Summary
Denne protokollen beskriver et generalisert og lett implementert skjema for skråstilt enkeltpartikkeldatainnsamling i kryo-EM-eksperimenter. En slik prosedyre er spesielt nyttig for å skaffe et EM-kart av høy kvalitet for prøver som lider av fortrinnsorienteringsskjevhet på grunn av overholdelse av luft-vanngrensesnittet.
Abstract
Enkeltpartikkelanalyse (SPA) ved kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM) er nå en vanlig teknikk for høyoppløselig strukturbiologi. Strukturbestemmelse ved SPA er avhengig av å oppnå flere forskjellige visninger av et makromolekylært objekt vitrifisert i et tynt lag av is. Ideelt sett ville en samling av jevnt fordelte tilfeldige projeksjonsorienteringer utgjøre alle mulige visninger av objektet, noe som gir opphav til rekonstruksjoner preget av isotrop retningsoppløsning. Men i virkeligheten lider mange prøver av fortrinnsvis orienterte partikler som fester seg til luft-vann-grensesnittet. Dette fører til ujevne vinkelorienteringsfordelinger i datasettet og inhomogen Fourier-rom-prøvetaking i rekonstruksjonen, oversatt til kart preget av anisotrop oppløsning. Vipping av prøvetrinnet gir en generaliserbar løsning for å overvinne oppløsningsanisotropi i kraft av å forbedre ensartetheten av orienteringsfordelinger, og dermed isotropien til Fourier-romprøvetaking. Den nåværende protokollen beskriver en automatisert datainnsamlingsstrategi på skråstilt stadium ved hjelp av Leginon, en programvare for automatisert bildeinnsamling. Prosedyren er enkel å implementere, krever ikke noe ekstra utstyr eller programvare, og er kompatibel med de fleste standard transmisjonselektronmikroskoper (TEM) som brukes til avbildning av biologiske makromolekyler.
Introduction
Fremkomsten av direkte elektrondetektorer i løpet av det siste tiåret 1,2,3 har ansporet en eksponentiell økning i antall høyoppløselige strukturer av makromolekyler og makromolekylære sammenstillinger løst ved bruk av enkeltpartikkelkryo-EM 4,5,6. Nesten alle rensede makromolekylære arter forventes å være egnet til strukturbestemmelse ved bruk av kryo-EM, bortsett fra de minste proteinene ~ 10 kDa i størrelse eller under7. Mengden utgangsmateriale som trengs for gridforberedelse og strukturbestemmelse er minst en størrelsesorden mindre enn andre strukturbestemmelsesteknikker, for eksempel kjernemagnetisk resonansspektroskopi og røntgenkrystallografi 4,5,6.
En hovedutfordring for strukturbestemmelse ved kryo-EM innebærer imidlertid egnet klargjøring av rutenett for avbildning. En omfattende studie som evaluerte ulike prøver ved hjelp av forskjellige vitrifikasjonsstrategier og rutenett antydet at de fleste tilnærminger for vitrifisering av prøver på kryo-EM-rutenett fører til fortrinnsvis overholdelse av makromolekyler til luft-vanngrensesnittet8. Slik etterlevelse kan potensielt forårsake fire suboptimale utfall: (1) den makromolekylære prøven denaturerer fullstendig, i hvilket tilfelle ingen vellykket datainnsamling og behandling er mulig; (2) prøven denaturerer delvis, i så fall kan det være mulig å oppnå strukturell innsikt fra regioner av makromolekylet som ikke er skadet; (3) prøven beholder innfødt struktur, men bare ett sett med partikkelorienteringer i forhold til retningen av elektronstrålen er representert i bildene; (4) prøven beholder naturlig struktur, og noen, men ikke alle mulige partikkelorienteringer i forhold til retningen til elektronstrålen er representert i bildene. For tilfeller (3) og (4) vil skråstilt datainnsamling bidra til å minimere retningsoppløsningsanisotropi som påvirker det rekonstruerte kryo-EM-kartet og gir en generaliserbar løsning for et bredt utvalg av prøver9. Teknisk sett kan vipping også være fordelaktig (2), siden denatureringen antagelig skjer ved luft-vann-grensesnittet og på samme måte begrenser antallet distinkte retninger som er representert i dataene. Graden av orienteringsskjevhet i datasettet kan potensielt endres ved å eksperimentere med løsningstilsetninger, men mangel på bred anvendelighet hindrer disse prøve-og-feile-tilnærmingene. Å vippe prøvetrinnet i en enkelt optimalisert hellingsvinkel er tilstrekkelig til å forbedre fordelingen av orienteringer i kraft av å endre geometrien til avbildningseksperimentet9 (figur 1). På grunn av den geometriske konfigurasjonen av den fortrinnsvis orienterte prøven med hensyn til elektronstrålen, for hver klynge av fortrinnsorienteringer, vipper rutenettet en kegle av belysningsvinkler i forhold til klyngesentroid. Derfor sprer dette utsikten og forbedrer følgelig Fourier-romprøvetaking og isotropien av retningsoppløsning.
Det er i praksis noen ulemper med å vippe scenen. Ved å vippe prøvetrinnet introduseres en fokusgradient over synsfeltet, noe som kan påvirke nøyaktigheten av CTF-estimeringer (contrast transfer function). Skråstilt datainnsamling kan også føre til økt stråleindusert partikkelbevegelse forårsaket av økte ladningseffekter ved avbildning av skråstilte prøver. Grid tilting fører også til en økning i tilsynelatende istykkelse, noe som igjen fører til støyende mikrografer og kan til slutt påvirke oppløsningen av rekonstruksjoner 5,9,10. Det kan være mulig å løse disse problemene ved å bruke avanserte databehandlingsskjemaer som er kort beskrevet i protokoll- og diskusjonsseksjonene. Til slutt kan vipping føre til økt partikkeloverlapping, noe som hindrer den påfølgende bildebehandlingsrørledningen. Selv om dette til en viss grad kan reduseres ved å optimalisere partikkelkonsentrasjonen på nettet, er det likevel en viktig faktor. Her beskrives en protokoll som er enkel å implementere for skråstilt datainnsamling ved hjelp av Leginon-programvarepakken (en automatisert programvare for bildeinnsamling), tilgjengelig åpen tilgang og kompatibel med et bredt spekter av mikroskoper11,12,13,14. Metoden krever minst versjon 3.0 eller nyere, med versjon 3.3 og utover som inneholder dedikerte forbedringer for å muliggjøre skråstilt datainnsamling. Ingen ekstra programvare eller utstyr er nødvendig for denne protokollen. Omfattende instruksjoner om beregningsinfrastruktur og installasjonsveiledninger er gitt andre steder15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av prøver
- Bruk rutenett som inneholder gullfolie og gullgitterstøtte16 (se Materialfortegnelse) fordi skråstilt datainnsamling kan fremheve stråleindusert bevegelse17.
MERK: For denne studien ble prøver på rutenett vitrifisert ved hjelp av manuell stupende og blotting teknikk18 i et fuktet (større enn 80%) kjølerom (~ 4 ° C). - Unngå å bruke rister som inneholder kobberstøtte og karbonfolie eller et kontinuerlig lag av amorft karbon med mindre det er absolutt nødvendig, da disse ristene kan føre til større stråleindusert bevegelse16 når prøvetrinnet er vippet.
MERK: Alternative støttelag, som grafen / grafenoksid, ser ut til å redusere stråleindusert bevegelse sammenlignet med amorft karbon19,20. - Forhåndsskjerme rutenett og identifisere regioner karakterisert ved akseptabel istykkelse og partikkelfordeling. Rutenett som inneholder for tettpakkede partikler vil føre til overlapping av partikler under skråstilt datainnsamling, noe som kan påvirke nedstrøms databehandlingstrinn.
MERK: Disse trinnene er subjektive siden identifisering av gode isområder utføres ved å visuelt inspisere defokuserte bilder for regioner der partikkelkontrasten er tydelig. Dette er kanskje ikke gjennomførbart for alle prøver, siden noen prøver ikke vil distribuere effektivt i områder med tynn is, noe som fører til utfordringer under datainnsamling (beskrevet i diskusjonsdelen). - Vitrifiser ristene som inneholder proteinprøven. Her, for demonstrasjonsformål, bruker vi DNA-beskyttelse under sulteprotein (DPS) (se materialfortegnelse) i et område fra 0,1-0,5 mg / ml med gullfolie og gullstøttegitter.
MERK: Proteinet ble renset som beskrevet tidligere, bortsett fra at det ikke ble utført TEV-proteasespaltning21. Proteinkonsentrasjonsområdet for en prøve av interesse må optimaliseres individuelt, siden det er vanskelig å måle et ideelt område som er universelt anvendelig og nesten helt sikkert vil variere mellom forskjellige prøver.
2. Sette opp skråstilt datainnsamling
- Juster mikroskopet for å sikre parallell belysning av prøven og minimere komaavvik22.
MERK: Mikroskopet må være godt justert for standard SPA datainnsamling uten scenetilt. Ingen spesielle justeringer er nødvendige for skråstilt datainnsamling, men en god justering vil sikre at målretting og avbildning går jevnt. Et generelt skjema som sammenligner skråstilt og ikke-vippet datainnsamling er gitt i figur 2. - Ta opp et rutenettatlas uten scenehelling for å identifisere firkanter som er egnet for datainnsamling, eller inspiser firkanter manuelt ved forstørrelsen som brukes i Square Acquisition Node. Se etter firkanter der folien er intakt, ikke ser dehydrert ut og har ideell istykkelse.
MERK: Square Acquisition Node er noden med lav forstørrelse som brukes til flerskala avbildning i Leginon.- For typisk automatisert datainnsamling uten helling, registrer et rutenettatlas som gir oversikt over den totale nettkvaliteten og en første indikasjon på egnede områder for datainnsamling.
- Deretter velger du passende firkanter gjennom atlaset og sender dem til køen. Deretter, enten gjennom manuelt valg av hull eller gjennom den automatiserte EM-hullfinneren, kø og send inn hullmålene.
- Til slutt, bruk den automatiserte EM-hullfinneren for å sende inn eksponeringsmål med høy forstørrelse.
MERK: For skråstilt datainnsamling kan det hende at firkanter må legges i kø manuelt for å få konsekvente resultater, spesielt hvis den optimale hellingsvinkelen ikke er forhåndsbestemt og sannsynligvis vil bli justert under datainnsamlingen. Rutenettatlaset kunne også registreres ved hjelp av en forhåndsdefinert scenehelning hvis hellingsvinkelen som ble brukt til datainnsamling tidligere var etablert.
- Flytt prøvestadiet til et ruten av interesse.
- Bestem den eusentriske høyden for sceneposisjonen ved hjelp av α-wobbler ved ± 15° trinnhelling. Juster Z-høyden for å bringe scenen til eusentrisk høyde ved hjelp av tastaturpanelet for mikroskopet. Sørg for at bildeskiftet er minimalt under α-wobble-rutinen.
MERK: Hvis den eusentriske høyden ikke er riktig identifisert, vil en stor bildeforskyvning bli observert ved å vippe scenen ved kvadratforstørrelsen. Dette kan også skje hvis det er lokale deformasjoner på rutenettet, for eksempel hvis rutenettet er ødelagt eller sterkt bøyd i nærheten av det avbildede området. Selv om det er best å unngå slike regioner for datainnsamling, er det viktig å estimere eusentrisk høyde nøyaktig hvis disse representerer en av de få lovende regionene for datainnsamling. Figur 3 viser hvordan målretting uten riktig identifisering av eusentrisk høyde kan forårsake store bildeforskyvninger i kvadratforstørrelsen. - Finn en mer nøyaktig Z-høyde, bruk Focuser-noden og trykk på Simuler.
- Vanligvis estimerer du Z-høyden i fokusernoden ved forstørrelsen som brukes i kvadratisk anskaffelsesnode.
MERK: Fokussekvensen for Focuser-noden kan også inkludere en fin Z-fokusestimering ved Hole Acquisition-noden (et verktøy i Leginon-programvare) forstørrelse under datainnsamling. - Juster innstillingene for fokuseringsnoden og aktiver/deaktiver det fine Z-fokusalternativet under den første køen av firkanter.
MERK: Det er viktig å sikre at eusentrisk høyde identifiseres nøyaktig når automatisert datainnsamling begynner, noe som kan kreve at du aktiverer fint Z-fokus på nytt (trinn 2.10).
- Vanligvis estimerer du Z-høyden i fokusernoden ved forstørrelsen som brukes i kvadratisk anskaffelsesnode.
- Vipp prøvetrinnet til ønsket hellingsvinkel for datainnsamling i ekte eusentrisk høyde, og sentrer om nødvendig trinnet. 0°, 30° og 60° hellingsvinkler ble brukt i denne studien. Trykk på Simuler i Square Acquisition-noden for å begynne å sette mål i kø for nodeeksponeringer for hullinnhenting .
MERK: Som angitt i trinn 2.2.1, kan rutenettatlaset registreres ved hjelp av en forhåndsdefinert scenehelling, noe som vil eliminere behovet for å vippe scenen igjen på dette trinnet. Dette fungerer bra og fremskynder prosessen hvis hellingsvinkelen som brukes til datainnsamling er forhåndsdefinert. Den nåværende protokollen er skrevet med nye prøver i tankene, der brukeren kan ønske å teste forskjellige tiltvinkler for datainnsamling. - Velg et Z-fokusmål og regioner med hull som er egnet for eksponeringer med høy forstørrelse.
- Trykk Send inn mål for å stå i kø for avbildning. Ikke trykk Send inn mål i kø før du er ferdig med å legge alle rutene i kø.
- Ta prøvetrinnet tilbake til sin uvippede tilstand. Gå til neste firkant og gjenta trinn 2.3-2.8 til et tilstrekkelig antall hulleksponeringer er lagt i kø.
- Gå til Hole Targeting Node og trykk Send inn mål i kø når alle rutene er lagt i kø.
MERK: Hvis fint Z-fokus ble deaktivert tidligere for å spare tid (trinn 2.5), må det aktiveres på nytt før du sender køen. - Kontroller manuelt mål valgt av noden for eksponering med høy forstørrelse for å teste om den automatiserte EM-hullfinneren nøyaktig kan identifisere passende områder for bildeopptak når prøvetrinnet er skråstilt.
- Under denne prosedyren velger du «Tillat brukerverifisering av valgte mål» i nodeinnstillingene for eksponeringsinnhenting . Når brukeren er fornøyd med målrettingsnøyaktigheten, fjerner du merket for dette alternativet for automatisert datainnsamling.
MERK: Mål med høy forstørrelse Eksponering Oppkjøpsnode avbildes vanligvis ved hjelp av en stråle-tilt bildeskiftstrategi, som fungerer like bra for både skråstilt og ikke-vippet datainnsamling23,24,25,26. For nøyaktig CTF-estimering i nedstrøms databehandlingstrinn, må aberrasjonskalibreringen mellom objektiv og koma utføres for datainnsamlingsstrategien for stråle-tilt bildeskift.
- Under denne prosedyren velger du «Tillat brukerverifisering av valgte mål» i nodeinnstillingene for eksponeringsinnhenting . Når brukeren er fornøyd med målrettingsnøyaktigheten, fjerner du merket for dette alternativet for automatisert datainnsamling.
3. Databehandling
- Start on-the-fly databehandling 10,27,28,29 med bevegelseskorreksjon av innspilte filmer, CTF-estimering, partikkelvalg og generering av innledende rekonstruksjoner under datainnsamling.
MERK: For denne studien har cryoSPARC Live10 (se materialfortegnelse) blitt brukt til forbehandling. On-the-fly databehandling gir en innledende cryo-EM-rekonstruksjon og en tilnærming for vinkelfordelingen, som kan informere brukeren om omfanget av oppløsningsanisotropi. Disse kan i sin tur brukes til å veilede brukeren om hvorvidt hellingsvinkelen som brukes til datainnsamling er tilstrekkelig høy. - Visualiser det rekonstruerte kartet og plott Euler-vinkelfordelingen for å måle omfanget av foretrukne partikkelorienteringer.
MERK: Euler-vinkelfordelingene kan konverteres direkte til Fourier-romprøvefordelinger for å bestemme den potensielle omfanget av oppløsningsanisotropi. Et grafisk brukergrensesnitt (GUI) er utviklet for å hjelpe brukeren med å evaluere kvaliteten på en Euler-vinkelfordeling og bestemme en optimal hellingsvinkel30,31. Verktøyet kan hentes fra Github-depotet, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui. - Juster om nødvendig scenehellingsvinkelen som data samles inn for å overvinne effekten av foretrukket orientering. Vinkelen kan økes dersom preferanseretningen forblir et problem, som det fremgår av kartet og Euler-fordelingen i 3.2. Alternativt kan brukeren dele datainnsamlingen inn i grupper og registrere ved hjelp av flere forskjellige hellingsvinkler, for eksempel 20°, 30° og 40°.
MERK: Selv om de fleste TEM-er må ha muligheten til å vippe scenen til 70 °, varierer vanlige prøvetrinnshellinger (som vi har brukt) fra 20 ° -40 °.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DPS ved 0,3 mg/ml ble brukt til å demonstrere avbildning ved 0°, 30° og 60° helling. Data fra forskjellige hellingsvinkler ble samlet inn på samme rutenett i forskjellige rutenettregioner. CTF-oppløsning som passer for høyere vinkelhellinger har en tendens til å være dårligere, slik tilfellet var når man sammenlignet de tre datasettene i denne studien. Figur 4 viser komparative representative bilder og 2D-klassifiseringsgjennomsnitt. Selv om proteinkonsentrasjonen er uendret over de forskjellige hellingsvinklene, gjør en høyere hellingsvinkel at det avbildede området virker mer overfylt når det gjelder partikkelkonsentrasjon. Dette kan være problematisk for databehandling fordi partikkeloverlapping kan komplisere 3D-rekonstruksjoner og vinkelforbedringer. Iterativ 2D-klassifisering produserte rutinemessig en ren stabel med partikler med 0 ° og 30 ° vippede datasett, mens 60 ° datasettet krevde nøye rengjøring av partikkelstakkene for å sikre at klassegjennomsnitt viser minimal overlapping for tilstøtende partikler. Klassegjennomsnittet fra figur 4C i den røde boksen representerer et eksempel på partikkeloverlapping. Selv om re-sentrering under klassifisering kan føre til at signalet fra nabopartikler blir gjennomsnittlig, kan betydelig partikkeloverlapping kompromittere nøyaktigheten av partikkeljusteringsparametere, noe som gir rekonstruksjoner preget av lavere oppløsning. Den beste løsningen for å unngå partikkeloverlapping er å forhåndsskjerme rutenett med optimal istykkelse og partikkelfordeling. En omfattende kvantitativ oversikt over beregningene for å evaluere forbedringer fra skråstilt datainnsamling er beskrevet andre steder32.
Figur 1: Oversikt over fordeler og utfordringer ved innsamling av vippede data. Topppanelet viser et nærbilde av et rutenetthull. Gitterstenger er i gull, glassaktig isblå og makromolekylære partikler røde. Pilene indikerer retningen til elektronstrålen. Bunnpanelet representerer en samling hull med samme fargevalg som i topppanelet. Den svarte stjernen representerer finfokusmålet før eksponeringsbilde ved høy forstørrelse. Vippevinkelen er angitt som 'α'. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflytdiagram som sammenligner strategi for datainnsamling på skråstilling og skråstilling. Trinnvis sammenligning av datainnsamling uten skråstilling og skråstilling viser det ekstra trinnet med manuell beregning av den eusentriske høyden og omsentrering for hver skråstilte firkant (2 og 3 for skråstilt datainnsamling). Resten av arbeidsflyten er lik mellom de to strategiene. Disse inkluderer å velge en passende firkant for avbildning (1 for skråstilt og ikke-vippet datainnsamling), starte et køskjema ved å velge en firkant for avbildning (referert til som simulere; 2 og 4 for henholdsvis untilted og tilted datainnsamling), som gir et eusentrisk høydefokusmål og køhullforstørrelsesinnsamlingsmål (3 og 5 for untilted og tilted datainnsamling, henholdsvis). og til slutt sende inn køen av utvalgte eksponeringsmål for høy forstørrelse (4 og 6 for henholdsvis untilted og tilted datainnsamling). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av rutenettet ved kvadratforstørrelse med forskjellige hellingsvinkler. Bilder samlet nær og langt fra eucentrisk Z-høyde vises på henholdsvis topp- og bunnpanelene. Den optiske aksen til strålen er indikert av midten av de røde konsentriske ringene. Den grønne pilen indikerer kvadratet av interesse. Det er en ødelagt rutenettfunksjon ved siden av torget av interesse for referanse. Den objektive blenderåpningen fjernes for enkel visning. Skala bar = 20 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative hulleksponeringer og 2D-klassegjennomsnitt samlet inn ved forskjellige hellingsvinkler. Panelene (A), (B) og (C) refererer til avbildning utført med prøvetrinnet uvippet ved 0° eller vippet til 30° og 60°. 2D-klassegjennomsnitt påvirket av overbefolkning vises i den røde boksen i (C). Skala bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Foretrukket partikkelorientering forårsaket av prøvens overholdelse av luft-vann-grensesnittet er en av de siste store flaskehalsene for rutinemessig strukturbestemmelse med høy oppløsning ved bruk av kryo-EM SPA 4,5,6. Datainnsamlingsskjemaet som presenteres her gir en enkel å implementere strategi for å forbedre orienteringsfordelingen av partikler i et datasett. Vi gjør oppmerksom på at protokollen ikke krever ekstra utstyr eller programvare og ikke påvirker datainnsamlingshastigheten. Følgende hensyn er viktige under datainnsamling for skråstilte prøver.
For det første må den avbildede firkanten være i eusentrisk høyde for optimal målretting. Eusentrisk høyde justeres ved å ta bilder med vippepar på små scenevinkler (vanligvis 0,5°-2°) og identifisere fokus basert på et forhåndsdefinert forhold mellom bildeforskyvning og ufokus. Hvis den målrettede firkanten krever en stor justering i eusentrisk høyde, vil dette resultere i en betydelig bildeforskyvning av det kvadratiske bildet, slik at når scenen vippes igjen, kan synsfeltet blokkeres av objektivblenderåpningen.
For det andre blir det normalt sirkulære hullet stadig mer avlangt med høyere tilter ved middels forstørrelse (Hole Acquisition Node forstørrelse). I fravær av nøyaktige bildeskiftkalibreringer er det mulig at en del av folien kan avbildes sammen med partikler innebygd i glasslegemet for en gitt eksponeringsforstørrelse. Derfor må ideelt sett bildeskiftkalibreringene være nøyaktige. Et alternativ er å øke forstørrelsen slik at det avbildede området i forhold til hullstørrelsen reduseres. Ved høyere forstørrelse vil feil i stråletiltindusert bildeforskyvning ha mindre effekt på brukerens evne til å navigere til et område med glassaktig is. Dette kommer imidlertid på bekostning av å redusere antall partikler i de resulterende mikrografene, proporsjonalt med en økning i forstørrelsen.
For det tredje har autofokus større sjanse for å mislykkes for skrå datainnsamling på grunn av økt stråleindusert bevegelse og økt prøvetykkelse. Dermed kan det å oppnå nøyaktig fokus noen ganger by på noen utfordringer for skråstilt datainnsamling, spesielt hvis fokusmålet er gullfolien i midten av fire hull, som er standard praksis for uvippet datainnsamling. I tilfeller av hyppige fokusestimeringsfeil er et alternativ å sette kanten av et hull som fokusmål. Dette må gi et tilstrekkelig signal for nøyaktig fasekorrelasjon mellom stråletiltinduserte bildepar og påfølgende fokusjustering. Vår erfaring er at fokus på kanten av et hull sjelden resulterer i autofokusfeil.
Og til slutt, når bilder med høy forstørrelse velges langt fra rutenettsenteret, kan forskjellen i fokus mellom målrettede bilder på motsatte sider av vippeaksen være betydelig. Størrelsen på denne forskjellen er avhengig av hellingsvinkelen og avstanden fra fokuspunktet. For eksempel, ved en hellingsvinkel på 30 °, vil to mål som er 6 μm fra hverandre på overflaten av rutenettet og valgt nøyaktig vinkelrett på tiltaksen, ha en 3 μm forskjell i defokus mellom dem (forholdet er: delta defokus = sin (vippevinkel) * (avstand fra vippsakse)). Mål som velges langs vippeaksen, vil ha samme ufokusering, mens andre vil falle et sted mellom. Hvis vippeaksen er definert i Leginon under kalibrering, kompenserer programvaren automatisk for endringen i ufokusering. Brukerne må imidlertid være oppmerksomme på at muligheten for å ha større fokusgradienter under avbildning med høy forstørrelse likevel eksisterer. Store fokusgradienter bør minimalt påvirke den endelige rekonstruksjonen33, men det kan være nødvendig å bruke større boksstørrelser under databehandling for å forhindre aliaseffekter. Under disse omstendighetene kan det være berettiget å bruke et smalere defokusområde under datainnsamling, og randomisering av defokus kommer naturlig fra å vippe scenen. Defokusjusteringer per partikkel under databehandling kan forbedre oppløsningen av endelige rekonstruksjoner. Siden nøyaktig modellering av CTF-tilpasninger kan være utfordrende for vinkler med høy scenehelling, må det imidlertid utvises forsiktighet for å overvåke kvaliteten på dataene, og CTF passer under eksponeringskurering. Generelt resulterer suboptimal istykkelse i dårligere nøyaktighet i modellering av CTF-estimeringstilpasninger. Det må derfor tas hensyn til bilder i områder der isen er tynn, forutsatt at partikkelfordelingen er god nok i disse områdene.
En forbedret og mer ensartet orienteringsfordeling fører til en tilsvarende forbedring i retningsoppløsningen til de rekonstruerte kryo-EM-kartene. I tillegg forbedrer en mer ensartet orienteringsfordeling utvalgskompensasjonsfaktoren, som direkte relaterer seg til global oppløsning30,31. Dermed bør kollektiv forbedring av orienteringsfordelingen forbedre nøyaktigheten av atommodellering og raffinement 9,30,31. Dette vil i prinsippet gi et sterkt argument for rutinemessig implementering av skråstilt datainnsamling. Det er imidlertid flere forbehold brukeren må være oppmerksom på. For det første kan den økte fokusgradienten og istykkelsen påvirke den generelle globale oppløsningen, antagelig på grunn av en kombinasjon av økt bakgrunnsstøy og økt stråleindusert bevegelse, kombinert med andre indirekte problemer som oppstår som et resultat17. Denne effekten forventes å være mer uttalt i tilfeller der isen er iboende tykkere. Men siden de fleste prøver lider av en viss grad av foretrukket orientering, noe som igjen kan føre til ujevn prøvetaking, kan skråstilt datainnsamling generelt være gunstig så lenge de skadelige effektene minimeres eller reduseres. For det andre kan det være nødvendig å vippe scenen så høyt som 60 ° for noen prøver preget av alvorlig preferanseorientering. Anekdotiske upubliserte bevis fra vårt arbeid og kollegers rapporter tyder på at selv ~ 40 ° vipper er utilstrekkelige for å overvinne oppløsningsanisotropi for noen prøver. Arbeidet med å identifisere en optimal hellingsvinkel for et sett med distribusjoner er i gang, basert på ideene lagt ut i Baldwin et al.31. Til slutt bør man merke seg at i prinsippet vil en rekonstruksjon fra en prøve karakterisert ved en perfekt patologisk enkelt foretrukket orientering fortsatt ha en 30° manglende kjegle selv når dataene samles inn i en 60° hellingsvinkel. I simulerte eksperimenter er det lite sannsynlig at en 30° manglende kjegle vil påvirke eksperimentelle tolkninger sterkt. En 60° helning er sannsynligvis tilstrekkelig for selv de mest patologisk fortrinnsvis orienterte prøvene. Men i tilfeller der scenen kanskje må vippes med så mye som 60 °, må konsentrasjonen av partikler i synsfeltet optimaliseres nøye, siden partikkeloverlapping vil komplisere databehandlingen. Det er ikke mulig å vippe til mer enn 60° (eller 70° på utvalgte mikroskoptrinn) på standard TEM-er, på grunn av begrensninger i prøvetrinndesignet. I slike tilfeller kan det være nødvendig med ytterligere optimalisering med tilsetningsstoffer og prøvebiokjemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Bill Anderson, Charles Bowman og Jean-Christophe Ducom (TSRI) for hjelp med mikroskopi, Leginon installasjoner og dataoverføringsinfrastruktur. Vi takker også Gordon Louie (Salk Institute) og Yong Zi Tan (National University of Singapore) for kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) for å gi oss plasmidet for uttrykk for DPS. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 og R01AI136680 til DL), National Science Foundation (NSF MCB-2048095 til DL), Hearst Foundations (til DL), og Arthur og Julie Woodrow Chair (til JPN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
- Russo, C. J., Henderson, R.
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
- Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
- Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
- Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
- Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
- Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
- Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
- Glaeser, R. M., et al.
