Quantitative Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion nach synthetischer mRNA-Transfektion

Die Motilität der Tumorzellen spielt eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung ^1,2. Die Ausbreitung von Tumorzellen in benachbarte und entfernte gesunde Gewebe erschwert die Krebsbehandlung und trägt zum Rezidiv bei ^3,4. Daher ist es wichtig, die Mechanismen der Tumorzellmotilität zu verstehen und entsprechende therapeutische Strategien zu entwickeln. Da viele Tumorzellen veränderte Genexpressionsprofile aufweisen, ist es wichtig zu verstehen, welche Veränderungen im Genexpressionsprofil zu einer veränderten Tumorzellmotilität führen ^5,6.

Es wurden mehrere Assays entwickelt, um die Zellmigration in vitro zu messen. Einige Assays liefern nur begrenzte Informationen, da sie Messungen nur zu bestimmten Zeitpunkten ermöglichen, während andere umfassende Informationen über die Tumorzellmotilität in Echtzeit bieten⁷. Obwohl viele dieser Zellmotilitätsassays quantitative Ergebnisse zu einem bestimmten Zeitpunkt oder am Endpunkt liefern können, liefern sie keine ausreichend detaillierten Informationen über dynamische Änderungen der Zellmigrationsrate während des Versuchszeitraums. Darüber hinaus kann es schwierig sein, mögliche Änderungen der Zellmigrationsrate in Abhängigkeit vom Versuchsdesign, den Zelltypen und der Zellanzahl zu untersuchen. Darüber hinaus können die Auswirkungen unkomplizierter Behandlungen durch die einfache Quantifizierung herkömmlicher Motilitätsassays untersucht werden, aber eine ausgefeiltere Quantifizierung kann erforderlich sein, um die komplexen Auswirkungen verschiedener kombinierter Behandlungen zu untersuchen⁸.

Es wurde ein^{Instrument zur Überwachung} des elektrischen Stroms einer Mikrotiterplatte entwickelt, die mit Mikroelektroden bedeckt ist. Die Adhäsion der Zellen an der Oberfläche der Vertiefung behindert den Elektronenfluss, und die Impedanz korreliert mit der quantitativen und qualitativen Bindung der Zellen. Das Vorhandensein der Mikroelektroden am Boden der Vertiefung ermöglicht die Messung der Zelladhäsion, -ausbreitung und -proliferation. Das Vorhandensein der Mikroelektroden unter einer mikroporösen Membran der oberen Kammer ermöglicht die Messung der Zellmigration und -invasion in die untere Kammer, wobei die obere Kammer mit extrazellulären Matrixproteinen (ECM) beschichtet ist, um eine Invasion zu ermöglichen¹⁰.

Zuvor wurde gezeigt, dass impedanzbasierte Echtzeitmessungen der Tumorzellmigration und -invasion während des gesamten Experiments Echtzeitdaten sowie sofortige Vergleiche und Quantifizierungen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen liefern¹¹. In dieser Methodenarbeit wurde der Gen-Knockdown induziert, um die Rolle von Proteinen von Interesse bei der Migration und Invasion von Tumorzellen zu testen. Da ein ausgewachsener Gen-Knockdown-Effekt unter den getesteten experimentellen Bedingungen 3-4 Tage nach der Elektroporation mit kleinen interferierenden RNAs (siRNAs)⁸ einsetzte, wurden die Zellen nach der Elektroporation neu plattiert und 3 Tage später für die impedanzbasierte Echtzeitmessung der Tumorzellmigration und -invasion erneut geerntet.

CT10-Regulator der Kinase (Crk) und Crk-like (CrkL) sind Adapterproteine, die Protein-Protein-Wechselwirkungen stromabwärts verschiedener Wachstumsfaktor-Rezeptorkinase-Signalwege und Nichtrezeptor-Tyrosinkinase-Signalwege vermitteln¹². Erhöhte Spiegel von Crk und CrkL-Proteinen tragen zu einer schlechten Prognose bei mehreren menschlichen Krebsarten, einschließlich des Glioblastoms¹³, bei. Unklar ist allerdings, wie erhöhte Crk- und CrkL-Proteine zu einer schlechten Prognose führen. Daher ist es wichtig, den Effekt der Crk- und CrkL-Überexpression auf die Tumorzellfunktionen zu definieren. Zuvor wurde eine Gen-Knockdown-Studie durchgeführt, um zu zeigen, dass endogene Konzentrationen von Crk- und CrkL-Proteinen für die Migration und Invasion von Glioblastomzellen erforderlich sind⁸. Hier wurde ein modifiziertes Assay-System entwickelt, um den Effekt der Crk- und CrkL-Überexpression auf die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen.

In jüngster Zeit haben die In-vitro-Synthese von mRNA und ihre therapeutischen Anwendungen durch die Entwicklung der mRNA-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 (überprüft von Verbeke et ^al.14) erneut Aufmerksamkeit erregt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Fortschritte bei der Verwendung synthetischer mRNA bei Krebs und anderen Krankheiten erzielt^15,16. Die Elektroporation von Zellen ist eine effektive Methode, um synthetische mRNA zu verabreichen und eine vorübergehende genetische Modifikation zu induzieren (überprüft von Campillo-Davo et al.17), und die Verwendung synthetischer mRNA ermöglicht eine schnelle und effiziente Genexpression in immortalisierten Fibroblasten ¹⁸. Diese Methodenarbeit kombiniert die Überexpression von Genen unter Verwendung synthetischer mRNA mit Echtzeit-Zellanalysen, um die Migration und Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Das experimentelle Schema, das für siRNAs verwendet wird, funktioniert jedoch nicht mit synthetischer mRNA-Transfektion, da der Gehalt an exogenen Proteinen schnell ansteigt und bei synthetischer mRNA-Transfektion allmählich abnimmt¹⁸. Daher wurde die Methode modifiziert, um die Echtzeitanalyse der Zellmigration und -invasion direkt nach der Transfektion durchzuführen, ohne die Zellen zusätzlich zu kultivieren.

Diese Methodenarbeit zeigt, dass die Kombination von impedanzbasierten Echtzeitmessungen mit der Transfektion von Tumorzellen mit synthetischen mRNAs eine schnelle und umfassende Analyse der Auswirkungen der Genhochregulierung auf die Migration und Invasion von Tumorzellen ermöglicht. In diesem Methodenpapier werden detaillierte Verfahren beschrieben, um zu messen, wie die Migration und Invasion von Glioblastomzellen durch die Überexpression von Crk und CrkL beeinflusst wird. Durch die Untersuchung der konzentrationsabhängigen Effekte von synthetischer mRNA auf die Tumorzellmigration wird in der Arbeit klar beschrieben, wie ein Anstieg des Proteinspiegels die Migration von Tumorzellen stimuliert. Darüber hinaus wird ein Ansatz zur Variation der Konzentration des ECM-Gels vorgestellt, um die Auswirkungen von Veränderungen der Genexpression auf die Tumorzellinvasion zu untersuchen.

1. Synthese von mRNA

HINWEIS: Für die mRNA-Synthese müssen alle Reagenzien und Geräte speziell behandelt werden, um die RNasen vor der Verwendung zu inaktivieren. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Instrumenten und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Linearisierung der DNA
   ANMERKUNG: Maus-cDNAs von CrkI und CrkL wurden in den pFLAG-CMV-5a-Expressionsvektor kloniert, um den FLAG-Epitop-Tag am C-Terminus hinzuzufügen, und in den pcDNA3.1/myc-Him-Vektor subkloniert, um den T7-Promotor einzubauen, wie zuvor beschrieben^18,19.
   1. Geben Sie 10 μl 10x Reaktionspuffer, 1,5 μl PmeI (10.000 Einheiten/ml) und 10 μg einer Plasmid-DNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen, um die Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym zu linearisieren. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 100 μl zu bringen.
   2. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, geschleudert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
   3. 5 μl 10%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 μl Proteinase K (20 mg/ml, RNA-Qualität) in die Reaktionsmischung geben. Durch Klopfen mischen, schleudern und 30 Minuten bei 50 °C inkubieren.
   4. Unter dem Abzug 100 μl der unteren Phase von Phenol:Chloroform:isoamylalkohol zur Extraktion in die Plasmidreaktionsmischung geben. Vortex, und dann bei 18.800 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verschieben Sie die obere Phase in eine neue Röhre.
   5. Schritt 1.1.4 mit Chloroform:isoamylalkohol im Verhältnis 24:1 wiederholen.
   6. Im neuen Röhrchen wird das Reaktionsvolumen durch Zugabe von 200 μl nukleasefreiem Wasser auf 300 μl und dann durch Zugabe von 30 μl 3 M Natriumacetat und 600 μl 100%igem Ethanol auf 300 μl gebracht.
   7. Durch Vortexen mischen und dann 30-60 Minuten lang bei −20 °C für die Ethanolfällung der DNA platzieren.
   8. Bei 18.800 × g 20 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet mit 1 ml 70%igem Ethanol spülen. Wiederholen Sie die Zentrifugation für 10 Minuten und entfernen Sie dann den Überstand vollständig.
   9. Trocknen Sie 2 Minuten lang bei geöffneter Kappe, fügen Sie 30 μl nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie das DNA-Pellet.
   10. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
   11. Überprüfen Sie die Größe und Menge der linearisierten DNA mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese.
2. RNA-Synthese mittels T7-RNA-Polymerase
   1. Geben Sie je 2 μl 10x Transkriptionspuffer, ATP, GTP, UTP, CTP und T7 und 1 μg einer linearisierten DNA in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Reaktionsvolumen auf 20 μl zu bringen.
   2. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, heruntergeschleudert und bei 37 °C für 2 h für die RNA-Synthese inkubiert.
   3. Schleudern Sie, fügen Sie 1 μl DNase (2 U/μl) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 Minuten, um die Template-DNA zu entfernen.
3. Lithiumchlorid-Ausfällung der RNA
   1. 10 μl Lithiumchlorid (7,5 M) werden in das Reaktionsgemisch gegeben. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, geschleudert und 30 min lang bei −20 °C inkubiert.
   2. Bei 18.800 × g 20 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet mit 500 μl 70%igem Ethanol spülen. Wiederholen Sie die Zentrifugation für 10 Minuten und entfernen Sie dann den Überstand vollständig.
   3. Trocknen Sie 2 Minuten lang bei geöffneter Kappe, fügen Sie 30 μl nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie das RNA-Pellet.
4. Bedeckend
   1. Erhitzen Sie die RNA-Probe 10 Minuten lang bei 65 °C und legen Sie sie dann zum Abkühlen auf Eis.
   2. Fügen Sie jeweils 5 μl 10x Capping-Puffer, 10 mM GTP und 1 mM (10x) S-Adenosylmethionin (SAM), jeweils 2 μl einer Capping-Enzymmischung und einer O-Methyltransferase-Enzymmischung und 1,25 μl RNase-Inhibitor hinzu. Das Reaktionsgemisch wird durch Abklopfen gemischt, heruntergeschleudert und 1 h lang bei 37 °C inkubiert.
5. Poly(A)-Rückstände
   1. Schleudern Sie die Probe herunter und fügen Sie dann 6 μl nukleasefreies Wasser, 20 μl 5x E-PAP-Puffer, 10 μl 25 mM MnCl2_, 10 μl 10 mM ATP und 4 μl E-PAP Poly(A)-Tailing-Enzym hinzu. Die Reaktionsmischung wird durch Abklopfen gemischt, geschleudert und 2 h lang bei 37 °C inkubiert.
6. Lithiumchlorid-Fällung und Quantifizierung der synthetischen mRNA
   1. 50 μl Lithiumchlorid (7,5 m) zugeben und die Lithiumchloridfällung wie in den Schritten 1.3.1-1.3.3 beschrieben durchführen.
   2. Messen Sie die Konzentration der mRNA mit einem Spektralphotometer.
   3. Überprüfen Sie die Größe und Menge der mRNA mit Formaldehyd (1%-2%) Agarose (1%) Gelelektrophorese.

2. Extrazelluläre Matrix (ECM) Gelbeschichtung der Zellinvasions- und Migrationsplatten (CIM)

HINWEIS: Eine CIM-Platte (Cell Invasion and Migration) ist eine kommerziell hergestellte 16-Well-Platte für die impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyse. Für den Zellinvasionsassay werden die CIM-Platten mit ECM-Gel beschichtet, wie zuvor beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen¹¹.

1. Nehmen Sie ein Aliquot ECM-Gelbrühe aus dem Gefrierschrank und bewahren Sie es auf Eis auf.
2. Verdünnen Sie das ECM-Gel (10 mg/ml) auf eine Arbeitskonzentration (100 μg/ml), indem Sie 990 μl Modified Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco (ohne Serum oder Antibiotika) mit 10 μl ECM-Gel in einem Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen.
3. Geben Sie 60 μl verdünntes ECM-Gel in jede der 16 Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte. Wenden Sie die umgekehrte Pipettiermethode an und vermeiden Sie dabei Luftblasen^20,21.
   HINWEIS: Optimieren Sie die Konzentration des ECM-Gels für jede Zelllinie. Für Glioblastom-Zelllinien wurde 0,1 μg/μL bis 1 μg/μL ECM-Gel zur Optimierung verwendet.
4. Die obere Kammer der CIM-Platte mit abgenommener Plattenabdeckung für ca. 4 h auf eine schützende Kunststofffolie in einem CO₂ -Inkubator legen, um eine Gelschicht zu bilden.
   VORSICHT: Während der Beschichtung der CIM-Platte mit ECM-Gel sollten die Elektroden der oberen Kammer der CIM-Platte keinen direkten Kontakt mit den Händen des Versuchsleiters oder den Oberflächen des Geräts, einschließlich der Biosicherheitswerkbank oder des CO_{2 -} Inkubators, haben.

3. Präparation der Tumorzellen

HINWEIS: Alle Zellkulturmaterialien müssen steril aufbewahrt werden. Entnahme und Elektropolierung der Tumorzellen unter einer biologischen Sicherheitswerkbank mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), wie zuvor beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen¹¹.

1. Kultivierung der Tumorzellen
   1. Kultur von U-118MG-Zellen in 10 ml DMEM mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % Antibiotika pro 100 mm x 20 mm Polystyrol-Gewebekulturschale bei 37 °C in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator (Kulturbedingung).
2. Serumdepletion der Tumorzellen
   HINWEIS: Die Exposition der Zellen gegenüber den in FBS vorhandenen Chemolockstoffen muss vor den Zellmigrations- und Invasionsassays durch Verwendung einer hohen Konzentration von FBS minimiert werden.
   1. Entfernen Sie das alte Medium und fügen Sie 10 ml vorgewärmtes DMEM hinzu, das 0,5 % FBS und 1 % Antibiotika pro Schale enthält (niedriges Serummedium).
   2. Wiederholen Sie Schritt 3.2.1.
   3. Die Zellen werden bei 37 °C in einem 5%igen_{CO2-Inkubator} für 4 h oder länger inkubiert.
3. Entnahme der Tumorzellen
   1. Entfernen Sie das alte Medium, fügen Sie 8 ml vorgewärmte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco pro Schale hinzu, entfernen Sie das DPBS, fügen Sie vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin-EDTA (2 ml/Schale) hinzu, um die Oberfläche zu bedecken, und inkubieren Sie 30 s lang im CO_{2 -} Inkubator.
   2. Saugen Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig ab, fügen Sie Serummedium (7 ml/Schale) hinzu und sammeln Sie dann die Zellen in einem 50-ml- oder 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   3. Aliquotieren Sie ein kleines Volumen von Zellen und verwenden Sie einen tragbaren automatischen Zellzähler, um die Zellen zu zählen.
   4. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen und das erforderliche Volumen für 10.000 Zellen/μl.
   5. Schleudern Sie die Zellen, indem Sie sie bei 100 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, saugen Sie den Überstand ab, fügen Sie das berechnete Volumen DMEM mit 0,5 % FBS (ohne Antibiotika) hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig.
   6. Für jede Behandlung werden 110 μl der Zellsuspension mit 1,1 Millionen Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
   7. Wiederholen Sie Schritt 3.3.6, um die Zellen für vier verschiedene Behandlungen in vier Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen.
      HINWEIS: Eine CIM-Platte hat insgesamt 16 Vertiefungen. Entwerfen Sie vier verschiedene Behandlungen zum Vergleich, so dass jeder Behandlung vier Vertiefungen der CIM-Platte zugewiesen werden können. Verwenden Sie die elektroporierten Zellen für die folgenden Experimente: Western-Blot-Analysen (0,3 Millionen Zellen pro 35-mm-Gewebekulturschale), vier Wells mit Echtzeit-Zellmigrationsassays (0,1 Millionen Zellen/Well) und vier Wells mit Echtzeit-Zellinvasionsassays (0,1 Millionen Zellen/Well) für jede Behandlung. Passen Sie die Anzahl der Zellen an, die elektroporiert werden müssen, wenn sich das Versuchsdesign ändert.

4. Elektroporation der Tumorzellen

1. Um das Medium zu entfernen, fügen Sie der Zellsuspension in jedem Röhrchen 1 ml DPBS hinzu, schleudern Sie die Zellsuspension dreimal für jeweils 10 s herunter, während Sie das Röhrchen alle 10 s mit einer Minizentrifuge um 180° drehen, und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette.
   HINWEIS: Es ist wichtig, ein kompaktes, aber leicht resuspendierbares Zellpellet zu bilden.
2. Geben Sie 110 μl Resuspensionspuffer R in das Zellpellet, um 0,1 Millionen Zellen in 10 μl zu erhalten.
3. Fügen Sie dem Zellpellet synthetische mRNA hinzu, um je nach gewünschtem Expressionsniveau eine Konzentration von 0,2-20 ng/μl zu erhalten. Mischen und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig durch Klopfen oder vorsichtiges Pipettieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie verschiedene Konzentrationen synthetischer mRNA, untersuchen Sie die Proteinexpression mit Hilfe der Western-Blot-Analyse und bestimmen Sie die Konzentration der synthetischen mRNA, die zum gewünschten Expressionsniveau führt, um die spezifische Korrelation zwischen der Proteinexpression und biologischen Effekten zu untersuchen.
4. Elektropolieren Sie 10 μl der Zellsuspension mit einem Elektroporationssystem bei 1.350 V für 10 ms mit jeweils drei Impulsen.
5. Die elektroporierten Zellen werden in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,1 ml DMEM mit 0,5 % FBS überführt.
6. Wiederholen Sie die Elektroporation, bis der Rest der Zellsuspension elektroporiert ist. Kombinieren Sie die elektroporierten Zellen im Mikrozentrifugenröhrchen, um 1,1 Millionen Zellen in 1,1 ml zu erhalten.
   HINWEIS: Sowohl 100-μl- als auch 10-μl-Elektroporationsspitzen können zum Elektropolieren eines großen Zellvolumens verwendet werden, aber die Elektroporationsspitzen für 10 μl und 100 μl sind in zwei separaten Kits enthalten und müssen separat erworben werden. Der Aufhängungspuffer R ist in beiden Kits enthalten.
7. Nach Abschluss aller jeweiligen Elektroporationen werden die gepoolten Zellen vorsichtig resuspendiert.
8. Platten Sie 0,3 Millionen Zellen in einer 35 mm x 10 mm großen Polystyrol-Gewebekulturschale mit 2 ml DMEM mit 5 % FBS und kultivieren Sie die Zellen 1 Tag lang unter Kulturbedingungen für die Gesamtzelllysatvorbereitung und Western-Blot-Analysen.
9. Bewahren Sie den Rest der elektroporierten Zellen bei Raumtemperatur auf, bis das Echtzeit-Zellanalysesystem bereit ist.

5. Einrichten des Echtzeit-Zellanalysators, des Programms und der CIM-Platten

HINWEIS: Bereiten Sie den Echtzeit-Zellanalysator und zwei CIM-Platten vor, wie zuvor beschrieben¹¹.

1. Äquilibrierung des Echtzeit-Zellanalysators
   1. Bringen Sie den Echtzeit-Zellanalysator einige Stunden vor der Verwendung in einen CO_{2 -} Inkubator, um das System unter den Kulturbedingungen auszugleichen.
2. Einrichten des Analyseprogramms
   1. Öffnen Sie das Analyseprogramm, indem Sie auf dem Desktop auf das Symbol der Echtzeit-Zellanalysesoftware doppelklicken.
   2. Sobald die Option Standard-Experimentmuster-Setup geöffnet ist, wählen Sie die Option zum separaten Ausführen von drei Experimenten aus.
      HINWEIS: Jede Halterung verfügt über ein separates Fenster. Es gibt verschiedene Registerkarten, um das Messintervall und die Messdauer, die Datenanalyse und andere experimentelle Bedingungen einzurichten.
   3. Öffnen Sie jede Dockingstation, indem Sie auf die Registerkarte Nummer klicken.
   4. Klicken Sie auf die Registerkarte Experimentnotizen , wählen Sie den Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen, und geben Sie den Namen des Experiments ein.
   5. Klicken Sie auf die Registerkarte Layout , richten Sie vierfache Wells für jede Behandlungsbedingung ein, indem Sie vier Wells gleichzeitig auswählen und die Probeninformationen eingeben, und klicken Sie dann auf Anwenden.
   6. Klicken Sie auf die Registerkarte Zeitplan | Fügen Sie einen Schritt hinzu , um den zweistufigen Modus der Zellimpedanzmessungen einzurichten. Klicken Sie dann auf Übernehmen , um den ersten Schritt einzurichten.
   7. Klicken Sie erneut auf Schritt hinzufügen, geben Sie 10 Minuten für das Intervall und 48 Stunden für die Dauer für Migration und Invasion ein und klicken Sie auf Anwenden, um den zweiten Schritt einzurichten.
      HINWEIS: Im ersten Schritt wird eine einmalige Baseline-Messung durchgeführt (ein Sweep mit einem Intervall von 1 Minute). Im zweiten Schritt wird die Zellimpedanz für das Experiment (z. B. 289 Sweeps mit einem 10-Minuten-Intervall für 48 Stunden) an der Halterung gemessen. Passen Sie das Intervall und die Dauer je nach Versuchsaufbau an.
   8. Wechseln Sie zur nächsten Dockingstation, und richten Sie sie ein, indem Sie die Schritte 5.2.3 bis 5.2.7 wiederholen.
3. Vorbereitung der CIM-Platten
   1. Eine Stunde vor Beginn der Zellimpedanzmessung werden die Vertiefungen der unteren Kammer der CIM-Platte mit 160 μl DMEM gefüllt, das 10 % Serum oder andere Chemolockstoffe enthält.
   2. Montieren Sie die obere Kammer, die die gelbeschichteten ECM-Wells (für die Invasion) oder die unbeschichteten Wells (für die Migration) enthält, mit der unteren Kammer.
   3. Geben Sie 50 μl niedriges Serummedium in die Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte für den Zellmigrationsassay und legen Sie die CIM-Platte in die Halterung des Systems.
   4. Klicken Sie auf die Registerkarte Meldung, und stellen Sie sicher, dass die Meldung Verbindungen ok angezeigt wird. Die CIM-Platte ist nun bereit für das Experiment.
   5. Die montierte CIM-Platte wird vor der Echtzeit-Zellanalyse 30-60 min im CO₂ -Inkubator vorinkubiert, um die CIM-Platte an die Kulturbedingungen zu gewöhnen.

6. Zellanalyse und Datenexport in Echtzeit

HINWEIS: Führen Sie eine Baseline-Messung, Zellimpfung, Zellimpedanzmessung und Datenexport durch, wie zuvor beschrieben¹¹.

1. Baseline-Ablesung
   HINWEIS: Die Baseline sollte abgelesen werden, nachdem die CIM-Platte akklimatisiert ist und bevor die Zellen in die Vertiefungen der oberen Kammer gegeben werden.
   1. Klicken Sie für jede Halterung auf die Schaltfläche Start . Wenn das Fenster " Speichern unter" angezeigt wird, speichern Sie die experimentelle Datei, um die Baseline-Messung durchzuführen.
2. Aussaat von Zellen
   1. Nehmen Sie die CIM-Platte aus der Halterung und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank auf den Plattenhalter.
   2. Geben Sie 100 μl (mit 100.000 Zellen) elektroporierte Zellen in die Vertiefungen der oberen Kammer der CIM-Platte gemäß dem Programm in der Steuereinheit. Wenden Sie die umgekehrte Pipettiermethode an und vermeiden Sie dabei Luftblasen.
   3. Lassen Sie die CIM-Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter der Biosicherheitswerkbank, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gleichmäßig auf dem Boden der Vertiefung verteilen.
3. Messung der Zellimpedanz
   1. Schieben Sie die fertig montierte CIM-Platte zurück in die jeweilige Halterung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um die Zellimpedanzmessung für den zweiten Schritt zu starten.
   2. Klicken Sie auf die Registerkarte Zeichnen , klicken Sie dann auf die Schaltfläche Alle hinzufügen und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Durchschnitt und STD DEV , um die Daten in Echtzeit zu visualisieren.
      Hinweis: Die Standard-Zeichnungsoption ist Zeit für die X-Achse und Zellenindex für die Y-Achse. Im Abschnitt Plotauswahl kann der Benutzer alternative Optionen für die Y-Achse auswählen: Normalisierter Zellenindex oder Delta-Zellenindex. Sobald der letzte Sweep durchgeführt wurde, ist das Experiment abgeschlossen, und die Ergebnisse werden automatisch gespeichert.
4. Export der Daten zur Analyse
   1. Klicken Sie auf die Registerkarte Zeichnen und wählen Sie die Felder Durchschnitt und STD DEV aus, um die Daten für jede Vertiefung einzeln zu kopieren.
   2. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zeichnungsfläche, und wählen Sie Daten im Listenformat kopieren aus.
   3. Öffnen Sie eine leere Tabellenkalkulationsdatei, fügen Sie die Daten ein, und speichern Sie die Datei.
   4. Kehren Sie zum Analyseprogramm zurück, klicken Sie für jede Halterung auf die Registerkarte Platte und wählen Sie Freigeben , um das Experiment für die Halterung zu schließen.
   5. Kehren Sie zur Tabellenkalkulationsdatei zurück und passen Sie die Zeit der Rohdaten so an, dass die Startzeit im zweiten Schritt zur tatsächlichen Startzeit für die Messung wird.

Crk- und CrkL-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Motilität vieler Zelltypen, darunter Neuronen22, T-Zellen23, Fibroblasten 18,19 und eine Vielzahl von Tumorzellen13. Da Crk- und CrkL-Proteine im Glioblastom24,25,26 erhöht sind, wurden in dieser Arbeit die Auswirkungen der Überexpression von CrkI, einer Spleißvariante von Crk, auf die Glioblastom-Zellmigration untersucht. U-118MG-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen synthetischer CrkI-mRNA elektroporiert und auf Proteingehalte und Zellmigration analysiert. Die Elektroporation von U-118MG-Glioblastomzellen mit unterschiedlichen Konzentrationen synthetischer CrkI-mRNA führte 1 Tag nach der Transfektion zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg des FLAG-markierten CrkI-Proteins (Abbildung 1A). Während 0,2 ng/μL und 2 ng/μL mRNA zu einer nicht nachweisbaren oder bescheidenen Expression des exogenen CrkI-Proteins führten, führte 20 ng/μL mRNA zu einer deutlich höheren Expression als das endogene CrkI-Protein.

Die Ergebnisse des Zellmigrationstests mit dem Echtzeit-Zellanalysesystem zeigten, dass die Elektroporation mit 0,2 ng/μL oder 2 ng/μL CrkI-mRNA die Zellmigration nicht wesentlich beeinflusste. Die Elektroporation mit 20 ng/μL CrkI-mRNA führte jedoch zu einer deutlichen Stimulation der Zellmigration, wobei zwischen 2 h und 13 h mehr Zellen migrierten (Abbildung 1B). Der Vergleich zwischen dem CrkI-Proteinspiegel und der Zellmigration zeigte, dass die Glioblastom-Zellmigration durch den Anstieg des CrkI-Proteinspiegels stimuliert wurde. Es scheint, dass der CrkI-Proteinspiegel über einem bestimmten Schwellenwert liegen sollte, um eine substanzielle Stimulation der Zellmigration zu bewirken. Wenn die Zellmigration auf unterschiedliche Weise gemessen worden wäre, um die migrierten Zellen zu bestimmten Zeitpunkten zu zählen oder zu beobachten, wäre möglicherweise viel mehr Aufwand erforderlich gewesen, um diese Art von Veränderung der Zellmigration zu identifizieren.

Um zu untersuchen, wie die CrkL-Überexpression die Invasion von Glioblastomzellen durch ECM-Gelschichten mit unterschiedlichen Konzentrationen von ECM-Proteinen beeinflusst, wurden U-118MG-Zellen mit synthetischer CrkL-mRNA elektroporiert und hinsichtlich der Proteinkonzentrationen und der Zellinvasion durch eine ECM-Gelschicht analysiert. Die Elektroporation von U-118MG-Glioblastomzellen mit synthetischer CrkL-mRNA führte 1 Tag nach der Transfektion zu einer robusten Expression des FLAG-markierten CrkL-Proteins (Abbildung 2A). Mit zunehmender Konzentration der EZM-Proteine verlangsamte sich die Invasion der Kontrollzellen (Abbildung 2B). CrkL-überexprimierende Zellen zeigten auch eine von der EZM-Gelkonzentration abhängige Abnahme der Zellinvasion (Abbildung 2C). Der Vergleich zwischen den Kontroll- und CrkL-überexprimierenden Zellen bei unterschiedlichen ECM-Gelkonzentrationen zeigte, dass die CrkL-Überexpression im Allgemeinen die Zellinvasion durch die ECM-Gelschicht stimulierte (Abbildung 2D-G). Der Unterschied zwischen den beiden Zellpopulationen wurde jedoch zu unterschiedlichen Zeitpunkten in Abhängigkeit von der EZM-Gelkonzentration deutlich.

Für das 0,1 μg/μl EZM-Gel war die CrkL-Überexpressions-vermittelte Stimulation der Zellinvasion zwischen 8 h und 20 h offensichtlich (Abbildung 2D), aber der Unterschied in der Zellinvasion war nach 32 h vernachlässigbar. Für das 0,2 μg/μl ECM-Gel war der Unterschied in der Zellinvasion mit und ohne CrkL-Überexpression zu jeder Zeit minimal (Abbildung 2E). Für das 0,5 μg/μl ECM-Gel war der Unterschied in der Zellinvasion zwischen 24 h und 36 h deutlich (Abbildung 2F). Für das 1 μg/μL ECM-Gel wurde der CrkL-Überexpressionseffekt auf die Zellinvasion nach 48 h leicht sichtbar (Abbildung 2G). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich das Zeitfenster, um den Unterschied zwischen den Kontroll- und CrkL-überexprimierenden Zellen zu erkennen, mit zunehmender Konzentration des ECM-Gels auf spätere Zeitpunkte verschiebt. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die beiden Zellpopulationen durch den Anstieg der EZM-Gelkonzentration zu unterschiedlichen Zeitpunkten unterschiedlich beeinflusst wurden. Zum Beispiel zeigten die CrkL-überexprimierenden Zellen nach 12 h nur bei 0,1 μg/μL ECM-Gel eine wesentlich höhere Invasion (Abbildung 2H). Nach 24 h zeigten die CrkL-überexprimierenden Zellen jedoch eine etwas höhere oder ähnliche Invasion bei den getesteten ECM-Gelkonzentrationen (Abbildung 2I). Daher ist es wichtig, sowohl die zeitabhängigen als auch die EZM-Gelkonzentrationsabhängigen Unterschiede in der Zellinvasion zu untersuchen, um einen umfassenden Überblick über die Unterschiede zwischen den beiden Zellpopulationen mit und ohne CrkL-Überexpression zu erhalten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von transienter Überexpression unter Verwendung synthetischer mRNA mit impedanzbasierten Echtzeit-Zellanalysen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Analyse der potenziellen Korrelation zwischen Genüberexpression und Tumorzellmigration und -invasion darstellt. Die Untersuchung der Auswirkungen von Konzentrationsschwankungen in der synthetischen mRNA und dem ECM-Gel würde genauere und detailliertere Informationen liefern.

Abbildung 1: Die Auswirkungen der CrkI-Überexpression auf die Migration von Glioblastomzellen. U-118MG-Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen (ng/μl) der FLAG-markierten CrkI-mRNA elektroporiert. (A) Für die Western-Blot-Analysen wurden die elektroporierten Zellen 1 Tag lang kultiviert, bevor die Gesamtzelllysat-Präparation durchgeführt wurde. Die Proteinspiegel bei Transfektion mit synthetischer CrkI-mRNA wurden verglichen. Anti-Crk- und Anti-CrkL-Antikörper wurden verwendet, um sowohl die endogenen als auch die FLAG-markierten Proteine zu detektieren und das Verhältnis zwischen den endogenen Proteinen und den FLAG-markierten Proteinen zu vergleichen. Vinculin und α-Tubulin wurden als Belastungskontrollen verwendet. (B) Für die Zellmigrationsanalysen wurden die elektroporierten Zellen ohne weitere Kultur auf eine CIM-Platte plattiert. Die Zellindexwerte wurden aus vier Vertiefungen für jede Probe ermittelt, und ihre Mittelwerte ± SD-Werte sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Auswirkungen der CrkL-Überexpression auf die Invasion von Glioblastomzellen. U-118MG-Zellen wurden mit nukleasefreierH2O- oder 20 ng/μL FLAG-markierter CrkL-mRNA elektroporiert. (A) Für die Western-Blot-Analysen wurden die elektroporierten Zellen 1 Tag lang kultiviert, bevor die Gesamtzelllysat-Präparation durchgeführt wurde. Die Proteinspiegel bei Transfektion mit synthetischer CrkL-mRNA wurden verglichen. Anti-Crk- und Anti-CrkL-Antikörper wurden verwendet, um sowohl die endogenen als auch die FLAG-markierten Proteine zu detektieren und das Verhältnis zwischen den endogenen Proteinen und den FLAG-markierten Proteinen zu vergleichen. Vinculin und α-Tubulin wurden als Belastungskontrollen verwendet. (B-G) Für die Zellinvasionsanalyse wurden die elektroporierten Zellen ohne weitere Kultur auf eine CIM-Platte mit einer ECM-Gelbeschichtung plattiert. Die Zellindexwerte wurden aus vier Vertiefungen für jede Probe ermittelt, und ihre Mittelwerte ± SD-Werte sind dargestellt. (B) Die Zellinvasionsdaten der Kontrollzellen mit unterschiedlichen EZM-Gelkonzentrationen wurden verglichen. (C) Die Zellinvasionsdaten der CrkL-überexprimierenden Zellen mit verschiedenen EZM-Gelkonzentrationen wurden verglichen. (D-G) Die Zellinvasionsdaten zwischen den Kontroll- und CrkL-überexprimierenden Zellen wurden für die angegebene ECM-Gelkonzentration verglichen. (H) Ein Vergleich der Zellinvasion nach 12 h zwischen den Kontroll- und CrkL-überexprimierenden Zellen. (I) Ein Vergleich der Zellinvasion nach 24 Stunden zwischen den Kontroll- und CrkL-überexprimierenden Zellen. Abkürzungen: ECM = extrazelluläre Matrix; CIM = Zellinvasion und -migration. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der experimentellen Abläufe nach Gen-Knockdown oder Gen-Überexpression . (A) Das experimentelle Verfahren der Echtzeit-Zellanalyse nach der siRNA-Transfektion. Da nach der siRNA-Transfektion unter den experimentellen Bedingungen 3-4 Tage benötigt werden, um einen vollständigen Genknockdown zu induzieren, wurden die Zellen nach der Elektroporation 3 Tage lang neu plattiert und kultiviert, bevor sie für Echtzeit-Zellanalysen bereit waren. (B) Das experimentelle Verfahren für die Echtzeit-Zellanalyse nach der synthetischen mRNA-Transfektion. Da die Proteinexpression aus der synthetischen mRNA-Transfektion schnell ist, wurden die elektroporierten Zellen noch am selben Tag für Echtzeit-Zellanalysen verwendet. Beachten Sie den Unterschied zwischen den beiden experimentellen Verfahren. Während die Echtzeit-Zellanalyse 3 Tage nach der Elektroporation für den Gen-Knockdown mit siRNAs durchgeführt wurde, wurde die Echtzeit-Zellanalyse direkt nach der Elektroporation auf Genüberexpression mit synthetischer mRNA durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.