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Summary

Es wird ein Workflow für die absolute Quantifizierung von Wirkstoffträger-Zell-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie demonstriert, um eine bessere rationale Bewertung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zu ermöglichen. Dieser Workflow gilt für Arzneimittelträger aller Art.

Abstract

Eine wichtige Komponente bei der Entwicklung von Medikamentenabgabesystemen betrifft die Verstärkung oder Abschwächung von Interaktionen mit bestimmten Zelltypen. Zum Beispiel könnte ein Chemotherapeutikum mit einem Antikörper funktionalisiert werden, um die Bindung an Krebszellen zu verbessern (“Targeting”) oder mit Polyethylenglykol funktionalisiert werden, um die Immunzellerkennung zu umgehen (“Stealth”). Selbst auf zellulärer Ebene ist die Optimierung der Bindung und Aufnahme eines Wirkstoffträgers ein komplexes biologisches Designproblem. Daher ist es wertvoll zu trennen, wie stark ein neuer Träger mit einer Zelle interagiert, von der funktionellen Wirksamkeit der Fracht eines Trägers, sobald er an diese Zelle geliefert wurde.

Um das chemotherapeutische Beispiel fortzusetzen, “wie gut es an eine Krebszelle bindet” ist ein separates Problem von “wie gut es eine Krebszelle tötet”. Quantitative In-vitro-Assays für letztere sind gut etabliert und beruhen in der Regel auf der Messung der Lebensfähigkeit. Die meisten veröffentlichten Forschungsergebnisse zu Zellträgerinteraktionen sind jedoch qualitativ oder semiquantitativ. Im Allgemeinen beruhen diese Messungen auf fluoreszierender Markierung des Trägers und berichten folglich über Wechselwirkungen mit Zellen in relativen oder beliebigen Einheiten. Diese Arbeit kann jedoch standardisiert und mit einer kleinen Anzahl von Charakterisierungsexperimenten absolut quantitativ gemacht werden. Eine solche absolute Quantifizierung ist wertvoll, da sie rationale, klassen- und klasseninterne Vergleiche verschiedener Wirkstoffabgabesysteme ermöglicht – Nanopartikel, Mikropartikel, Viren, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, technisch hergestellte therapeutische Zellen oder extrazelluläre Vesikel.

Darüber hinaus ist die Quantifizierung Voraussetzung für nachfolgende Metaanalysen oder In-silico-Modellierungsansätze . In diesem Artikel werden Videoanleitungen sowie ein Entscheidungsbaum für das Erreichen einer In-vitro-Quantifizierung für Trägerarzneimittelabgabesysteme vorgestellt, die Unterschiede in der Trägergröße und der Kennzeichnungsmodalität berücksichtigen. Darüber hinaus werden weitere Überlegungen zur quantitativen Bewertung fortgeschrittener Wirkstoffabgabesysteme diskutiert. Dies soll als wertvolle Ressource dienen, um die rationale Bewertung und das Design für die nächste Generation von Medikamenten zu verbessern.

Introduction

Das Design von Medikamentenabgabekonstrukten, die je nach Zelltyp ein spezifisches, entworfenes Verhalten aufweisen, hat erhebliches Forschungsinteresse geweckt. Potenzielle Wirkstoffabgabekonstrukte oder “Träger” umfassen Lipidformulierungen, nanogewachsene anorganische Substanzen, polymere Anordnungen, extrazelluläre Vesikel, funktionalisierte Bakterienzellen oder modifizierte Viren. Alle diese können Organ-, Gewebe- oder Zellspezifität aufgrund physikalischer Eigenschaften, Oberflächeneigenschaften oder technischer chemischer Funktionalisierungen wie Antikörperbindung ^1,2 aufweisen.

Ein fast allgegenwärtiger Schritt in der In-vitro-Trägerbewertung besteht darin, Zellen mit einer Suspension zu inkubieren, die den medikamentenbeladenen Träger enthält. Nach der Inkubation wird die Trägerleistung über eine funktionale Anzeige der Leistung der Arzneimittelladung gemessen, z. B. Transfektionseffizienz oder Toxizität. Funktionale Anzeigen sind nützlich, da sie ein nachgelagertes Maß für die Wirksamkeit des Trägers sind. Für komplexere Wirkstoffabgabekonstrukte wird es jedoch immer wichtiger, über funktionale Messwerte hinauszugehen und den Grad der Trägerinteraktion mit der interessierenden Zelle separat zu quantifizieren. Dafür gibt es mehrere Gründe.

Erstens besteht ein zunehmendes Interesse an der Entdeckung (und iterativen Verbesserung) von “Plattform”-Trägertechnologien, die eine Vielzahl von Fracht transportieren können. Zum Beispiel können Lipid-Nanopartikel (LNPs), die RNA verkapseln sollen, eine RNA-Sequenz mit wenigen Einschränkungen gegen eine andere austauschen³. Um die Trägertechnologie iterativ zu verbessern, ist es daher wichtig, ihre Leistung unabhängig von der Frachtfunktionalität zu quantifizieren. Zweitens sind funktionale Anzeigen für die Ladung von Interesse möglicherweise nicht einfach und beeinträchtigen die Fähigkeit, Trägerformulierungen schnell zu iterieren und zu bewerten. Während man eine In-vitro-Optimierung mit einer Modellladung mit einer einfachen funktionellen Anzeige (z. B. Fluoreszenz) durchführen könnte, kann das Ändern der Ladung die biologische Reaktion auf einen Träger⁴ verändern und daher möglicherweise keine repräsentativen Ergebnisse liefern. Drittens sind viele Träger so konzipiert, dass sie mit einem bestimmten Zelltyp interagieren und von ihm aufgenommen werden. Eine solche Zielerfassung eines Trägers kann und sollte von der Leistung seines therapeutischen Frachtpostenziels unterschieden werden. Um das LNP-Beispiel fortzusetzen, könnte eine RNA-Fracht extrem potent sein, aber wenn das LNP nicht in der Lage ist, an die Zelle zu binden, internalisiert zu werden und die RNA freizusetzen, wird kein nachgeschalteter funktioneller Effekt beobachtet. Dies kann insbesondere für Träger, die schwer zu transfizierende Zelltypen wie T-Zellen⁵ anvisieren sollen, ein Problem darstellen. Umgekehrt könnte ein LNP extrem effektiv angreifen, aber die RNA-Fracht funktioniert möglicherweise nicht. Ein nachgeschalteter Assay, der nur die Frachtfunktionalität misst, wird nicht in der Lage sein, zwischen diesen beiden Situationen zu unterscheiden, was die Entwicklung und Optimierung von Carrier-Drug-Delivery-Systemen erschwert.

In dieser Arbeit wird diskutiert, wie die Trägerassoziation absolut quantifiziert werden kann. Assoziation ist ein Begriff, der sich auf den experimentell gemessenen Grad der Interaktion zwischen einem Träger und einer Zelle bezieht. Die Assoziation unterscheidet nicht zwischen Membranbindung und Internalisierung – ein Träger kann assoziiert sein, weil er an die Zelloberfläche gebunden ist oder weil die Zelle ihn verinnerlicht hat. Die Assoziation wird häufig im Rahmen von Zellträger-Inkubationsexperimenten gemessen. In der Vergangenheit wurde die Assoziation entweder in beliebigen fluoreszierenden Einheiten (typischerweise “mediane Fluoreszenzintensität” oder MFI) oder als “prozentuale Assoziation” berichtet, Metriken, deren Einschränkungen zuvor diskutiert wurden⁶. Kurz gesagt, diese Messungen sind aufgrund von Unterschieden in den experimentellen Protokollen, Durchflusszytometereinstellungen und den Markierungsintensitäten verschiedener Träger nicht zwischen Experimenten, Laboratorien und Wirkstoffträgern vergleichbar. Ersteres wurde durch Kalibrierung des Zytometers überwunden, wodurch das relative Maß des MFI in ein absolut quantitatives Maß für Fluoreszenz umgewandelt^{wurde 7}. Diese Methode berücksichtigt jedoch nicht die Variabilität in der Markierungsintensität verschiedener Träger und erlaubt daher keinen rationalen Vergleich verschiedener Trägerleistungen in einer Zielzelle der Wahl⁸.

Hier wird gezeigt, wie man praktisch von relativen, beliebigen fluoreszierenden Einheiten in die absolute quantitative Metrik der “Anzahl der Träger pro Zelle” umrechnen kann, indem eine kleine Anzahl zusätzlicher Charakterisierungsexperimente durchgeführt wird. Wenn eine andere Metrik der Trägerkonzentration gewünscht wird (z. B. Trägermasse pro Zelle oder Trägervolumen pro Zelle), ist es einfach, von Trägern pro Zelle umzurechnen, sofern eine Trägercharakterisierung durchgeführt wurde. Aus Gründen der Kürze und um Jargon zu vermeiden, wird das Wort “Träger” in dieser Arbeit verwendet, um sich auf die große Auswahl an Medikamentenabgabekonstrukten zu beziehen. Diese Quantifizierungstechniken sind gleichermaßen anwendbar, unabhängig davon, ob sie auf ein nanotechnologisch hergestelltes Goldpartikel oder ein biotechnologisch hergestelltes Bakterium angewendet werden.

Einige wenige Fakten ermöglichen die Umwandlung von beliebigen fluoreszierenden Einheiten in Träger pro Zelle. Erstens ist die gemessene Fluoreszenzintensität proportional zur Konzentration eines Fluorophors⁹ (oder eines fluoreszenzmarkierten Trägers), vorausgesetzt, die Fluoreszenz liegt innerhalb der Nachweisgrenzen des Instruments und die Instrumentierungseinstellungen sind gleich. Wenn also die Fluoreszenz eines Trägers und die Fluoreszenz einer Probe bekannt sind, kann man bestimmen, wie viele Träger in dieser Probe vorhanden sind, wenn alle Messungen unter den gleichen Einstellungen und Bedingungen durchgeführt wurden. Insbesondere bei kleineren Trägern ist es jedoch möglicherweise nicht möglich, Trägerfluoreszenz, Zellautofluoreszenz und zellassoziierte Trägerfluoreszenz auf demselben Instrument mit den gleichen Einstellungen zu messen. In diesem Fall gibt es eine zweite Anforderung, um die Umrechnung zwischen gemessener Fluoreszenz auf einem Instrument und gemessener Fluoreszenz auf einem anderen Instrument zu ermöglichen. Zu diesem Zweck kann eine Standardkurve der Fluorophorkonzentration erstellt werden, um die Fluoreszenzintensität auf beiden Instrumenten zu messen, wobei der MESF-Standard⁹ (Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome) genutzt wird. Dies ermöglicht dann die Messung der Trägerfluoreszenz in großen Mengen auf einem Nicht-Zytometer, eine Messung, die an Trägern beliebiger Größe oder Eigenschaft durchgeführt werden kann. Wenn eine solche Massenquantifizierung an einer Trägersuspension bekannter Konzentration durchgeführt wird, kann die Anzahl der Träger pro Zelle einer Probe erneut berechnet werden.

Während diese Arbeit den Prozess zur Messung der Trägerassoziation (bestimmt durch die gemessene Fluoreszenzintensität) demonstriert, könnte ein analoges Protokoll für andere Messungen der Zell-Träger-Interaktion durchgeführt werden (z. B. ein experimentelles Protokoll, das internalisierte und membrangebundene Träger unterscheidet). Darüber hinaus wäre dieses Protokoll weitgehend gleich, wenn die Assoziation durch einen nicht-fluoreszierenden Assay (z. B. durch Massenzytometrie) gemessen würde.

Protocol

1. Auswahl des passenden Streams

1. Befolgen Sie die in Abbildung 1 dargestellte Entscheidungsstruktur, um den besten Workflow (Stream) (Abbildung 2) für den verwendeten Versuchsaufbau zu ermitteln. Weitere Kommentare zu dieser Stream-Auswahl finden Sie in der Diskussion.
2. Wenn Sie dem Zytometer-Stream folgen, fahren Sie mit den Schritten 2.1.1-2.2.7 fort. Wenn Sie dem Massenstream folgen, fahren Sie mit den Schritten 3.1.1.1-3.1.5.7 fort.

Abbildung 1: Entscheidungsbaum des Workstreams. Die Entscheidung, welcher Stream verwendet werden soll, hängt in erster Linie von der Art des interessierenden Trägers ab. Größere Träger und Träger mit hohen Streueigenschaften können auf Zytometern leichter einzeln detektiert werden und eignen sich somit für die Quantifizierung mit dem Cytometer Stream. Der Bulk Stream ist für alle anderen Trägertypen geeignet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Übersicht der Workstreams. Dieses Protokoll ist in zwei verschiedene Streams aufgeteilt. Der Cytometer Stream verwendet ein empfindliches Zytometer, um die Träger in Suspension zu zählen, ihre individuelle Fluoreszenz zu messen und dann die Fluoreszenz von Zellen zu bestimmen, die mit Trägern inkubiert wurden. Der Bulk Stream verwendet nicht-zytometrische Techniken wie die Nanopartikel-Tracking-Analyse, um die Träger in Suspension zu zählen. Die individuelle Trägerfluoreszenz wird dann mit einem Mikrotiterplatten-Reader oder Spektrofluorometer quantifiziert. Die Verwendung des Durchflusszytometers beschränkt sich daher auf die Messung der endgültigen Fluoreszenz von Zellen, die mit Trägern inkubiert wurden, eine Messung, die auf einem breiteren Bereich von Zytometern durchgeführt werden kann und unabhängig vom verwendeten Trägertyp ist. Abkürzungen: MESF = Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome; MFI = mediane Fluoreszenzintensität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Der Zytometerstrom

1. Carrier-Zählung
   HINWEIS: Jedes Durchflusszytometer kann für diese Messung verwendet werden, sofern die Durchflussrate (μL/s) bekannt ist. Wenn die Durchflussrate unbekannt ist und nicht bestimmt werden kann, fahren Sie mit diesem Schritt nicht fort. Fahren Sie stattdessen mit Schritt 3.1 fort. Die Zählung der Träger in Suspension ermöglicht eine genaue und reproduzierbare Bestimmung der Anzahl der in jedem Zellexperiment inkubierten Träger.
   1. Richten Sie das Zytometer so ein, dass Träger sowohl durch einen optischen Streukanal (typischerweise Seitenstreuung [SSC]) als auch durch Fluoreszenz erkannt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie den Schwellenwert anpassen, um die Erkennung der Träger zu ermöglichen.
      HINWEIS: Iterationen durch verschiedene optische Streukanäle können erforderlich sein, wenn SSC kein klares Signal liefert (z. B. Vorwärtsstreuung [FSC]).
   2. Führen Sie eine reine Verdünnungsprobe aus, um die Anzahl der Hintergrundereignisse sowohl im SSC- als auch im Fluoreszenzkanal zu quantifizieren.
      HINWEIS: Die ideale Anzahl von Hintergrundereignissen beträgt <100 Ereignisse/s.
   3. Bereiten Sie die Träger für die Durchflusszytometrie vor.
      1. Stellen Sie sicher, dass die Träger je nach Trägersystem durch Wirbeln oder Beschallung gut aufgehängt sind.
      2. Wenn möglich, stellen Sie sicher, dass die Trägerkonzentration zwischen 1.000 Trägern/μL und 10.000 Trägern/μL liegt. Eine Ereignisanzahl von ein bis zwei Größenordnungen höher als der Hintergrund ist ein guter Anfang. Wenn die Größenordnung der Trägerkonzentration unbekannt ist, ist es ein guter Anfang, eine Verdünnung von 1:1.000 aus dem Bestand herzustellen. Verwenden Sie die ersten Ergebnisse als Feedback, um zukünftige Probenverdünnungen zu informieren.
         HINWEIS: Eine trübe Suspension ist im Allgemeinen zu konzentriert.
   4. Laden Sie die erste Trägerprobe auf das Zytometer und starten Sie die Aufnahme.
   5. Vergleichen Sie die Anzahl der Ereignisse, die sich sowohl aus dem SSC- als auch aus dem Fluoreszenzkanal ergeben. Diese sollten ungefähr gleich sein (<10% Unterschied). Wenn nicht, überprüfen Sie die Zytometereinstellungen, z. B. die Einstellungen der Photomultiplierröhre (PMT) und die Laserintensität für den Fluoreszenzkanal. Alternativ können Sie andere Methoden wie konfokale Mikroskopie verwenden, um zu validieren, dass die fluoreszierende Markierung der Träger vorhanden und einheitlich ist.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.3-2.1.5 zwei oder mehr weitere Male mit unterschiedlichen Verdünnungen aus der Aktie. Stellen Sie sicher, dass die Ereignisanzahl in jeder Stichprobe mindestens eine Größenordnung höher ist als die Anzahl der Hintergrundereignisse.
   7. Stellen Sie sicher, dass drei oder mehr Proben einen linearen Trend zeigen, d. h., eine zweifache Probenverdünnung sollte zu einer entsprechenden zweifachen Verringerung der gemessenen Trägerkonzentration führen.
   8. Verwenden Sie die Proben innerhalb des linearen Bereichs, die entsprechenden Verdünnungsfaktoren und die bekannte Zytometer-Flussrate, um die Stoffträgerkonzentration gemäß Gleichung (1) zu berechnen:
      (1)
      wobei C die Trägerkonzentration in Trägern/ml ist. Es wird empfohlen, die Ereignisanzahl zu verwenden, die von der optischen Streudetektion abgeleitet wird, anstelle von Fluoreszenz.
2. Durchflusszytometrie-Auslesung des Trägerzellexperiments, einschließlich Bestimmung der Fluoreszenzintensität pro Träger
   HINWEIS: Idealerweise wird die Fluoreszenzintensität pro Träger so nah wie möglich am Trägerzellexperiment bestimmt. Damit soll sichergestellt werden, dass die für einzelne Träger erhaltenen MFIs direkt mit den MFIs der mit den Trägern assoziierten Zellen verglichen werden können. In der Praxis liefert ein Zytometer in der Regel ähnliche Ergebnisse, wenn es an aufeinanderfolgenden Tagen mit den gleichen PMT-Spannungen verwendet wird, dies kann jedoch nicht garantiert werden.
   1. Entwerfen Sie das Trägerzellexperiment. Verwenden Sie die in Schritt 2.1 bestimmte Trägerkonzentration, um die gewünschte Dosis von Trägern zu verabreichen.
   2. Richten Sie das Durchflusszytometer für das abschließende Trägerzellexperiment ein, indem Sie die optimalen PMT-Spannungseinstellungen in den relevanten Kanälen bestimmen. Legen Sie die Schwellenwerte fest, um die Netzbetreibererkennung zuzulassen.
   3. Führen Sie die Träger in Suspension aus, um die Fluoreszenzintensität pro Träger unter den aktuellen PMT-Einstellungen zu bestimmen.
   4. Ändern Sie bei Bedarf die Zytometerschwellen, um die Zellen und nicht die Träger zu erkennen.
   5. Führen Sie eine Negativkontrollprobe durch – Zellen, die nicht mit Trägern inkubiert wurden -, um die Hintergrundfluoreszenz (Autofluoreszenz) der Zellen zu bestimmen.
   6. Führen Sie die Trägerzellenproben durch, um die Fluoreszenzintensität pro Zelle zu bestimmen. Diese Fluoreszenz ist eine lineare Kombination aus zellulärer Autofluoreszenz und dem Vorhandensein von fluoreszierenden Trägern.
   7. Berechnen Sie die Anzahl der Träger pro Zelle mit der folgenden Gleichung (2):
      (2)
      wobei _P-assoc die Anzahl der pro Zelle assoziierten Träger ist, FI-Zelle das MFI von Zellen, die mit Trägern inkubiert wurden, FI-Hintergrund das MFI von Zellen, die nicht mit Trägern inkubiert wurden, und _FI-Träger das MFI von Trägern in Suspension ist.

3. Der Massenstrom

1. Trägerzählung: Nanopartikel-Tracking-Analyse
   HINWEIS: Im Bulk Stream ist die Ladungsträgerzählung ein notwendiger Schritt, um die absolute Fluoreszenzintensität pro Träger zu quantifizieren (siehe Schritt 3.1.4). Darüber hinaus ermöglicht die Zählung der Träger in Suspension die genaue und reproduzierbare Bestimmung der Anzahl der in jedem Zellexperiment inkubierten Träger.
   1. Präparat
      1. Montieren Sie die Durchflusszelle auf dem Lasermodul und verriegeln Sie das gesamte Lasermodul im Instrument.
      2. Spülen Sie die Durchflusszelle langsam (nicht schneller als 0,1 ml / s) mit ~ 1 ml destilliertem Wasser. Wenn sich Blasen in der Durchflusszelle bilden, ziehen Sie die Suspension teilweise zurück, um die Blase mit der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu verschmelzen, bevor Sie fortfahren.
      3. Starten Sie die Kamera ungefähr auf halbem Weg durch die Spülung; Stellen Sie sicher, dass Trägerablagerungen ausgewaschen sind. Wählen Sie Aufnahme , um die Registerkarte Aufnahmeeinstellungen zu öffnen, und klicken Sie auf Kamera starten.
      4. Trocknen Sie das System mit 1 mL Luft. Wenn statische Träger auf dem Bildschirm sichtbar sind, reinigen Sie die Durchflusszelle gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      5. Bereiten Sie die Träger für die Nanopartikel-Tracking-Analyse vor, indem Sie sicherstellen, dass die Träger je nach Trägersystem durch Wirbeln oder Beschallung gut suspendiert sind. Wenn die Größenordnung der Stammkonzentration unbekannt ist, bereiten Sie eine Verdünnung von 1:100 aus der Brühe vor und verwenden Sie die ersten Ergebnisse als Rückmeldung, um zukünftige Probenverdünnungen zu informieren. Die Träger werden in Wasser und nicht in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, um mindestens ~0,6-1 ml jeder Probe mit einer Trägerkonzentration zwischen 1 × 10^{7 Trägern} /ml und 1 × 10⁹ Trägern/ml herzustellen.
         HINWEIS: Eine trübe Suspension ist im Allgemeinen zu konzentriert. Puffer und Salze können hohe Hintergrundgeräusche erzeugen.
   2. Messung
      1. Nehmen Sie das Lasermodul heraus und stellen Sie es aufrecht.
      2. Ziehen Sie die erste Trägerprobe in eine 1-ml-Spritze. Befestigen Sie die Spritze am Schlaucheinlass und laden Sie die Probe vorsichtig in die Durchflusszelle. Wenn sich Blasen in der Durchflusszelle bilden, ziehen Sie die Suspension teilweise zurück, um die Blase mit der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu verschmelzen, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Durchflusszelle mit Flüssigkeit gefüllt ist, und halten Sie dann an.
      3. Passen Sie den Kamerafokus bei Bedarf an, um einzelne Träger zu visualisieren. Nehmen Sie grobe Fokuseinstellungen mit dem Drehknopf auf der rechten Seite des Instruments vor. Nehmen Sie feinere Anpassungen vor, indem Sie die Registerkarte Hardware | Pumpen/Stufe. Ändern Sie den Fokus, indem Sie den Fokusschieberegler anpassen.
      4. Stellen Sie die Kamerastufe ein, um sicherzustellen, dass es keine Übersättigung gibt. Wählen Sie auf der Registerkarte Aufnahme die optimale Kamerastufe aus, indem Sie den Schieberegler anpassen.
      5. Wenn das Gerät mit diesem Zubehör ausgestattet ist, legen Sie die Spritze mit der Trägerprobe in die Spritzenpumpe , um einen kontinuierlichen Probenfluss während der Messungen sicherzustellen.
      6. Wählen Sie auf der Registerkarte SOP die Option Standardmessung aus, um fünf Aufnahmen von jeweils 30 s zu machen. Geben Sie den Basisdateinamen ein und fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Beispielinformationen hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Erweitert klicken (wodurch ein modaler Dialog mit einer Vielzahl von Auswahlmöglichkeiten geöffnet wird).
         HINWEIS: Wenn ein Verdünnungsfaktor eingegeben wird, wird die endgültige Messung der Trägerkonzentration automatisch von der Software angepasst. Von der Eingabe dieses Faktors wird abgeraten. Führen Sie stattdessen die Einstellung manuell durch, was die Analyse erleichtert und die Beurteilung ermöglicht, ob jede Verdünnung in den dynamischen Bereich des Geräts fällt (Schritt 3.1.3.4).
      7. Klicken Sie auf Create (Skript erstellen ) und Run Script (Skript ausführen ) und warten Sie, bis ein Popup-Fenster mit der Aufforderung Please advance sample (Bitte erweiterte Beispiel) angezeigt wird.
      8. Wenn Sie die Spritzenpumpe verwenden, wählen Sie die Registerkarte Hardware | Registerkarte ” Spritzenpumpe” | Stellen Sie die Infusionsrate auf 30-80 ein und drücken Sie Infusion. Wenn Sie die Spritzenpumpe nicht verwenden, ziehen Sie die Probe manuell vor.
      9. Wählen Sie im Popup-Fenster OK aus, um die Aufnahme zu starten. Überprüfen Sie nach jeder der fünf Aufnahmen, wenn das Popup-Fenster Please advance sample (Bitte erweiterte Probe) erneut angezeigt wird, entweder manuell oder über die Spritzenpumpe, ob sich die Probe noch durch die Durchflusszelle bewegt. Wählen Sie dann OK , um mit der nächsten Aufnahme fortzufahren.
         HINWEIS: Nach fünf Aufnahmen öffnet die Software automatisch die Registerkarte Prozess und öffnet ein Popup-Fenster, in dem Sie aufgefordert werden, die Prozesseinstellungen anzupassen.
   3. Analyse
      1. Passen Sie auf der Registerkarte Prozess den Schieberegler Erkennungsschwellenwert (zwischen 4 und 8) an, um verschiedene auf dem Bildschirm sichtbare Träger korrekt zu identifizieren. Passen Sie auch die Bildschirmverstärkung an, um die Visualisierung zu unterstützen. Es hat keinen Einfluss auf die nachgelagerte Analyse. Verwenden Sie den Schieberegler unter dem Aufnahmebildschirm, um durch mehrere Frames des Videos zu scrollen, um die Einstellung des Erkennungsschwellenwerts zu unterstützen.
         HINWEIS: Die Nachweisschwelle sollte einmal festgelegt und anschließend nicht zwischen Messungen oder Proben geändert werden.
      2. Drücken Sie im Popup-Fenster (Hinweis nach Schritt 3.1.2.9) OK , um die Tracking-Analyse zu starten. Überwachen Sie den Fortschritt der Analyse, indem Sie auf die Registerkarte Analyse | Einzelne Analyseregisterkarte .
      3. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, suchen Sie nach einer Eingabeaufforderung für Exporteinstellungen, in der standardmäßig PDF einschließen und Experimentzusammenfassung einschließen ausgewählt sein sollte. Wählen Sie beliebige andere Exportformate aus.
      4. Um sicherzustellen, dass die gemessene Konzentration zuverlässig ist, überprüfen Sie im Abschnitt Ergebnisse des PDF-Datenexports, ob die gemessene Trägerkonzentration zwischen 1 × 10⁷ Trägern/ml und 1 × 10⁹ Trägern/ml liegt – dem Dynamikbereich des Geräts – und überprüfen Sie, ob unter dem Konzentrationsmessergebnis Fehlermeldungen oder Warnmeldungen angezeigt werden.
      5. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2.1-3.1.3.4 zwei oder mehr Male mit unterschiedlichen Verdünnungen aus der Aktie. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration jeder Probe innerhalb des linearen Bereichs des Geräts liegt.
      6. Wählen Sie drei oder mehr Proben aus, die einen linearen Trend zeigen, d.h. eine zweifache Probenverdünnung sollte zu einer entsprechenden zweifachen Verringerung der gemessenen Trägerkonzentration führen. Verwenden Sie die ausgewählten Proben und die entsprechenden Verdünnungsfaktoren, um die Trägerkonzentration zu berechnen.
   4. Bestimmung der absoluten Fluoreszenzintensität pro Träger
      HINWEIS: Da die Fluoreszenz einzelner Träger in diesem Strom nicht direkt charakterisiert werden kann, wird die Fluoreszenzintensität in großen Mengen quantifiziert. Diese Methode beruht auf der Tatsache, dass die Fluoreszenzintensität linear mit der Fluorochromkonzentration nach dem Lambert-Beer-Gesetz zusammenhängt. Wenn eine solche Massenquantifizierung von Trägern in Suspension an einer Suspension bekannter Trägerkonzentration durchgeführt wird (siehe Schritt 3.1), kann die Fluoreszenz pro Träger abgeleitet werden. Dieser Schritt kann entweder auf einem Fluoreszenzplattenleser oder einem Spektrofluorometer durchgeführt werden. Die Fluoreszenzintensität wird mit einer Standardkurve von Proben mit bekannter absoluter Fluoreszenz verglichen, die in der Anzahl der MESFs angegeben ist.
      1. Verwenden Sie eine Lösung des freien Fluorochroms, um den Träger zu markieren: Resuspendieren Sie den Farbstoff im entsprechenden Puffer (z. B. DMSO) und führen Sie weitere Verdünnungen im selben Puffer wie das Trägerverdünnungsmittel durch. Alternativ kann eine Lösung eines Antikörpers verwendet werden, der mit dem Fluorochrom konjugiert ist. Berechnen Sie die Konzentration der Stammlösung (MESF/ml) aus der Konzentration in mg/ml, dem Molekulargewicht in mg/Mol und der Avogadro-Zahl unter Verwendung von Gleichung (3). Führen Sie eine serielle Verdünnung im Trägerverdünnungsmittel durch, um Standardkurvenproben zu erzeugen.
         (3)
         HINWEIS: Verwenden Sie einen fluorochromkonjugierten Antikörper nur, wenn der Grad der Markierung, d. h. das molare Verhältnis zwischen Fluorochrom und Antikörper in der Lösung, bekannt ist. Erzeugen Sie zunächst eine Standardkurve mit einem weiten Bereich, da die Fluoreszenzintensität der Trägerprobe noch unbekannt ist. Von hier aus schränken Sie es ein, um den erforderlichen Bereich einzubeziehen.
      2. Bereiten Sie die Trägerproben vor.
         HINWEIS: Es empfiehlt sich, zwei oder mehr Trägerverdünnungen zu testen, um zu validieren, dass die Messungen linear sind und in den Bereich der Standardkurve fallen.
      3. Messen Sie die Fluoreszenz gleicher Volumina jeder Probe, d. H. Sowohl Träger- als auch Standardkurven.
      4. Generieren Sie eine Standardkurve und ziehen Sie die absolute Fluoreszenzintensität in MESF/ml für die gemessenen Trägerproben ab.
      5. Berechnen Sie die absolute Fluoreszenzintensität pro Träger (MESF/Träger), indem Sie die Massenfluoreszenz (MESF/ml) durch die Trägerkonzentration (Träger/ml) dividieren, wie in Gleichung (4):
         (4)
   5. Zellexperiment (einschließlich Bestimmung der äquivalenten Fluoreszenzintensität pro Träger)
      HINWEIS: In diesem Schritt werden Durchflusszytometrie-Quantifizierungsperlen verwendet, um eine Standardkurve der Beziehung zwischen MESF und MFI zu generieren. Diese Quantifizierungskügelchen bestehen aus mehreren Perlenpopulationen mit einer bekannten Anzahl von MESF pro Perle, und diese einzelnen Perlen können von jedem Zytometer detektiert werden. Idealerweise wird die MESF-Standardkurve gleichzeitig mit dem Auslesen der Trägerzellexperimente bestimmt. Dadurch soll sichergestellt werden, dass die für einzelne Träger berechneten MFI-Werte direkt mit dem MFI von Zellen verglichen werden können, die den Trägern zugeordnet sind. In der Praxis liefert ein Zytometer in der Regel ähnliche Ergebnisse, wenn es an aufeinanderfolgenden Tagen mit den gleichen PMT-Spannungen verwendet wird, dies kann jedoch nicht garantiert werden.
      1. Entwerfen Sie das Trägerzellexperiment. Verwenden Sie die in Abschnitt 3.1.3 bestimmte Trägerkonzentration, um die gewünschte Dosis von Trägerstoffen zu verabreichen.
      2. Richten Sie das Durchflusszytometer für das abschließende Trägerzellexperiment ein, indem Sie die optimalen PMT-Spannungseinstellungen in den relevanten Kanälen bestimmen.
      3. Führen Sie eine negative Kontrollprobe durch, dh Zellen, die nicht mit Trägern inkubiert wurden, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen.
      4. Bereiten Sie die Durchflusszytometrie-Quantifizierungsperlen vor und resuspendieren Sie sie. Verwenden Sie den gleichen Puffer wie für die Zellproben (z. B. PBS). Wenn die Perlenpopulationen separat bereitgestellt werden, bündeln Sie sie zusammen.
      5. Führen Sie die Durchflusszytometrie-Quantifizierungsperlenprobe durch.
      6. Führen Sie die Trägerzellenproben durch, um die Fluoreszenzintensität pro Zelle zu bestimmen.
      7. Verwenden Sie die Quantifizierungsperlenprobe, um eine Standardkurve zu erstellen, die die absolute Fluoreszenzintensität (MESF) in MFI umwandelt. Verwenden Sie diese Standardkurve und die Ergebnisse aus Schritt 3.1.4, um den theoretischen MFI der Träger zu berechnen. Berechnen Sie die Anzahl der Träger pro Zelle mit Gleichung (5):
         (5)
         Dabei ist _P-Assoc die Anzahl der pro Zelle assoziierten Träger, FI-Zelle ist das MFI von Zellen, die mit Trägern inkubiert wurden, FI-Hintergrund ist das MFI von Zellen, die nicht mit Trägern inkubiert wurden, und _FI-Träger ist der berechnete MFI von Trägern in Suspension (Schritt 3.1.4).

Representative Results

Discussion

Die Charakterisierung der Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffträgern und Zellen gewinnt bei der Entwicklung neuartiger Wirkstoffabgabesysteme zunehmend an Bedeutung. Insbesondere um die rationale Bewertung und den Vergleich verschiedener Trägerkonstrukte zu ermöglichen, ist die absolute Quantifizierung der Leistung des Trägers bei der Interaktion mit Ziel- und Off-Target-Zellen von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll beschreibt eine Zwei-Stream-Methodik, die es jedem Forscher, der mit einem Wirkstoffträger arbeitet, ermöglicht, relative, semiquantitative Durchflusszytometriedaten zur Zellträgerassoziation in absolute quantitative Ergebnisse umzuwandeln. Das beschriebene Verfahren ist auf jede Art von Träger anwendbar – klein, groß, organisch, anorganisch – vorausgesetzt, sie sind fluoreszierend markiert. Verschiedene Träger erfordern jedoch unterschiedliche Ansätze, um die Träger pro Zelle zu berechnen. Dies ist auf die Grenzen verschiedener Instrumente zurückzuführen, die für die erforderlichen Charakterisierungsmessungen verwendet werden.

Daher ist dieses Protokoll in zwei Streams unterteilt: den Cytometer Stream und den Bulk Stream. Der erste, der Zytometerstrom, ist der einfachere Ansatz und erfordert nur ein Durchflusszytometer, aber dieses Zytometer muss empfindlich genug sein, um die einzelnen verwendeten Träger zu erkennen, oder, mit anderen Worten, der interessierende Arzneimittelträger muss groß und dicht genug sein, um erkannt zu werden. Der Bulk Stream ist mit jedem Trägertyp kompatibel, da die Notwendigkeit, einzelne Träger zu erkennen, durch den Einsatz alternativer Instrumente umgangen wird. Der Bulk Stream erfordert jedoch mehr Charakterisierungsexperimente.

Um die Auswahl des geeigneten Streams (und damit der geeigneten Technologien) zu erleichtern, wurden die oben genannten Überlegungen in einer Entscheidungsstruktur zusammengefasst (Abbildung 1). Um es noch einmal zu wiederholen: Der Bulk Stream eignet sich für alle Forscher, unabhängig vom verwendeten Trägertyp, und kann somit immer als Backup herangezogen werden. Die Arbeitsabläufe der beiden Streams sind in Abbildung 2 dargestellt. Insbesondere mit den laufenden Fortschritten in der Empfindlichkeit von Durchflusszytometern ist es möglich, dass der Cytometer Stream für mehr <300 nm Träger verwendet werden kann.

Zu diesem Verfahren sollten einige Anmerkungen gemacht werden. Zunächst beruht die beschriebene Strategie zur Umwandlung der Zellfluoreszenz in eine absolute Anzahl von Trägern pro Zelle auf der Messung der einzelnen Trägerfluoreszenz in Suspension. Die Fluoreszenz wird jedoch durch die unmittelbare chemische Umgebung des Fluorochroms beeinflusst (z. B. das Trägerverdünnungsmittel, die Zelloberfläche oder verschiedene intrazelluläre Kompartimente). Insbesondere ist bekannt, dass das saure Milieu des endosomalen Kompartiments die Fluoreszenzintensität bestimmter primär proteinbasierter Farbstoffe beeinflusst¹¹. Daher wird unabhängig vom untersuchten Trägertyp empfohlen, pH-unempfindliche und stark fotostabile Farbstoffbereiche für die Kennzeichnung von Arzneimittelträgern zu verwenden (siehe Materialtabelle für eine Empfehlung). Der zusätzliche Vorteil dieses Farbstoffbereichs ist seine allgemeine Helligkeit, die die Empfindlichkeit der Wirkstoffträgererkennung erhöht.

Zweitens sollen die oben diskutierten Methoden Orientierung bieten, bilden aber keineswegs eine exklusive Liste von Techniken, die zur Durchführung der verschiedenen Schritte im Quantifizierungsworkflow verwendet werden können. Insbesondere gibt es eine Vielzahl von Techniken, um kleinere oder wenig streuende Träger (wie die im Bulk Stream) zu zählen. Dazu gehören andere Instrumente, die in der Lage sind, die gleiche Nanopartikel-Tracking-Analyse¹² durchzuführen, sowie andere Methoden insgesamt, wie dynamische Mehrwinkellichtstreuung, Massenspektroskopie, Elektronenmikroskopie 13, Gravimetrie oder optische Dichtemessungen (weiter überprüft von Shang und Gao¹⁴). Darüber hinaus ist diese experimentelle Quantifizierung – die sich von beliebigen Fluoreszenzeinheiten zu einer absoluten Anzahl von Trägern pro Zelle bewegt – nur ein Teil dessen, was man als “quantitativen biologischen Workflow” bezeichnen könnte. Eine absolute experimentelle Quantifizierung ist notwendig, aber nicht ausreichend. Die bloße Quantifizierung und Berichterstattung über die Trägerassoziation berücksichtigt keine Unterschiede in der Partikelassoziation aufgrund des Versuchsaufbaus, wie z. B. die Inkubationszeit, Dosis und Konzentration des hinzugefügten Wirkstoffträgers oder die Anzahl der pro Versuchsbehälter verwendeten Zellen.

Darüber hinaus können Träger mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften sehr unterschiedliche Dosierungen haben, die an Zellen abgegeben werden, selbst wenn der Versuchsaufbau identisch ist¹⁵. Die Trägerleistung – auch in vitro – kann nicht ohne Berücksichtigung all dieser Faktoren bestimmt werden. Mit anderen Worten, die bloße Quantifizierung der Träger-Zell-Assoziation erlaubt im Allgemeinen keinen unvoreingenommenen Vergleich der Träger zwischen Forschern und Laboratorien. Vor diesem Hintergrund wurde zuvor diskutiert, wie wichtig es ist, Zeitverlaufsexperimente der Träger-Zell-Assoziation durchzuführen und anschließend mathematische In-silico-Modelle durchzuführen, um kinetische Parameter (d.h. Geschwindigkeitskonstanten) als unverzerrtes und quantitatives Maß für die Affinität zwischen einem bestimmten Träger-Zell-Paar^{abzuleiten 10}. Die experimentelle Quantifizierung ist auch eine Voraussetzung für die Anwendung anderer In-silico-Techniken , wie z. B. die Identifizierung potenzieller Quellen biologischer Heterogenität¹⁶ oder die Bestimmung der Penetrationskinetik in einem komplexen biologischen Modell¹⁷. In Kombination mit den Richtlinien für die minimale Informationsberichterstattung in der experimentellen Literatur von Bio-Nano für eine standardisierte Berichterstattung¹⁸ kann die quantitative Bewertung der Trägerleistung die Entwicklung neuartiger Nanomedizin beschleunigen.

Materials

Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMA<sub>SH</sub> carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard