Abschätzung der Ausbeute von Compounds auf der TLC-Platte mittels Blue-LED-Beleuchtungstechnik

Die Dünnschichtchromatographie (TLC) ist als qualitative und quantitative Technik auf dem Gebiet der organischen Chemie weit verbreitet ^1,2,3. Die Hauptvorteile von TLC sind, dass es eine schnelle Erkennung und flexible Probenanforderungen bietet und keine spezielle Ausrüstung erfordert⁴. Obwohl viele fortschrittliche Ansätze etabliert wurden, ist TLC bis heute die Hauptmethode zur Identifizierung unbekannter Proben in einem Gemisch. Die Herausforderung dieses Ansatzes ist jedoch der Mangel an sicheren und kostengünstigen Geräten zur Quantifizierung der Probenausbeute, insbesondere für Entwicklungslaboratorien mit begrenzten Budgets. Die vorliegende Studie zielte daher darauf ab, eine effiziente, sichere und kostengünstige Methode in Kombination mit TLC zu entwickeln, um die Ausbeute der Proben abzuschätzen.

Im Gegensatz zu Hochleistungs-TLC (HPTLC), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Gaschromatographie (GC) mit strengen Probenanforderungen, zeitaufwändig und Mehrschritt-Beteiligung für die Probenvorbereitung ^1,5 zeigte TLC mehrere Vorteile. Erstens können HPLC und GC für die Probenvorbereitung den Rohextrakt nicht nachweisen, da der Rohextrakt die Säule von HPLC und GC verstopfen kann. Zweitens, wenn die Proben nicht UV-geeignet sind (wichtig für die HPLC-Analyse) oder mit geringer Flüchtigkeit (wichtig für die GC-Analyse), kann TLC auf diese Proben angewendet werden, und die Verwendung von Visualisierungsreagenz macht die isolierten Proben auf dünnen Schichten^{sichtbar 6,7,8}. Drittens erfordern HPLC und GC für allgemeine Anwender im Vergleich zu TLC im Allgemeinen ein relativ langes Vortraining, bevor sie unabhängig arbeiten können. Darüber hinaus kann die quantitative TLC-Analyse, bekannt als Hochleistungs-TLC (HPTLC), die Informationen auf einer TLC-Platte mit einem hochempfindlichen Scanner digitalisieren. Die Kosten für das HPTLC-System sind jedoch relativ teuer. Daher ist die Entwicklung eines kostengünstigen und schnellen Ansatzes zur Quantifizierung von Proben auf der TLC-Platte ein wichtiges Thema.

Ähnliche Methoden wurden für die TLC-Ertragsquantifizierung entwickelt; Zum Beispiel berichtete Johnson⁹ über eine Technik, die die Quantifizierung der Proben auf einer TLC-Platte ermöglicht, indem ein Flachbettscanner verwendet wird, der an einen Computer angeschlossen ist. Im Jahr 2001 entwickelten El-Gindy et al.10 die TLC-densitometrische Methode, mit der die Verbindung mit optischer Dichte nachgewiesen wurde, und die Technik wurde auch von Elkady et ^al.11 angewendet. Im Jahr 2007 präsentierte Hess² die digital enhanced-TLC (DE-TLC) Methode, die angewendet wird, um die Ausbeute einer Verbindung auf einer TLC-Platte mit einer Digitalkamera in Kombination mit UV-Licht zu detektieren. Hess verglich auch die Kostenunterschiede zwischen HPTLC- und DE-TLC-Methode und kam zu dem Schluss, dass die DE-TLC-Methode aufgrund ihrer erschwinglichen Kosten in High-School- und College-Labors verwendet werden könnte². Die Kosten für die TLC-densitometrische Methode waren jedoch immer noch teuer, und der Betrieb von ultraviolettem Licht erfordert eine angemessene Vorschulung, falls die Benutzer ultravioletter Strahlung ausgesetzt werden könnten. Daher ist es wünschenswert, in Übereinstimmung mit TLC eine effiziente, sichere und kostengünstige Methode zur Quantifizierung der Probenausbeute zu entwickeln.

Die vorliegende Studie beschrieb ein Protokoll zur Detektion der Probe auf einer TLC-Platte unter Verwendung des blauen LED-Illuminators und entwickelte ein Regressionsmodell mit hoher Zuverlässigkeit (hoher R-Quadrat-Wert), um die Abmessungen der Bänder zu messen und dann die Wirkstoffausbeute zu bestimmen. Schließlich wurde festgestellt, dass die Blau-LED-Beleuchtungsmethode eine relativ sichere (vs. UV-Detektionsmethode), billig (vs. GC, HPLC und HPTLC) und effektiver (vs. Bioassay-Methode) Ansatz zur Ertragsquantifizierung.

Das vorliegende Protokoll wird am Beispiel von Lovastatin beschrieben. Lovastatin wurde aus dem eine Woche alten Aspergillus terreus extrahiert.

1. Extraktion von Verbindungen

HINWEIS: Einzelheiten zur Extraktion von Verbindungen finden Sie in Abbildung 1.

1. Kultur Aspergillus terreus auf dem Medium Kartoffeldextrose (PDA, siehe Materialtabelle) bei 30 °C.
2. Die Kultur wird 24 h bei 40 °C getrocknet. Die getrocknete Kultur wird mit einer sterilisierten Pinzette in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 15 mL Ethylacetat hinzugefügt.
3. Die Mischung 1 min lang kräftig durch Wirbeln schütteln und 1 h bei 40 °C mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren.
4. Das Gemisch mit einem 40 kHz Ultraschallbad (siehe Materialtabelle) bei 40 °C für 1 h beschallen.
5. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und filtrieren Sie durch ein 11 μm Filterpapier.
6. Extrahieren Sie das Filtrat mit einer gleichen Menge sterilen Wassers in einem Scheidetrichter.
7. Nach der Phasentrennung die organische Schicht sammeln und dann in einem Rotationsverdampfer verdampfen (siehe Materialtabelle). Der Rückstand wird in 2 mL Ethylacetat gelöst.

2. Trennung des Rohextrakts durch Normalphasenadsorptionssäule (NP)

1. Packen Sie die Säule mit NP-Kieselgel als stationäre Phase und verwenden Sie n-Hexan:Ethylacetat:Trifluoressigsäure (H:E:T; 80:20:0,1, v/v/v) als mobile Phase.
2. Laden Sie 2 mL des Extrakts (Schritt 1) auf die Säule und fügen Sie das Lösungsmittel der mobilen Phase mit einer Flussrate von 1 ml / min hinzu, um den Extrakt zu eluieren.
   HINWEIS: Der Durchfluss wurde manuell mit einem Absperrhahn gesteuert.
3. Überprüfen Sie das Abwasser durch TLC, um das Vorhandensein von Lovastatin zu bestätigen, und verdampfen Sie dann in einem Rotationsverdampfer bei 45 °C, bis das Lösungsmittel entfernt ist. Dieser Schritt dauert ca. 20-25 min.
4. Der Rückstand wird in 1 ml Ethylacetat gelöst und dann mit einem gleichen Volumen von 1% Trifluoressigsäure gemischt.
5. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 5.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur und sammeln Sie die organische Schicht in einem neuen Glasröhrchen.

3. Herstellung und Beladung von Dünnschichtchromatogrammplatten (TLC)

1. 5 μL Proben und Lovastatin-Standards (siehe Materialtabelle) mit einer Kapillarpipette auf die Grundlinie der TLC-Platte setzen, wobei an den Seiten der TLC-Platte ein Rand von 1 cm verbleibt.
2. Trocknen Sie die TLC-Platte in einem Abzug für 5 min bei Raumtemperatur.
3. Legen Sie die Platte vorsichtig mit einer Pinzette in eine gesättigte Glaskammer, die das Lösungsmittel der mobilen Phase enthält. Decken Sie die Kammer mit einem Glasdeckel ab und lassen Sie die Platte vollständig entfalten.
4. Entfernen Sie die Platte aus der Kammer, wenn die Lösungsmittellinie 1 cm von der Oberseite der Platte entfernt ist.

4. Analyse durch die blaue LED-Beleuchtung

1. Markieren Sie die Lösungsmittellinie mit einem Bleistift. Trocknen Sie die Platte im Abzug für 10 min bei Raumtemperatur.
2. Nach dem Trocknen die Platte sofort in 10%_H2SO4 Lösungsmittel einweichen und anschließend 10 min bei Raumtemperatur im Abzug trocknen.
3. Legen Sie die Platte auf die Heizplatte, bis die braunen Flecken erscheinen. Stellen Sie sicher, dass die Platte nicht überhitzt ist, da dies die Visualisierung von Lovastatin erschweren könnte.
4. Übertragen Sie die Platte auf die blaue LED-Beleuchtung und scannen Sie mit einer kompatiblen Freeware (MiBio Fluo) (siehe Materialtabelle).

5. Ertragsschätzung durch das Regressionsmodell

1. Messen Sie die Abmessungen von Bändern mit der ImageJ-Software (siehe Materialtabelle).
2. Erstellen Sie ein Regressionsmodell mit Datenanalyse- und Grafiksoftware (siehe Materialtabelle), das auf den absteigenden Konzentrationen der Lovastatin-Standards basiert, einschließlich 1 mg / ml, 0,75 mg / ml, 0,5 mg / ml und 0,25 mg / ml.
3. Wenden Sie das Regressionsmodell an, um die Ausbeute der Stichproben zu schätzen.

In dieser Studie wurde die Blue-LED-Beleuchtungsmethode zur Abschätzung der Ausbeute von Verbindungen vorgestellt, und diese Methode wurde validiert und mit Bioassay- und UV-detektierten Methoden verglichen (Tabelle 1). Die Regressionsmodelle wurden basierend auf den Dimensionen der Banden und der Konzentration von Standards für jeweils drei Methoden entwickelt, um die Ausbeute von Proben vorherzusagen. Erstens betrug in den Ergebnissen der Bioassay-Methode das R-Quadrat zwischen den Dimensionen der Hemmzone und den Lovastatin-Standards 0,99, und die Probenausbeute betrug 0,56 mg, die vom Regressionsmodell vorhergesagt wurde (Abbildung 2). Zweitens betrug bei der UV-Detektionsmethode das R-Quadrat zwischen den Lovastatin-Standards und der Dimension der Banden auf der TLC-Platte 0,97, und die Ausbeute der vom Regressionsmodell vorhergesagten Probe betrug 0,53 mg (Abbildung 3). Bemerkenswerterweise waren die Ränder des Bandes verschwommen und relativ niedrige Signalintensitätsbänder wurden beobachtet (Abbildung 3A). Drittens betrug bei der Blau-LED-Beleuchtungsmethode das R-Quadrat zwischen Lovastatin-Standards und der Dimension der Bänder auf der TLC-Platte 0,98, und die Probenausbeute betrug 0,54 mg, die vom Regressionsmodell vorhergesagt wurde (Abbildung 4). Die vorhergesagte Ausbeute mit dem Blue-LED-Illuminator lag näher an der Bioassay-Methode (als Kontrolle eingestellt). Die Dimension des Bandes war proportional zur Menge an Lovastatin, und die klaren Bänder wurden durch die Blau-LED-Beleuchtungsmethode erhalten. Darüber hinaus betrug die Arbeitszeit der Bioassay-, UV-detektierten und Blue-LED-Beleuchtungsmethoden ca. 24 h, 2 h bzw. 1 h; (Anmerkung: Arbeitsstunde bedeutet die Gesamtzeit, die für die Ertragsuntersuchung von Lovastatin aufgewendet wird).

Abbildung 1: Der Arbeitsablauf des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Bioassay-Methode. (A) Bioassay von Lovastatin gegen Neurospora crassa (inkubiert für 24 h bei 30 °C). Am Ende des Versuchs wurden die 90-mm-Agarplatten unter sichtbarem Licht fotografiert. (B) Die Konzentrationen von sechs Lovastatin-Standards waren: Nr. 1 (1 mg / ml), Nr. 2 (0,75 mg / ml), Nr. 3 (0,5 mg / ml) und Nr. 4 (0,25 mg / ml). Probe Nr. 5 wurde auf 0,25× (1:4) verdünnt. Probe Nr. 6 wurde auf 0,5× (1:2) verdünnt. Die Inhibitionszonendimension (mm2) wurde mit der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, die auf der Hemmzonendimension von Standards basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Dünnschichtchromatogramm (TLC)-Platte unter UV-Licht. (A) Das n-Hexan:Ethylacetat (2:3 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet, und die TLC-Platte wurde nach Einweichen in den Entwickler UV-Licht (365 nm) ausgesetzt (10%H2SO4). (B) Die Konzentrationen von sechs Lovastatin-Standards waren: Nr. 1 (1 mg / ml), Nr. 2 (0,75 mg / ml), Nr. 3 (0,5 mg / ml) und Nr. 4 (0,25 mg / ml). Probe Nr. 5 wurde auf 0,25× (1:4) verdünnt. Probe Nr. 6 wurde auf 0,5× (1:2) verdünnt. Die Inhibitionszonendimension (mm2) wurde mit der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Lovastatin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Dünnschichtchromatogramm (TLC), gescannt mit der blauen LED-Beleuchtung. (A) Das n-Hexan:Ethylacetat (2:3 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet, und die TLC-Platte wurde von der blauen LED-Beleuchtung gescannt. (B) Die Konzentrationen von sechs Lovastatin-Standards waren: Nr. 1 (1 mg / ml), Nr. 2 (0,75 mg / ml), Nr. 3 (0,5 mg / ml) und Nr. 4 (0,25 mg / ml). Probe Nr. 5 wurde auf 0,25× (1:4) verdünnt. Probe Nr. 6 wurde auf 0,5× (1:2) verdünnt. Die Inhibitionszonendimension (mm2) wurde mit der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Lovastatin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Vergleich der drei in dieser Studie verwendeten Nachweismethoden.

Tabelle 2: Vergleich früherer Methoden und der aktuellen Studie.

Ergänzende Abbildung 1: Die Dünnschichtchromatogrammplatte (TLC) mit Ampicillin wurde mit dem Blue-LED-Beleuchtungsverfahren abgetastet. (A) Ethylacetat:Methanol (9:13 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet, und die TLC-Platte wurde von der blauen LED-Beleuchtung gescannt. (B) Die Konzentration von vier Ampicillin-Standards war: Nr. 1 (100 mg/ml), Nr. 2 (75 mg/ml), Nr. 3 (50 mg/ml) und Nr. 4 (25 mg/ml). Die Abmessungen der Bänder wurden von der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Ampicillin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Dünnschichtchromatogramm (TLC)-Platte mit Apramycin, abgetastet durch das Blue-LED-Beleuchtungsverfahren. (A) Methanol:Wasser (6:5 v/v) wurde als mobile Phase in der TLC-Analyse verwendet und die TLC-Platte wurde von der blauen LED-Beleuchtung gescannt. (B) Die Konzentration von vier Apramycin-Standards war: Nr. 1 (50 mg/ml), Nr. 2 (40 mg/ml), Nr. 3 (30 mg/ml) und Nr. 4 (20 mg/ml). Die Abmessungen der Bänder wurden von der Bildgebungssoftware gemessen. (C) Es wurde ein Regressionsmodell unter Verwendung von Datenanalyse- und Grafiksoftware entwickelt, das auf der Dimension der Apramycin-Standardbänder auf der TLC-Platte basiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.