Methodenartikel

Einzelpartikel-Kryo-EM-Datenerfassung mit Stage Tilt unter Verwendung von Leginon

DOI:

10.3791/64136

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1. Juli 2022

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1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology, University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt ein verallgemeinertes und einfach zu implementierendes Schema für die Datenerfassung von gekippten Einzelpartikeln in Kryo-EM-Experimenten. Ein solches Verfahren ist besonders nützlich, um eine qualitativ hochwertige EM-Karte für Proben zu erhalten, die aufgrund der Einhaltung der Luft-Wasser-Grenzfläche unter einer bevorzugten Orientierungsverzerrung leiden.

Zusammenfassung

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Die Einzelpartikelanalyse (SPA) mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist heute eine gängige Technik für die hochauflösende Strukturbiologie. Die Strukturbestimmung durch SPA beruht auf der Gewinnung mehrerer unterschiedlicher Ansichten eines makromolekularen Objekts, das in einer dünnen Eisschicht verglast ist. Im Idealfall würde eine Sammlung von gleichmäßig verteilten zufälligen Projektionsorientierungen alle möglichen Ansichten des Objekts ergeben, was zu Rekonstruktionen führt, die durch eine isotrope Richtungsauflösung gekennzeichnet sind. In der Realität leiden jedoch viele Proben unter bevorzugt orientierten Partikeln, die an der Luft-Wasser-Grenzfläche haften. Dies führt zu ungleichmäßigen Winkelorientierungsverteilungen im Datensatz und inhomogenem Fourier-Raum-Sampling in der Rekonstruktion, was sich in Karten niederschlägt, die durch anisotrope Auflösung gekennzeichnet sind. Die Neigung des Probentisches bietet eine verallgemeinerbare Lösung zur Überwindung der Auflösungsanisotropie durch die Verbesserung der Gleichmäßigkeit der Orientierungsverteilungen und damit der Isotropie der Fourier-Raumabtastung. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine automatisierte Datenerfassungsstrategie mit geneigter Stufe unter Verwendung von Leginon, einer Software zur automatisierten Bilderfassung. Das Verfahren ist einfach zu implementieren, erfordert keine zusätzliche Ausrüstung oder Software und ist mit den meisten Standard-Transmissionselektronenmikroskopen (TEMs) kompatibel, die für die Abbildung biologischer Makromoleküle verwendet werden.

Einleitung

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Das Aufkommen von Direktelektronendetektorenin den letzten zehn Jahren 1,2,3 hat zu einem exponentiellen Anstieg der Anzahl hochauflösender Strukturen von Makromolekülen und makromolekularen Anordnungen geführt, die mit Einzelpartikel-Kryo-EM 4,5,6 gelöst wurden. Es wird erwartet, dass fast alle gereinigten makromolekularen Spezies für die Strukturbestimmung mittels Kryo-EM geeignet sind, mit Ausnahme der kleinsten Proteine mit einer Größe von ~10 kDa oder unter....

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Protokoll

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1. Probenvorbereitung

  1. Verwenden Sie Gitter, die Goldfolie und Goldgitterträger16 enthalten (siehe Materialtabelle), da eine geneigte Datenerfassung die strahlinduzierte Bewegung17 verstärken kann.
    HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden Proben auf Gittern mit der manuellen Tauch- und Blotting-Technik18 in einem befeuchteten (mehr als 80%) Kühlraum (~4 °C) verglast.
  2. Vermeiden Sie die Verwendung von Gittern, die Kupferträger und Kohlenstofffolie oder eine durchgehende Schicht aus amorphem Kohlenstoff enthalten, es sei denn, dies ist unbedin....

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Ergebnisse

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DPS bei 0,3 mg/ml wurde verwendet, um die Bildgebung bei 0°-, 30°- und 60°-Neigungen zu demonstrieren. Daten aus verschiedenen Neigungswinkeln wurden auf demselben Gitter in verschiedenen Gitterregionen gesammelt. Die CTF-Auflösung für höhere Neigungen ist tendenziell schlechter, wie es beim Vergleich der drei Datensätze in dieser Studie der Fall war. Abbildung 4 zeigt vergleichende repräsentative Bilder und 2D-Klassifizierungsmittelwerte. Obwohl die Proteinkonzentration über die verschieden.......

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Diskussion

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Die bevorzugte Partikelorientierung, die durch die Anhaftung der Probe an der Luft-Wasser-Grenzfläche verursacht wird, ist einer der letzten großen Engpässe bei der routinemäßigen hochauflösenden Strukturbestimmung mit Kryo-EM SPA 4,5,6. Das hier vorgestellte Datenerhebungsschema bietet eine einfach zu implementierende Strategie zur Verbesserung der Orientierungsverteilung von Partikeln innerhalb eines Datensatzes. Wir weisen da.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir danken Bill Anderson, Charles Bowman und Jean-Christophe Ducom (TSRI) für ihre Hilfe bei der Mikroskopie, den Leginon-Installationen und der Datenübertragungsinfrastruktur. Wir danken auch Gordon Louie (Salk Institute) und Yong Zi Tan (National University of Singapore) für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken Chris Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) für die Bereitstellung des Plasmids für die Expression von DPS. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der US National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 und R01AI136680 an DL), der National Science Foundation (NSF MCB-2048095 an DL), der Hearst Foundations (an DL) und des Arth....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cryosparc Live v3.1.0+210216Structura Biotechnology
DPS-Proteinreinigungangepasst an das in K.Naydenova et al. IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron DetectorGatan
Leginon Software-SuiteC Suloway et al. Journal of Structural Biology 151 (1): S. 41-60.
Manuelle TauchvorrichtungSelbstgemachte Guillotine-ähnliche Vorrichtung zur Verglasung von EM-Gittern
Talos ArcticaFEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 MaschengitterQuantifoilN1-A14nAu30-01

Referenzen

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  1. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from th....

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Schlagwörter

Leginon Softwareautomatisierte DatenerfassungOrientierungsverteilungeuzentrische H heTransmissionselektronenmikroskophochaufl sende BildgebungFourier Raum Abtastung2D Klassenmittelwerte

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