Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल डीएनए एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के बीच बंधन के जुड़ाव और पृथक्करण कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए इज़ोटेर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) के उपयोग का वर्णन करता है, जिसमें नमूना तैयार करना, मानक चलाना और नमूने शामिल हैं, और परिणामी डेटा की व्याख्या करना शामिल है।
Abstract
एपटामर और उसके लक्ष्य के बीच बाध्यकारी आत्मीयता और व्यवहार का निर्धारण आवेदन के लिए एपटामर का चयन और उपयोग करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। एपटामर और छोटे अणुओं के बीच भारी अंतर के कारण, वैज्ञानिकों को उनके बाध्यकारी गुणों को चिह्नित करने में बहुत प्रयास करने की आवश्यकता है। आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) इस उद्देश्य के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। आईटीसी विघटन स्थिरांक (केडी) को निर्धारित करने से परे जाता है और समाधान चरण में दो अणुओं के बीच बातचीत के थैलेपी परिवर्तन और बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री प्रदान कर सकता है। यह दृष्टिकोण लेबल-मुक्त अणुओं का उपयोग करके निरंतर अनुमापन का संचालन करता है और प्रत्येक अनुमापन द्वारा उत्पादित बाध्यकारी घटनाओं पर समय के साथ जारी गर्मी को रिकॉर्ड करता है, इसलिए प्रक्रिया मैक्रोमोलेक्यूल्स और उनके छोटे लक्ष्यों के बीच बंधन को संवेदनशील रूप से माप सकती है। यहां, लेख एक छोटे लक्ष्य, टेट्रासाइक्लिन के साथ चयनित एपटामर के आईटीसी माप की चरण-दर-चरण प्रक्रिया का परिचय देता है। यह उदाहरण तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा और अन्य अनुप्रयोगों के लिए इसकी क्षमता को साबित करता है।
Introduction
एपटामर एसएसडीएनए या आरएनए टुकड़े हैं जिन्हें वांछित लक्ष्य 1,2 के लिए उच्च बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता के साथ एक विकास प्रक्रिया के माध्यम से चुना जाता है, जो उन्नत पहचान तत्वों या रासायनिक एंटीबॉडी 3,4,5 के रूप में काम कर सकते हैं। इस प्रकार, अपने लक्ष्यों के लिए एपटामर की बाध्यकारी आत्मीयता और विशिष्टता एक एपटामर के चयन और आवेदन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, और इन लक्षण वर्णन उद्देश्यों के लिए आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। एपटामर के संबंध को निर्धारित करने के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है, जिसमें आईटीसी, सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर), कलरमेट्रिक अनुमापन, माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस (एमएसटी), और बायो-लेयर इंटरफेरोमेट्री (बीएलआई) शामिल हैं। उनमें से, आईटीसी समाधान चरण में दो अणुओं के थर्मोडायनामिक और गतिज संघ को निर्धारित करने के लिए नवीनतम तकनीकों में से एक है। यह दृष्टिकोण लेबल-मुक्त अणुओं का उपयोग करके निरंतर अनुमापन का संचालन करता है और प्रत्येक अनुमापन 6,7 द्वारा उत्पादित बाध्यकारी घटनाओं पर समय के साथ जारी गर्मी को रिकॉर्ड करता है। अन्य तरीकों के विपरीत, आईटीसी बाध्यकारी आत्मीयता, कई बाध्यकारी साइटों और थर्मोडायनामिक और गतिज संघ (चित्रा 1 ए) की पेशकश कर सकता है। इन प्रारंभिक मापदंडों से, गिब्स मुक्त ऊर्जा परिवर्तन और एन्ट्रॉपी परिवर्तन निम्नलिखित संबंधों का उपयोग करके निर्धारित किए जाते हैं:
त्रिभुज = त्रिभुज-T==================================================================
इसका मतलब है कि आईटीसी बाध्यकारी तंत्र (चित्रा 1 बी) को स्पष्ट करने के लिए आणविक बातचीत का एक पूर्ण थर्मोडायनामिक प्रोफ़ाइल प्रदान करता है। एपटामर और लक्ष्य के बीच काफी अलग आकारों के कारण एपटामर के साथ छोटे अणुओं के लिए बाध्यकारी संबंध का निर्धारण करना मुश्किल है। इस बीच, आईटीसी अणुओं को लेबल और स्थिर किए बिना संवेदनशील माप प्रदान कर सकता है, जो माप के दौरान एपटामर और लक्ष्य की प्राकृतिक संरचना को बनाए रखने का साधन प्रदान करता है। उल्लिखित विशेषताओं के साथ, आईटीसी का उपयोग एपटामर और छोटे लक्ष्यों के बीच बंधन के लक्षण वर्णन के लिए मानक विधि के रूप में किया जा सकता है।
गु समूह द्वारा चयन के बाद, इस एपटामर को विभिन्न प्लेटफार्मों के साथ एकीकृत किया गया था, जिसमें इलेक्ट्रोकेमिकल एपटामर-आधारित बायोसेंसर, एक प्रतिस्पर्धी एंजाइम-लिंक्ड एपटामर परख और एक माइक्रोटिटर प्लेट शामिल है, जो टेट्रासाइक्लिन 8,9,10 के उच्च-थ्रूपुट डिटेक्शन को प्राप्त कर सकता है। हालांकि, इसकी बाध्यकारी विशेषताओं को उचित मंच8 चुनने के लिए पर्याप्त रूप से स्पष्ट नहीं किया गया है; यह आईटीसी का उपयोग करके टेट्रासाइक्लिन के लिए एपटामर के बंधन को चिह्नित करने के लायक है।
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Protocol
नोट: चित्रा 2 डीएनए एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के थर्मोडायनामिक और गतिज संघ को निर्धारित करने के लिए आईटीसी प्रयोग के मुख्य चरणों को दर्शाता है।
1. नमूने तैयार करना
नोट: आईटीसी के लिए नमूने एपटामर और लिगैंड दोनों के लिए एक ही बफर में तैयार करने की आवश्यकता होती है ताकि नमूना सेल और सिरिंज से अलग-अलग बफर को मिलाने के कारण गर्मी रिलीज से बचा जा सके। यह आमतौर पर एक ही बफर में सभी सामग्रियों के डायलिसिस के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। बफर का आदान-प्रदान कुछ संशोधनों के साथ 3 केडीए आणविक भार कटऑफ (एमडब्ल्यूसी) कंसंट्रेटर के प्रोटोकॉल से अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया जाता है, जैसा कि नीचे दिया गया है:
- निम्नलिखित चरणों का उपयोग करके निर्माता से खरीदे गए 1x PBS, pH 7.4 के साथ डायलिसिस कॉलम (3 kDA MWC) की झिल्ली को सक्रिय करें: 1x बफर (PBS) से भरें, RT पर 10 मिनट के लिए समतुल्य करें, और 15 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- बफर को हटा दें और कॉलम में एपटामर नमूनों के 500 μL लोड करें, 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और 1x PBS के लिए मूल बफर का आदान-प्रदान करने के लिए इसे 4x दोहराएं। जब बफर झिल्ली के माध्यम से जाता है, तो 3 केडीए से कम द्रव्यमान वाले सभी अणु झिल्ली के माध्यम से जाएंगे, और एपटामर झिल्ली के ऊपरी हिस्से पर रहेगा।
- एक पिपेट का उपयोग करके डायलाइज्ड डीएनए एपटामर एकत्र करें और इसे नई 1.5 एमएल ट्यूब (ओं) में स्थानांतरित करें।
- टेट्रासाइक्लिन को भंग करने के लिए बफर के माध्यम से अंतिम प्रवाह एकत्र करें। टेट्रासाइक्लिन पाउडर शुद्ध और छोटा है, इसलिए डायलिसिस की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, लक्ष्य के लिए डीएनए के लिए पिछले डायलाइज्ड बफर का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सिरिंज में प्रयोग के लिए बफर संदर्भ सेल में बफर से मेल खाता है।
- यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके फिर से एपटामर एकाग्रता निर्धारित करें। एकाग्रता को 40 μM टेट्रासाइक्लिन और 2 μM एपटामर में समायोजित करने के लिए अंतिम विनिमय बफर का उपयोग करें।
- डीएनए एपटामर को 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके मोड़ें, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें, और फिर 20 मिनट के लिए आरटी पर लौटें।
- विघटित गैसों को खत्म करने के लिए 25 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 600 मिमीएचजी पर सेट किए गए डिगैसिंग स्टेशन या वैक्यूम पंप का उपयोग करके मुड़े हुए एपटामर और डायलाइज्ड टेट्रासाइक्लिन को डिगैस करें।
2. उपकरण को धोना और परीक्षण किट चलाना
- यह सुनिश्चित करने के लिए विलायक बंदरगाहों को साफ करें कि पूरा नमूना पथ स्पष्ट है। अपशिष्ट समाधान को त्यागकर और उन्हें शुद्ध मेथनॉल, पानी और बफर के साथ लोड करके साफ करें। सफाई के लिए पर्याप्त समाधान सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक बंदरगाह में 250 एमएल से अधिक होता है।
नोट: सफाई प्रक्रिया स्वचालित रूप से उपयोगकर्ता-प्रोग्राम करने योग्य आईटीसी नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा पूरी की जाती है। - बफर का उपयोग करके आईटीसी को बफर में चलाकर मशीन की स्वच्छता का परीक्षण करें (यानी, 1x PBS में 1x PBS)।
नोट: बफर इंजेक्शन चोटियों में छोटे बफर के बीच एक सामान्य शोर आधार रेखा दिखाई देती है। जब अनुमापन सिरिंज और कैनुला को पर्याप्त रूप से साफ किया जाता है और पूरी तरह से सूखा होता है, तो बेसलाइन स्थिर होगी; बेसलाइन में वृद्धि या कमी उपकरण के अंदर गंदे इंस्ट्रूमेंटेशन या बुलबुले को दर्शाती है, जिन्हें वास्तविक नमूने चलाने से पहले ठीक करने की आवश्यकता होती है। - डिफ़ॉल्ट प्रोग्राम का उपयोग करके और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, एक मानक किट के साथ मशीन की सटीकता का परीक्षण करें जिसमें ईडीटीए और सीएसीएल2 (चित्रा 3) शामिल हैं।
3. एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के बीच बंधन निर्धारित करने के लिए नमूना चलाना
- रनिंग पैरामीटर सेट करें: 200 आरपीएम की एक सरगर्मी दर, 25 डिग्री सेल्सियस, 2 μM एपटामर और 40 μM टेट्रासाइक्लिन पर चल रही है, प्रत्येक 2.0 μL के साथ 30 इंजेक्शन, 180 सेकंड का विलंब समय।
- चल रहे प्रोग्राम कैलकुलेटर का उपयोग करके आवश्यक वॉल्यूम की जांच करें। इस चल रहे पैरामीटर के साथ, आईटीसी सिरिंज में 40 μM टेट्रासाइक्लिन के 230 μL और ITC नमूना सेल में 2 μM एपटामर के 485 μL के साथ आईटीसी माप करें।
- एक पिपेट का उपयोग करके बुलबुले से बचते हुए, डायलाइज्ड टेट्रासाइक्लिन सिरिंज प्लेटों और मुड़े हुए एपटामर को नमूना सेल में लोड करें।
- सॉफ्टवेयर पर स्टार्ट बटन पर क्लिक करके आईटीसी इंस्ट्रूमेंट चलाना शुरू करें।
नोट: आईटीसी उपकरण चलाने की प्रक्रिया मैन्युअल रूप से संदर्भ सेल और टिट्रेंट नमूना प्लेटों को भरने के बाद पूरी तरह से स्वचालित है।
4. सॉफ्टवेयर का उपयोग करडेटा का विश्लेषण
- डेटा का विश्लेषण प्रारंभ करने के लिए डबल क्लिक करके डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें.
- बाइंडिंग की प्रवृत्ति जानने के लिए सहेजे गए कच्चे डेटा का रास्ता खोलें।
- मॉडलिंग टैब खोलें और डेटा वक्र के लिए सबसे अच्छा फिट खोजने के लिए विभिन्न बाइंडिंग मॉडल का उपयोग करें। फिर, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से आईटीसी थर्मोग्राम और विभिन्न थर्मोडायनामिक मापदंडों की गणना करता है, जिसमें थैलेपी (एएच), एन्ट्रॉपी (एजीएस), मुक्त ऊर्जा (एजी), संतुलन बाध्यकारी स्थिरांक (केए), और स्टोइकोमेट्री शामिल हैं।
- डेटा और फिटिंग मॉडल जानकारी से निर्धारित थर्मोडायनामिक मापदंडों को एकत्र करें।
- आईटीसी थर्मोग्राम और विभिन्न थर्मोडायनामिक मापदंडों के चित्रों सहित एक रिपोर्ट बनाएं, जैसा कि चित्रा 4 और तालिका 1 में दिखाया गया है।
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Representative Results
आईटीसी एक सटीक विघटन स्थिरांक (केडी), बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री और दो-अणु इंटरैक्शन के थर्मोडायनामिक पैरामीटर प्रदान करताहै। इस उदाहरण में, किम एट अल.9,11 द्वारा चुना गया एपटामर टेट्रासाइक्लिन को केडी 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM के बाध्यकारी समानताओं के साथ बांधता है। दिलचस्प बात यह है कि इस बाइंडिंग को संतुलन निस्पंदन विधि और 63.3 एनएम के एक रिपोर्ट किए गएकेडी का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जो अनुकूल बाध्यकारी साइट (साइट 2) से बहुत अलग नहीं है। आईटीसी से फिटिंग मॉडल और स्टोइकोमेट्री दर्शाता है कि एपटामर अनुक्रमिक बाइंडिंग मॉडल (चित्रा 4, तालिका 1) के साथ 2: 1 बाध्यकारी अनुपात के माध्यम से टेट्रासाइक्लिन से बांधता है।
साइट 2 के लिए आईटीसी माप द्वारा निर्धारित थर्मोडायनामिक पैरामीटर (एएच = -1200 किलो कैलोरी / मोल और -टीएचएस = 99.75 किलो कैलोरी / मोल) ने संकेत दिया कि अपेक्षाकृत महत्वपूर्ण एंट्रोपिक हानि पर काबू पाने वाली थैलेपी मजबूत बंधन को प्रेरित करती है। एन्ट्रॉपी हानि के साथ थैलेपी-संचालित बंधन आरएनए-विरूपण परिवर्तनों से संबंधित है, जिन्हें आरएनए और एक छोटे अणु के बीच बाध्यकारी व्यवहार के रूप में रिपोर्ट किया गया है। उदाहरण के लिए, थोआ एट अल ने आरएनए एपटामर और आरयू (बीपीवाई) 3 12 के बीच इस तरह के बाध्यकारी व्यवहार (एएच = -27 किलो कैलोरी / मोल और -टीएक्स = +17 किलो कैलोरी / मोल) की सूचना दी। इसके अलावा, होरोविट्ज़ एट अल ने संकेत दिया कि एन्ट्रॉपी-संचालित बाइंडिंग एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (एएच = -2.6 किलो कैलोरी / मोल और -टीओएस = -3.3 किलो कैलोरी / मोल) 13 के लिए प्रोफ्लेविन के अंतःक्रिया से जुड़ी हुई है। इन तुलनाओं के आधार पर, एपटामर थैलेपी-संचालित बाइंडिंग पर स्विचिंग-संरचनात्मक व्यवहार के साथ कार्य करता है, जिससे एक सीधे सेंसर के विकास के लिए मान्यता के रूप में एपटामर का उपयोग करने की अनुमति मिलती है।
चित्रा 1: बाध्यकारी विघटन स्थिरांक (केडी) और थर्मोडायनामिक प्रोफ़ाइल। (ए) आईटीसी बाध्यकारी विघटन स्थिरांक (केडी) और थर्मोडायनामिक प्रोफाइल की पहचान करता है, जिसमें थैलेपी (एएच) में परिवर्तन और एन्ट्रॉपी (एएफएस) में परिवर्तन शामिल है। (बी) थर्मोडायनामिक प्रोफाइल बातचीत की ताकत और तंत्र प्रदान करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: आईटीसी प्रयोग के मुख्य चरण। योजनाबद्ध डीएनए एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के थर्मोडायनामिक और गतिज संघ को निर्धारित करने के लिए आईटीसी प्रयोग के मुख्य चरणों को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: ईडीटीए और सीएसीएल2 के बीच आईटीसी मानक परीक्षण। Ca2+-EDTA चेलेशन का उपयोग आईटीसी को मान्य करने के लिए एक मानक प्रतिक्रिया के रूप में किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: डीएनए एपटामर और टेट्रासाइक्लिन का आईटीसी थर्मोग्राम। थर्मोडायनामिक और गतिज संघ का फिटिंग मॉडल दर्शाता है कि बाइंडिंग में दो स्वतंत्र बाध्यकारी साइटें हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| अनुक्रमिक दो साइट | केडी (एम) | 1.359 x 10-5 |
| केडी (एम) | 5.378 x 10-8 | |
| Hh (kcal/mol) | 1223 | |
| Hh (kcal/mol) | -1200 | |
| Ka (M¹) | 7.358 x 104 | |
| Ka (M¹) | 1.859 x 107 | |
| ΔS (cal/mol K) | 4.123 x 103 | |
| ΔS (cal/mol K) | -3.992 x 103 |
तालिका 1: एपटामर और टेट्रासाइक्लिन के बीच बंधन के पैरामीटर। विभिन्न थर्मोडायनामिक पैरामीटर, जिनमें थैलेपी (ओएच), एन्ट्रॉपी (एडब्ल्यूएस), मुक्त ऊर्जा (एजी), संतुलन बाध्यकारी स्थिरांक (केए), और स्टोइकोमेट्री शामिल हैं, को दो अणुओं के बाध्यकारी तंत्र द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
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Discussion
यहां प्रस्तुत विधि को टीए इंस्ट्रूमेंट्स के निर्देश के अनुसार संशोधित किया गया था और हमारे केंद्र में कई चयनित एपटामर और लक्ष्यों के बाध्यकारी आत्मीयता और ऊष्मप्रवैगिकी को निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है। इस प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों में लिगैंड से मेल खाने वाले लक्ष्य के लिए बफर का आदान-प्रदान करना, उचित मापदंडों के साथ नमूने चलाना और डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त बाध्यकारी फिटिंग मॉडल ढूंढना शामिल है। गर्मी रिलीज की निरंतर रिकॉर्डिंग के लिए सभी शोर गर्मी को समाप्त करने की आवश्यकता होती है, जैसे कि बफर के बेमेल, सेल और सिरिंज की गंदगी और नमूनों के अंदर बुलबुले। बफर एक्सचेंज चरण में, लिगैंड को भंग करने के लिए डायलिसिस झिल्ली या स्पिन कॉलम में अंतिम डायलिसिस बफर या प्रवाह-थ्रू बफर का उपयोग करना बेहतर होता है क्योंकि छोटे अणुओं का सीधे आदान-प्रदान करना महंगा होता है।
अधिकांश अन्य बाध्यकारी आत्मीयता निर्धारण विधियां एपटामर और लिगैंड के बीच 1: 1 बाध्यकारी अनुपात मानती हैं। हालांकि, बाध्यकारी व्यवहार और छोटे अणुओं और एपटामर के बीच काफी अलग आकार के कारण, 1: 1 बाध्यकारी मॉडल हमेशा सटीकनहीं होता है 14,15। इस पहलू में, आईटीसी बाध्यकारी साइटों की संख्या जानने और बाध्यकारी व्यवहार 7,15 के बारे में जानकारी देने के लिए बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री पर डेटा दे सकता है। उस उन्नत फ़ंक्शन को आईटीसी विश्लेषण सॉफ्टवेयर से सही बाइंडिंग मॉडल का उपयोग करके प्रदान किया जा सकता है, या तो एक- या दो-साइट बाइंडिंग मॉडल। एक संतृप्त बिंदु का विश्लेषण 1: 1 (1 बाध्यकारी साइट), 1: 2, या 0.5: 1 (दो बाध्यकारी साइटों) के एक अलग बाध्यकारी अनुपात पर किया जा सकता है। अनुक्रमिक मॉडल के लिए, कोई अलग संतृप्त साइट नहीं है, लेकिन केवल संतृप्त साइटों की कुल संख्या है। यदि साइटें समान हैं, तो डेटा अनुक्रमिक संतृप्ति के साथ फिट होता है। वहां, पहली बाइंडिंग साइट में दूसरी साइट की तुलना में चुनने के लिए उसी तरह की अधिक खाली प्रतियां हैं, जैसा कि साइट से साइट 14,15,16 तक जारी गर्मी ऊर्जा में कमी से स्पष्ट है। बाइंडिंग पैरामीटर प्रत्येक बाइंडिंग साइट के लिए बाइंडिंग कॉन्स्टेंट K निर्धारित करते हैं। इस मामले में, यह दो अनुक्रमिक बाध्यकारी साइटों के साथ बंधन दिखाता है, जो समग्र अणु में संवहन परिवर्तन की पुष्टि करता है। यद्यपि आईटीसी एपटामर और छोटे अणुओं के बीच बंधन को चिह्नित करने के लिए कई उन्नत कार्य प्रदान करता है, अच्छी स्थितियों वाली अनुकूलन प्रक्रियामें समय 7,16,17 खर्च होता है। इसके अलावा, अन्य उपकरणों की तुलना में, आईटीसी उपकरण महंगा है और एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित तकनीशियन द्वारा हैंडलिंग की आवश्यकता होती है।
ज्यादातर मामलों में, एपटामर और एक छोटे अणु लिगैंड के बीच बाध्यकारी संबंध निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण है। आईटीसी को इस उद्देश्य के लिए एक उन्नत विधि माना जा सकता है क्योंकि आईटीसी अत्यधिक सटीक बाध्यकारी समानताओं के साथ-साथ थर्मोडायनामिक जानकारी प्रदान करता है। इस जानकारी से, हम नैदानिक उपयोग या पहचान के लिए इसका उपयोग करने के लिए इसके व्यवहार की भविष्यवाणी कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, दो बाइंडिंग साइटों के साथ चयनित एपटामर के साथ, हम इसे एक बाइंडिंग साइट रखने के लिए छोटा कर सकते हैं यदि एक साइट बाइंडिंग के लिए अनुकूल नहीं है, या हम एपटामर को दो एपटामर में विभाजित कर सकते हैं यदि दोनों बाइंडिंग साइटों का व्यवहार समान है। इसके अलावा, रचना संरचना परिवर्तन व्यवहार के साथ, हम एक सेंसर विकसित करने के लिए एपटामर को शमन मंच के साथ जोड़ सकते हैं।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस शोध को एप्टाजेन एलएलसी से अनुसंधान और विकास फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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