitung
Das regulierte Gewebewachstum, bestehend aus einer Zunahme der Zellzahl (Hyperplasie) und/oder Zellgröße (Hypertrophie), ist ein entscheidender Faktor für Entwicklung, Regeneration sowie ökologische und evolutionäre Anpassung. Trotz enormer Fortschritte im molekulargenetischen Verständnis sowohl der Zell- als auch der Entwicklungsbiologie in den letzten Jahrzehnten steckt das mechanistische Verständnis der Regulation von Gewebe und Organgröße noch in den Kinderschuhen. Ein Grund für diese Wissenslücke ist die Schwierigkeit, das Gewebewachstum in lebenden Organismen mit der notwendigen räumlichen und zeitlichen Genauigkeit zu quantifizieren.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle beschriebenen Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien und unter geeigneten Lizenzen des britischen Innenministeriums in Übereinstimmung mit dem Animal (Scientific Procedures) Act 1986 und nachfolgenden Änderungen durchgeführt. Embryonen/Larven sollten bis zum Abschluss der Gastrulation bei 28,5 °C aufgezogen werden, können dann aber bei 22-31 °C gehalten werden, um die Entwicklungsgeschwindigkeit zu kontrollieren. Fische können bei Raumtemperatur gescannt oder stimuliert werden.
1. Zebrafischlarven anästhesieren
- Kreuzen Sie geeignete fluoreszierende Reporterfische wie Tg(....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Eine schnelle und präzise Messung des Somit-Volumens
Es wird eine Methode der Probenvorbereitung, Datenerfassung und volumetrischen Analyse beschrieben, die die schnelle Messung des Muskelwachstums in Zebrafischlarven ermöglicht. Die Muskelgröße kann bei lebenden Tieren gemessen werden, indem Fische verwendet werden, die auf ihren Plasmamembranen mit einem membrangezielten GFP (β-Aktin:HRAS-EGFP ) oder mCherry (α-Aktin:mCherry-CAAX ) markiert sind. Die Larven wurden vorübergehend mit.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Hier berichten wir über eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung des Muskelvolumens lebender Zebrafischlarven in Stadien oder in genetischen Varianten, bei denen die Pigmentierung kein großes Hindernis für die Bildgebung darstellt und wenn eine vorübergehende Anästhesie und/oder Immobilisierung gut toleriert wird. Während wir die konfokale Laserscanning-Mikroskopie verwendet haben, sind die beschriebenen Ansätze auf die konfokale Spinnscheiben- oder Lichtblattmikroskopie und auf jede andere Methode anwendbar, d.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren sind den Bemühungen der Hughes-Labormitglieder Dr. Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin und Vladimir Snetkov für die Entwicklung der beschriebenen Protokolle sowie Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau und Peter Currie für die gemeinsame Nutzung von Plasmiden oder Zebrafischlinien zu großem Dank verpflichtet. SMH ist Wissenschaftler des Medical Research Council (MRC) mit Programmzuschuss G1001029, MR/N021231/1 und MR/W001381/1. MA hatte ein MRC Doctoral Training Programme PhD Studentship vom King's College London. Diese Arbeit profitierte vom trigonometrischen Input von David M. Ro....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kleber, Blu Tack | Bostik | - | |
| Aerosol-Vakuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539-Agarose | |
| , niedrige Geliertemperatur | Sigma-Aldrich | A9414 | Nach dem Schmelzen bei 37oC in einem Blockheizer aufbewahren, um für den wiederholten Gebrauch in flüssiger Form zu bleiben. |
| Blockheizer | Cole-Parmer | SBH130-BODIPY | |
| FL C5-Ceramid | Thermo Scientific | D3521 | In Fischwasser verdünnen und bei 5 & Mikro verwenden; M für Inkubation über Nacht. |
| Krokodilklemmen und - | |||
| Fidschi/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | |
| Fischmedium, Fischwasser | - | Zirkulierendes Systemwasser, das in der Fischanlage gesammelt wird. | |
| Fischmedium, E3-Medium | - | E3 wird im Zebrafischbuch beschrieben. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 und 0,33 mM MgSO4 in destilliertem Wasser). | |
| Fluoreszenzmikroskop | Leica | Leica MZ16F | wird erwartet, dass auch Fluoreszenzmikroskope anderer Art geeignet sind. |
| Glasnadel | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | Feuerpoliert zu werden, um eine Beschädigung der Embryonen während der Manipulation zu vermeiden. |
| Grasstimulator | Grass Instruments | S88 | wird erwartet, dass auch Stimulatoren anderer Art geeignet sind. |
| Kimwipes, Wischtücher für empfindliche Aufgaben | Kimberly-Clark Professional | 13258179-Laser-Scanning-Mikroskop | |
| (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 | LSM anderer Art sollen ebenfalls geeignet sein. |
| Nunc Zellkultur-behandelte Pipette, 6-Well-Platte | Thermo Scientific | 140675-Objektiv | |
| , 20-fach;/1,0 W Wasserimmersion | Zeiss | - | Pasteur-Pipette |
| , graduiert 1 mL | Starlab Group | E1414-0100-Pasteur-Pipette | |
| , Mikro feine Spitze 1 mL | Starlab Group | E1414-1100-Petrischale | |
| , 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR Plasmid, das in einer Dosis von 25-75 pg im Einzelzellstadium injiziert wird. Zitat: Bussman J und Schulte-Merker S. (2011) Entwicklung 138: 4327-4332. DOI: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | Für die In-vitro-Transkription unter Verwendung des SP6-Promotors (Plasmide, die andere Membranmarkierungsmarker enthalten, können verwendet werden); synthetisierte gedeckelte mRNA, die in einer Menge von 100-200 pg im Einzelzellstadium injiziert wird. |
| Impuls-Regler | Hoefer Scientific Instruments | PC750-Lötkolben | |
| - | |||
| -Tricain | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl-3-aminobenzoatmethansulfonat/ MS-222; in Fischwasser löslich zu machen und bei 0,6 mM zu verwenden. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | – | |
| Uhrmacherzange, Nr. 5 | – | ||
| Draht, Platin | Goodfellow | PT005142/12 | mit einem Durchmesser von 0,40 mm; eine teure Alternative zu Silber. |
| Draht, Silber | Acros Organics | 317730010 | einem Durchmesser von 0,25 mm (es wurde ein Durchmesserbereich von 0,25 bis 0,5 mm getestet, der zu ähnlichen Ergebnissen führte). |
| Zebrafisch, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN offizieller Name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Zitat: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordá n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Abbildung der Heterogenität von Tumorzellen nach Zelltransplantation in optisch klare, immundefiziente Zebrafische. Nat Commun. 21. Januar 2016;7:10358. DOI: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafisch, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN offizieller Name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Zitat: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A und Currie PD. Verlust von Tropomodulin4 in der Zebrafisch-Mutante trä GE verursacht die Bildung zytoplasmatischer Stäbchen und Muskelschwäche, die an die Nemalin-Myopathie erinnern. Dis Model Mech. 2014 Dez; 7(12):1407-15. DOI: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafisch, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN offizielle Bezeichnung: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Zitat: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I und Kimelman D. Visualisierung der Morphogenese in transgenen Zebrafischembryonen unter Verwendung des BODIPY TR-Methylesterfarbstoffs als vitaler Gegenfärbung für GFP. Dev Dyn. Februar 2005; 232(2):359-68. DOI: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
Referenzen
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
