Experimentelle Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffabgabesystemen und Zellen in vitro: Ein Leitfaden für die präklinische Bewertung der Nanomedizin

Summary

Es wird ein Workflow für die absolute Quantifizierung von Wirkstoffträger-Zell-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie demonstriert, um eine bessere rationale Bewertung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zu ermöglichen. Dieser Workflow gilt für Arzneimittelträger aller Art.

Abstract

Eine wichtige Komponente bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen betrifft die Verstärkung oder Abschwächung von Interaktionen mit bestimmten Zelltypen. Zum Beispiel könnte ein Chemotherapeutikum mit einem Antikörper funktionalisiert werden, um die Bindung an Krebszellen zu verbessern ("Targeting") oder mit Polyethylenglykol funktionalisiert werden, um die Immunzellerkennung zu umgehen ("Stealth"). Selbst auf zellulärer Ebene ist die Optimierung der Bindung und Aufnahme eines Wirkstoffträgers ein komplexes biologisches Designproblem. Daher ist es wertvoll zu trennen, wie stark ein neuer Träger mit einer Zelle interagiert, von der funktionellen Wirksamkeit der Fracht eines Trägers, sobald er an diese Zelle geliefert wurde.

Um das chemotherapeutische Beispiel fortzusetzen, "wie gut es an eine Krebszelle bindet" ist ein separates Problem von "wie gut es eine Krebszelle tötet". Quantitative In-vitro-Assays für letztere sind gut etabliert und beruhen in der Regel auf der Messung der Lebensfähigkeit. Die meisten veröffentlichten Forschungsergebnisse zu Zellträgerinteraktionen sind jedoch qualitativ oder semiquantitativ. Im Allgemeinen beruhen diese Messungen auf fluoreszierender Markierung des Trägers und berichten folglich über Wechselwirkungen mit Zellen in relativen oder beliebigen Einheiten. Diese Arbeit kann jedoch standardisiert und mit einer kleinen Anzahl von Charakterisierungsexperimenten absolut quantitativ gemacht werden. Eine solche absolute Quantifizierung ist wertvoll, da sie rationale, klassen- und klasseninterne Vergleiche verschiedener Wirkstoffabgabesysteme ermöglicht - Nanopartikel, Mikropartikel, Viren, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, technisch hergestellte therapeutische Zellen oder extrazelluläre Vesikel.

Darüber hinaus ist die Quantifizierung Voraussetzung für nachfolgende Metaanalysen oder In-silico-Modellierungsansätze . In diesem Artikel werden Videoanleitungen sowie ein Entscheidungsbaum für das Erreichen einer In-vitro-Quantifizierung für Trägerarzneimittelabgabesysteme vorgestellt, die Unterschiede in der Trägergröße und der Kennzeichnungsmodalität berücksichtigen. Darüber hinaus werden weitere Überlegungen zur quantitativen Bewertung fortgeschrittener Wirkstoffabgabesysteme diskutiert. Dies soll als wertvolle Ressource dienen, um die rationale Bewertung und das Design für die nächste Generation von Medikamenten zu verbessern.

Introduction

Das Design von Medikamentenabgabekonstrukten, die je nach Zelltyp ein spezifisches, entworfenes Verhalten aufweisen, hat erhebliches Forschungsinteresse geweckt. Potenzielle Wirkstoffabgabekonstrukte oder "Träger" umfassen Lipidformulierungen, nanogewachsene anorganische Substanzen, polymere Anordnungen, extrazelluläre Vesikel, funktionalisierte Bakterienzellen oder modifizierte Viren. Alle diese können Organ-, Gewebe- oder Zellspezifität aufgrund physikalischer Eigenschaften, Oberflächeneigenschaften oder technischer chemischer Funktionalisierungen wie Antikörperbindung ^1,2 aufweisen.

Protocol

1. Auswahl des passenden Streams

1. Befolgen Sie die in Abbildung 1 dargestellte Entscheidungsstruktur, um den besten Workflow (Stream) (Abbildung 2) für den verwendeten Versuchsaufbau zu ermitteln. Weitere Kommentare zu dieser Stream-Auswahl finden Sie in der Diskussion.
2. Wenn Sie dem Zytometer-Stream folgen, fahren Sie mit den Schritten 2.1.1-2.2.7 fort. Wenn Sie dem Massenstream folgen, fahren Sie mit den Schritten 3.1.1.1-3.1.5.7 fort.

Results

Wie bereits erwähnt, erfordern verschiedene Wirkstoffträgertypen die Verwendung unterschiedlicher Techniken zur absoluten Quantifizierung der Zellträgerassoziation. Zum Beispiel sind 633 nm disulfidstabilisierte Poly(methacrylsäure) (_{PMA SH)} Kernschalenpartikel groß und dicht genug für die Detektion mit einem empfindlichen Durchflusszytometer. Als solche wurden diese Partikel fluoreszierend markiert, dann mit Seitenwinkellichtstreuung (SALS, analog zu SSC) sowie dem entsprechenden Fluoreszenzkanal angegungen u.......

Discussion

Die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffträgern und Zellen gewinnt bei der Entwicklung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zunehmend an Bedeutung. Insbesondere um die rationale Bewertung und den Vergleich verschiedener Trägerkonstrukte zu ermöglichen, ist die absolute Quantifizierung der Leistung des Trägers bei der Interaktion mit Ziel- und Off-Target-Zellen von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Zwei-Stream-Methodik, die es jedem Forscher, der mit einem Wirkstoffträger arbeite.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimid	Invitrogen	A20347	pH-stabiler Farbstoff zur Markierung von 150 nm, 235 nm oder 633 nm PMASHTrägern; Beispiel für einen guten Farbstoff zur Verwendung in Zell-Träger-Assoziationsstudien
Apogee A50 Microflow	Apogee Sensitives		Durchflusszytometer, das in der Lage ist, kleine Träger für die Zählung zu erkennen
CytoFLEX S Durchflusszytometer	Beckman Coulter		Empfindliches Durchflusszytometer, das in der Lage ist, kleine Träger für die Zählung und das Auslesen für abschließende Zellbarriere-Experimente zu erkennen
FCS Express	De Novo Software		Software zur Analyse von Durchflusszytometriedaten, d. h. zur Durchführung eines Gating und zur Ableitung von medianen Fluoreszenzintensitätswerten der gewählten Populationen. Zu den Alternativen gehören FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard-Mikroplatten-Reader-Gerät für Bulk-Fluoreszenzmessungen von Carriern in Lösung
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Weniger empfindliches Durchflusszytometer, aber eines, das Forschern allgemein zur Verfügung steht. Kann zum Auslesen des endgültigen Zellträgerexperiments verwendet werden
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument für die Analyse der Nanopartikelverfolgung
Prism 8	GraphPad		Software zum Darstellen und Berechnen von Standardkurven. Zu den Alternativen gehören Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python und viele andere
Quantum MESF-Kits, Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute Quantifizierungsbeads für die Durchflusszytometrie. Wird verwendet, um Fluoreszenzintensitäten, die in großen Mengen auf einem Mikroplatten-Reader gemessen werden, in Fluoreszenzintensitäten umzuwandeln, die auf einem Durchflusszytometer unter Verwendung des MESF-Standards gemessen werden