Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um präzise Knock-in-Bearbeitungen in Zebrafischembryonen mit der CRISPR-Cas9-Technologie zu ermöglichen. Eine Phänotypisierungspipeline wird vorgestellt, um die Anwendbarkeit dieser Techniken zur Modellierung einer Long-QT-Syndrom-assoziierten Genvariante zu demonstrieren.
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Methodenartikel
CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) in Tiermodellen ermöglichen eine präzise genetische Manipulation zur Untersuchung physiologischer Phänomene. Zebrafische wurden als effektives genetisches Modell verwendet, um zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit Erbkrankheiten, Entwicklung und Toxikologie auf der Ebene des gesamten Organs und des Organismus zu untersuchen. Aufgrund des gut annotierten und kartierten Zebrafischgenoms wurden zahlreiche Werkzeuge zur Gen-Editierung entwickelt. Die Wirksamkeit der Erzeugung und Leichtigkeit der Erkennung präziser Knock-In-Bearbeitungen mit CRISPR ist jedoch ein limitierender Faktor. Hier wird ein CRISPR-Cas9-basierter Knock-in-Ansatz mit dem einfachen Nachweis präziser Schnitte in einem Gen beschrieben, das für die kardiale Repolarisation verantwortlich ist und mit der elektrischen Störung Long QT Syndrome (LQTS) assoziiert ist. Dieser Zwei-Single-Guide-RNA-Ansatz (sgRNA) schneidet und ersetzt die Zielsequenz und verknüpft ein genetisch kodiertes Reportergen. Der Nutzen dieses Ansatzes wird durch die Beschreibung nicht-invasiver phänotypischer Messungen der kardialen elektrischen Funktion in Wildtyp- und geneditierten Zebrafischlarven demonstriert. Dieser Ansatz ermöglicht die effiziente Untersuchung krankheitsassoziierter Varianten in einem ganzen Organismus. Darüber hinaus bietet diese Strategie Möglichkeiten zum Einfügen exogener Sequenzen der Wahl, wie Reportergene, Orthologe oder Geneditoren.
Einleitung
CRISPR-basierte Gen-Editing-Strategien in Tiermodellen ermöglichen die Untersuchung genetisch vererbbarer Erkrankungen, Entwicklung und Toxikologie auf der Ebene des gesamten Organismus 1,2,3. Zebrafische bieten ein leistungsfähiges Modell, das in zahlreichen physiologischen Aspekten dem Menschen näher ist als murine oder humane Zellmodelle4. Eine breite Palette genetischer Werkzeuge und Strategien wurde im Zebrafisch sowohl für das Vorwärts-als auch für das umgekehrte genetische Screening....
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Protokoll
Studien mit Zebrafischen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Verfahren des Simon Fraser University Animal Care Committee und des Canadian Council of Animal Care durchgeführt und gemäß Protokoll # 1264K-18 abgeschlossen.
1. Design von CRISPR-Komponenten für präzise Bearbeitungen
- Um die Zwei-sgRNA-Leitfäden zu entwerfen, die zum Exzisieren der Sequenz mit der KI-Zielstelle verwendet werden, identifizieren Sie zunächst den Zebrafisch-Ortholog für das interessierende Gen.
HINWEIS: Abbildung 2 bietet einen zusammenfassenden Überblick über die Schritte zum Entwickeln präzis....
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Ergebnisse
Die erfolgreiche Verwendung dieses Zwei-sgRNA-Exonersatz-CRISPR-Ansatzes wird durch die Einführung und einfache Detektion einer präzisen Bearbeitung zur Entwicklung der LQTS-assoziierten Variante R56Q im zkcnh6a-Gen im Zebrafisch unterstrichen. Abbildung 6 zeigt repräsentative 3 dpf-Larven, die im einzelligen Embryostadium wie oben beschrieben mit CRISPR-Komponenten injiziert wurden. Abbildung 6A zeigt das Vorhandensein der YFP mVenus-Reportergenexpress.......
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Diskussion
Die Entwicklung präziser Genbearbeitungen mit CRISPR-Cas9 wird durch die geringe Effizienz von HDR-Mechanismen und deren effiziente Detektion herausgefordert. Hier wird ein CRISPR-Cas9-basierter Zwei-sgRNA-Exonersatzansatz beschrieben, der präzise Schnitte im Zebrafisch mit einfacher visueller Erkennung positiver Bearbeitungen erzeugt. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wird durch die Erzeugung präziser Bearbeitungen im zkcnh6a-Gen nachgewiesen. Diese Arbeit zeigt, wie die Herzfunktion in geneditierten Zebrafischla.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch ein Canadian Institutes of Health Research Project Grant (T.W.C.) und Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants (T.W.C.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastruktur | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petrischale | VWR | ||
| Blackfly USB3 Kamera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraktionskit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transkriptionskit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Inkubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transkriptionskit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spektralphotometer | Nanodrop | ||
| PCR Aufreinigungskit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Gerät | ||
| PowerPac Basic Netzteil | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroskop | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Elektrophoresesystem | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafischgehäuse System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gensynthese | Genewiz | ||
| Sanger Sequenzierung | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| beta; Kompetente Zellen | NEB | ||
| 10X PCR-Puffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nukleotidmischung | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuklease mit Puffer | NEB | ||
| BsaI Endonuklease mit Puffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blauer bakterieller Agarstab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuklease mit Puffer | NEB | ||
| Glycerin | |||
| Sigma | |||
| HindIII Endonuklease mit Puffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue | Addgen | ||
| MS-222 (Tricain) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bakterieller Agar-Stab) | Addgen | ||
| PmeI Endonuklease mit Puffer | NEB | ||
| Natriumhydroxid | Sigma | ||
| T4 Ligase mit Puffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Puffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochlorid | Sigma | ||
| XhoI Endonuklease mit Puffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Komponentenlieferant | ||
| Glühpuffer (pH 7,5-8,0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM | EDTA Sigma | ||
| E3 Medien (pH 7,2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0,17 mM KCl | Sigma | ||
| 0,33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0,33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injektionspuffer (pH 7,5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
Referenzen
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models.
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Nachdrucke und Genehmigungen
