Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

Das Kippen des Probentisches bietet eine einfache und verallgemeinerbare Möglichkeit, die Orientierungsverteilung von Partikeln während der Kryo-EM-Datenerfassung von Einzelpartikeln zu erhöhen. Die gleichmäßige Verteilung der Partikel, die durch die Neigung des Probentisches erhalten wird, ermöglicht die Verbesserung der allgemeinen Kartenqualität und Interpretierbarkeit. Beginnen Sie mit der Ausrichtung des Mikroskops, um eine parallele Beleuchtung der Probe zu gewährleisten und Komaaberrationen zu minimieren.

Um die für die Datenerhebung geeigneten Quadrate zu identifizieren, erfassen Sie einen Rasteratlas ohne Bühnenneigung oder mit Bühnenneigung, der einen Überblick über die Gesamtrasterqualität und einen ersten Hinweis auf geeignete Bereiche für die Datenerhebung gibt. Überprüfen Sie die Quadrate manuell mit der Vergrößerung, die im Quadraterfassungsknoten verwendet wird. Suchen Sie nach den Quadraten, in denen die Folie intakt ist, nicht dehydriert aussieht und eine ideale Eisdicke aufweist, und verschieben Sie den Probentisch auf ein interessantes Quadrat.

Bestimmen Sie die euzentrische Höhe für die Tischposition mit einem Alpha-Wobbler bei einer Bühnenneigung von etwa 15 Grad und stellen Sie die Z-Höhe ein, um die Bühne mit der Tastatur für das Mikroskop auf euzentrische Höhe zu bringen. Stellen Sie sicher, dass die Bildverschiebung während der Alpha-Wobble-Routine minimal ist. Um eine genauere Z-Höhe zu finden, schätzen Sie sie im Okularauszugsknoten bei der Vergrößerung, die im quadratischen Erfassungsknoten verwendet wird.

Passen Sie die Einstellungen für den Okularauszugsknoten an und aktivieren oder deaktivieren Sie die Option für den feinen Z-Fokus während der ersten Warteschlange von Quadraten. Drücken Sie dann auf Simulieren. Kippen Sie den Probentisch auf den gewünschten Neigungswinkel für die Datenerfassung auf der wahren euzentrischen Höhe und zentrieren Sie den Tisch bei Bedarf neu.

Drücken Sie im quadratischen Erfassungsknoten auf Simulieren, um mit der Warteschlange für die Belichtung ganzer Erfassungsknoten zu beginnen. Wählen Sie als Nächstes ein Z-Fokusziel und Bereiche mit Löchern aus, die für Belichtungen mit hoher Vergrößerung geeignet sind, und senden Sie die Ziele zur Bildgebung an die Warteschlange. Bringen Sie den Probentisch wieder in seinen nicht geneigten Zustand und bewegen Sie sich dann zum nächsten Quadrat.

Wiederholen Sie diese Schritte, bis eine ausreichende Anzahl ganzer Aufnahmen in die Warteschlange eingereiht wurde. Sobald alle Quadrate in der Warteschlange stehen, gehen Sie zum gesamten Targeting-Knoten und klicken Sie auf Submit Queued Targets. Wählen Sie in den Knoteneinstellungen die Option Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen aus, und überprüfen Sie die vom Belichtungserfassungsknoten mit hoher Vergrößerung ausgewählten Ziele manuell, um zu testen, ob der automatisierte EM-Bohrlochsucher die geeigneten Bereiche für die Bildaufnahme genau identifizieren kann, wenn der Probentisch geneigt ist.

Wenn der Benutzer mit der Targetinggenauigkeit zufrieden ist, deaktivieren Sie die Option Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen für die automatisierte Datenerfassung. Die repräsentativen Bilder des Gitters bei quadratischer Vergrößerung mit unterschiedlichen Neigungswinkeln, die nahe und fern von der euzentrischen Z-Höhe aufgenommen wurden, sind hier zu sehen. Die Mitte des Strahls wird durch die Mitte der roten konzentrischen Ringe angezeigt und der grüne Pfeil zeigt das interessierende Quadrat an.

Es gibt ein unterbrochenes Raster-Feature neben dem interessierenden Quadrat als Referenz. Hier sind die repräsentativen Lochbelichtungen und 2D-Klassendurchschnitte dargestellt, die bei Neigungswinkeln von 0 Grad, 30 Grad und 60 Grad erfasst wurden. Obwohl die Proteinkonzentration über die verschiedenen Neigungswinkel hinweg unverändert bleibt, lässt ein höherer Neigungswinkel den abgebildeten Bereich in Bezug auf die Partikelkonzentration überfüllter erscheinen.

2D-Klassendurchschnitte, die von Überfüllung betroffen sind, werden in diesem roten Kasten angezeigt. Die Einfachheit des Protokolls ermöglicht es jedem Standardbenutzer des Mikroskops, eine geneigte Datenerfassungsstrategie einfach anzupassen.