Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/64274
Automatic Translation
1,2, 1
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

Summary

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

Abstract

תאי הגידול הם תנועתיים ופולשניים מאוד ומציגים דפוסי ביטוי גנים משתנים. הידע על האופן שבו שינויים בביטוי גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול חיוני להבנת מנגנוני חדירת תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות וגרורות. בעבר, הוכח כי הפלת גנים ואחריה מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם, מאפשרת לזהות את הגנים הדרושים לנדידת תאי הגידול ולפלישתם. לאחרונה, חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 הגבירו את העניין בשימוש ב- mRNA סינתטי למטרות טיפוליות. כאן, השיטה באמצעות mRNA סינתטי תוקנה כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי יתר של גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מחקר זה מדגים כי ביטוי גנים מוגבר עם טרנספקציה סינתטית של mRNA ואחריו מדידה בזמן אמת מבוססת עכבה עשויים לסייע בזיהוי הגנים המעודדים נדידת תאי גידול ופלישה. נייר שיטה זה מספק פרטים חשובים על ההליכים לבחינת ההשפעה של ביטוי גנים שונה על נדידת תאי הגידול ופלישתם.

Introduction

תנועתיות תאי הגידול ממלאת תפקיד מכריע בגרורות 1,2. התפשטות תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות ומרוחקות מקשה על הטיפול בסרטן ותורמת להישנות 3,4. לכן, חיוני להבין את מנגנוני תנועתיות תאי הגידול ולפתח אסטרטגיות טיפוליות רלוונטיות. מאחר שלתאי גידול רבים יש שינויים בפרופילי ביטוי הגנים, חיוני להבין אילו שינויים בפרופיל ביטוי הגנים מובילים לשינוי בתנועתיות תאי הגידול 5,6.

מספר בדיקות פותחו כדי למדוד נדידת תאים במבחנה. חלק מהבדיקות מספקות מידע מוגבל בלבד מכיוון שהן מאפשרות מדידות רק בנקודות זמן ספציפיות, בעוד שאחרות מציעות מידע מקיף על תנועתיות תאי הגידול בזמן אמת7. למרות שרבים ממבחני תנועתיות התא הללו יכולים לספק תוצאות כמותיות בזמן נתון או בנקודת הקצה, הם אינם מספקים מידע מפורט מספיק על שינויים דינמיים בקצב נדידת התאים במהלך תקופת הניסוי. בנוסף, ייתכן שיהיה קשה לבחון שינויים אפשריים בקצב נדידת התאים בהתאם לתכנון הניסוי, סוגי התאים ומספרי התאים. יתר על כן, ניתן לחקור את ההשפעות של טיפולים לא מסובכים על ידי כימות פשוט של מבחני תנועתיות מסורתיים, אך ייתכן שיהיה צורך בכימות מתוחכם יותר כדי לחקור את ההשפעות המורכבות של טיפולים משולבים שונים8.

פותח מכשיר לניטור הזרם החשמלי של צלחת מיקרוטיטר המכוסה היטב במיקרואלקטרודות9. היצמדות התאים לפני השטח של הבאר מעכבת את זרימת האלקטרונים, והעכבה מתואמת עם הקישור הכמותי והאיכותי של התאים. נוכחות המיקרואלקטרודות על קרקעית הבאר מאפשרת מדידה של הידבקות תאים, התפשטות והתפשטות. נוכחות המיקרואלקטרודות מתחת לקרום מיקרו-נקבובי של החדר העליון מאפשרת מדידה של נדידת תאים ופלישה לתוך החדר התחתון, כאשר החדר העליון מצופה בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) כדי לאפשר פלישה10.

בעבר, הוכח כי מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם מספקות נתונים בזמן אמת במהלך הניסוי כולו, כמו גם השוואות וכימות מיידיות בתנאי ניסוי שונים11. במאמר שיטה זה, הושרה הפלת גנים כדי לבחון את תפקידם של חלבונים בעלי עניין בנדידת תאי גידול ופלישה. מכיוון שאפקט הפלה גנטי מלא בתנאי הניסוי שנבדקו לקח 3-4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם רנ"א מפריע קטן (siRNAs)8, התאים צופו מחדש לאחר האלקטרופורציה ונקצרו מחדש 3 ימים לאחר מכן לצורך מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם.

הרגולטור CT10 של קינאז (Crk) ודמוי Crk (CrkL) הם חלבוני מתאם המתווכים אינטראקציות חלבון-חלבון במורד הזרם של מסלולים שונים של קולטן גורם גדילה קינאז ומסלולים לא קולטנים טירוזין קינאז12. רמות גבוהות של חלבוני Crk ו-CrkL תורמות לפרוגנוזה גרועה במספר סוגי סרטן בבני אדם, כולל גליובלסטומה13. עם זאת, לא ברור כיצד חלבוני Crk ו-CrkL גבוהים מובילים לפרוגנוזה גרועה. לכן, חשוב להגדיר את ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על תפקודי תאי הגידול. בעבר, בוצע מחקר הפלה גנטית כדי להדגים כי רמות אנדוגניות של חלבוני Crk ו- CrkL נדרשות עבור נדידת תאי גליובלסטומה ופלישה8. כאן, פותחה מערכת בדיקה שונה כדי להתמודד עם ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על נדידת תאי הגידול ופלישה.

לאחרונה, הסינתזה במבחנה של mRNA ויישומיו הטיפוליים משכו תשומת לב מחודשת עקב פיתוח חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 (נסקר על ידי Verbeke et al.14). בנוסף, התקדמות יוצאת דופן נעשתה בשימוש mRNA סינתטי בסרטן ומחלות אחרות15,16. אלקטרופורציה של תאים היא שיטה יעילה להעברת mRNA סינתטי ולהשראת שינוי גנטי חולף (נבדק על ידי Campillo-Davo et al.17), והשימוש ב-mRNA סינתטי מאפשר ביטוי גנים מהיר ויעיל בפיברובלסטים אימורטליים18. מאמר שיטה זה משלב ביטוי יתר של גנים באמצעות mRNA סינתטי עם אנליזות תאים בזמן אמת כדי לחקור נדידה ופלישה של תאי גידול. עם זאת, סכמת הניסוי המשמשת עבור siRNA אינה פועלת עם transfection mRNA סינתטי, כמו רמת חלבונים אקסוגניים עולה במהירות ויורדת בהדרגה עם transfection mRNA סינתטי18. לכן, השיטה שונתה כדי לבצע ניתוח בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה מיד לאחר transfection מבלי בנוסף תרבית את התאים.

מאמר שיטה זה מדגים כי שילוב מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת עם טרנספקציה של תאי גידול עם mRNA סינתטי מספק ניתוח מהיר ומקיף של ההשפעות של upregulation גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מאמר שיטה זה מתאר נהלים מפורטים למדידת האופן שבו הגירה ופלישה של תאי גליובלסטומה מושפעים מביטוי יתר של Crk ו- CrkL. על ידי בחינת ההשפעות תלויות הריכוז של mRNA סינתטי על נדידת תאי גידול, המאמר מתאר בבירור כיצד עלייה ברמות החלבון מעודדת נדידת תאי גידול. בנוסף, מוצגת גישה של שינוי ריכוז ג'ל ECM כדי להעריך את ההשפעות של שינויים בביטוי גנים על פלישת תאי גידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של mRNA

הערה: עבור סינתזת mRNA, כל הריאגנטים והציוד חייבים להיות מטופלים במיוחד כדי להשבית את RNases לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. ליניאריזציה של DNA
    הערה: cDNA עכברי של CrkI ו- CrkL שוכפלו לווקטור הביטוי pFLAG-CMV-5a כדי להוסיף את תג האפיטופ FLAG במסוף C ושכפלו לווקטור pcDNA3.1/myc-His כדי לשלב את מקדם T7, כפי שתואר קודם לכן 18,19.
    1. הוסף 10 μL של חיץ תגובה 10x, 1.5 μL של PmeI (10,000 יחידות / מ"ל), ו 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לצינור מיקרוצנטריפוגה כדי ליניאריזציה של DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -100 μL.
    2. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
    3. יש לסחרור, ולהוסיף 5 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו-1 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל, דרגת RNA) לתערובת התגובה. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור בטמפרטורה של 50°C למשך 30 דקות.
    4. מתחת למכסה המנוע, הוסף 100 μL של השלב התחתון של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל לתערובת תגובת פלסמיד למיצוי. מערבולת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 18,800 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את השלב העליון לצינור חדש.
    5. חזור על שלב 1.1.4 עם כלורופורם:אלכוהול איזואמיל בשעה 24:1.
    6. בצינור החדש, להביא את נפח התגובה ל 300 μL על ידי הוספת 200 μL של מים ללא nuclease, ולאחר מכן להוסיף 30 μL של 3 M נתרן אצטט ו 600 μL של 100% אתנול.
    7. מערבבים על ידי מערבולת, ולאחר מכן מניחים ב -20 ° C למשך 30-60 דקות עבור משקעים אתנול של ה- DNA.
    8. צנטריפוגה ב 18,800 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין.
    9. יבש עם מכסה פתוח במשך 2 דקות, להוסיף 30 μL של מים ללא nuclease, ולהשהות מחדש את גלולת DNA.
    10. קבע את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
    11. אמת את הגודל והכמות של ה- DNA הליניארי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  2. סינתזת RNA באמצעות T7 RNA פולימראז
    1. הוסף 2 μL כל אחד של 10x מאגר שעתוק, ATP, GTP, UTP, CTP ו- T7 ו- 1 מיקרוגרם של DNA ליניארי לצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -20 μL.
    2. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים לסינתזה של RNA.
    3. יש לסובב כלפי מטה, להוסיף 1 μL של DNase (2 U/μL), ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות כדי להסיר את הדנ"א של התבנית.
  3. משקעים ליתיום כלורי של RNA
    1. הוסף 10 μL של ליתיום כלורי (7.5 M) לתערובת התגובה. ערבבו על ידי הקשה, סחררו כלפי מטה ודגרו על תערובת התגובה בטמפרטורה של -20°C למשך 30 דקות.
    2. צנטריפוגה ב-18,800 × גרם למשך 20 דקות ב-4°C, יש להשליך את הסופרנטנט ולשטוף את הגלולה ב-500 μL של 70% אתנול. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין.
    3. יבש עם מכסה פתוח במשך 2 דקות, להוסיף 30 μL של מים ללא nuclease, ולהשהות מחדש את גלולת RNA.
  4. מכסה
    1. חממו את דגימת הרנ"א בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו אותה על קרח לקירור.
    2. הוסף 5 μL כל אחד של 10x capping buffer, 10 mM GTP ו-1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM), 2 μL כל אחד של תערובת אנזימי מכסה ותערובת אנזימים O-methyltransferase, ו-1.25 μL של מעכב RNase. יש לערבב על-ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
  5. זנב Poly(A)
    1. סובב את הדגימה ולאחר מכן הוסף 6 μL של מים נטולי nuclease, 20 μL של 5x E-PAP buffer, 10 μL של 25 mM MnCl2, 10 μL של 10 mM ATP, ו 4 μL של E-PAP poly(A) אנזים זנב. יש לערבב על-ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.
  6. משקעי ליתיום כלורי וכימות ה-mRNA הסינתטי
    1. הוסף 50 μL של ליתיום כלורי (7.5 M), ובצע משקעים ליתיום כלורי כמתואר בשלבים 1.3.1-1.3.3.
    2. למדוד את ריכוז ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
    3. ודא את הגודל והכמות של mRNA באמצעות פורמלדהיד (1%-2%) אגרוז (1%) אלקטרופורזה בג'ל.

2. ציפוי ג'ל מטריצה חוץ-תאית (ECM) של לוחות הפלישה והנדידה של התא (CIM)

הערה: לוח פלישה ונדידת תאים (CIM) הוא לוח 16 בארות המיוצר באופן מסחרי לניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה. עבור בדיקת הפלישה לתאים, לצפות לוחות CIM עם ג'ל ECM, כפי שתואר קודם אבל עם כמה שינויים11.

  1. הסר aliquot של ציר ג'ל ECM מהמקפיא ולשמור אותו על קרח.
  2. לדלל את ג'ל ECM (10 מ"ג / מ"ל) לריכוז עבודה (100 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי ערבוב 990 μL של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) (ללא סרום או אנטיביוטיקה) עם 10 μL של ג'ל ECM בצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבבים על ידי פיפטינג עדין.
  3. הוסף 60 μL של ג'ל ECM מדולל לכל אחת מ -16 הבארות של החדר העליון של צלחת CIM. יש ליישם את שיטת הצנרת ההפוכה תוך הימנעות מבועות אוויר20,21.
    הערה: מטב את ריכוז ג'ל ECM עבור כל קו תאים. עבור קווי תאי גליובלסטומה, 0.1 מיקרוגרם / μL עד 1 מיקרוגרם / μL ג'ל ECM שימש לאופטימיזציה.
  4. הניחו את החדר העליון של צלחת CIM עם כיסוי הצלחת על יריעת פלסטיק מגנה בתוך אינקובטור CO2 למשך כ-4 שעות ליצירת שכבת ג'ל.
    זהירות: במהלך ציפוי צלחת CIM בג'ל ECM, האלקטרודות של החדר העליון של צלחת CIM לא אמורות להיות במגע ישיר עם ידיו של הנסיין או עם משטחי הציוד, כולל ארון הבטיחות הביולוגית או אינקובטור CO2 .

3. הכנת תאי הגידול

הערה: כל חומרי תרבית התאים חייבים להישמר סטריליים. קצור וחשמל את תאי הגידול תחת ארון בטיחות ביולוגי עם ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כפי שתואר קודם לכן אך עם כמה שינויים11.

  1. תרבית תאי הגידול
    1. תרבית תאי U-118MG ב-10 מ"ל DMEM המכילים 5% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה לכל צלחת תרבית רקמת פוליסטירן בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ ב-37°C באינקובטור 5% CO2 (מצב תרבית).
  2. דלדול בסרום של תאי הגידול
    הערה: יש למזער את החשיפה של התאים לכימואטרקנטים הנמצאים ב- FBS לפני נדידת התאים ומבחני הפלישה באמצעות ריכוז גבוה של FBS.
    1. הסר את המדיום הישן, והוסף 10 מ"ל של DMEM שחומם מראש המכיל 0.5% FBS ו 1% אנטיביוטיקה לכל צלחת (בינוני בסרום נמוך).
    2. חזור על שלב 3.2.1.
    3. לדגור על התאים ב 37 ° C ב 5% CO2 אינקובטור במשך 4 שעות או יותר.
  3. קצירת תאי הגידול
    1. הסר את התווך הישן, הוסף 8 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) שחומם מראש לכל מנה, הסר את DPBS, הוסף 0.05% טריפסין-EDTA שחומם מראש (2 מ"ל לצלחת) כדי לכסות את פני השטח, ודגר באינקובטור CO2 במשך 30 שניות.
    2. שאפו בזהירות את הטריפסין-EDTA, הוסיפו מדיום נמוך בסרום (7 מ"ל/צלחת), ולאחר מכן אספו תאים לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל או 15 מ"ל.
    3. Aliquot נפח קטן של תאים, ולהשתמש מונה תאים אוטומטי כף יד כדי לספור את התאים.
    4. חשב את מספר התאים הכולל ואת הנפח הדרוש עבור 10,000 תאים/μL.
    5. סובב את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 100 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוף את supernatant, להוסיף את נפח מחושב של DMEM המכיל 0.5% FBS (ללא אנטיביוטיקה), ובעדינות להשעות מחדש את גלולת התא.
    6. מעבירים 110 μL של תרחיף התא, המכיל 1.1 מיליון תאים, לצינור מיקרוצנטריפוגה לכל טיפול.
    7. חזור על שלב 3.3.6 כדי להעביר את התאים לארבע צינורות מיקרוצנטריפוגות עבור ארבעה טיפולים שונים.
      הערה: צלחת CIM יש בסך הכל 16 בארות. תכנן ארבעה טיפולים שונים להשוואה, כך שניתן יהיה להקצות ארבע בארות של צלחת CIM לכל טיפול. השתמש בתאים המחושלים לניסויים הבאים: ניתוחי כתמים מערביים (0.3 מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמה של 35 מ"מ), ארבע בארות של מבחני נדידת תאים בזמן אמת (0.1 מיליון תאים / באר), וארבע בארות של מבחני פלישת תאים בזמן אמת (0.1 מיליון תאים / באר) עבור כל טיפול. התאם את מספר התאים שיש לחשמל אם תכנון הניסוי משתנה.

4. אלקטרופורציה של תאי הגידול

  1. כדי להסיר את התווך, הוסף 1 מ"ל של DPBS לתרחיף התא בכל צינור, סובב את תרחיף התא שלוש פעמים במשך 10 שניות בכל פעם תוך סיבוב הצינור 180° כל 10 שניות באמצעות מיני צנטריפוגה, והסר את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה.
    הערה: חשוב ליצור כדורית תא קומפקטית אך ניתנת להשעיה בקלות.
  2. הוסף 110 μL של חיץ תרחיף R לגלולת התא כדי לקבל 0.1 מיליון תאים ב 10 μL.
  3. הוסף mRNA סינתטי לכדורית התא כדי לקבל ריכוז של 0.2-20 ng/μL בהתאם לרמת הביטוי הרצויה. ערבבו והשהו מחדש את כדורית התא בעדינות על ידי הקשה או פיפטינג עדין.
    הערה: השתמש בריכוזים שונים של mRNA סינתטי, בחן את ביטוי החלבון באמצעות ניתוח כתמים מערביים, וקבע את ריכוז ה- mRNA הסינתטי המוביל לרמת הביטוי הרצויה על מנת לחקור את הקשר הספציפי בין ביטוי החלבון לבין ההשפעות הביולוגיות.
  4. אלקטרופורטאט 10 μL של תרחיף התא עם מערכת אלקטרופורציה ב 1,350 V למשך 10 אלפיות השנייה עם שלוש פעימות בכל פעם.
  5. העבר את התאים המחושלים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש עם 1.1 מ"ל DMEM המכיל 0.5% FBS.
  6. חזור על האלקטרופורציה עד ששאר תרחיף התא מתחשמל. שלב את התאים המחושלים בצינור המיקרוצנטריפוגה כדי לקבל 1.1 מיליון תאים ב -1.1 מ"ל.
    הערה: ניתן להשתמש בקצוות אלקטרופורציה של 100 μL ו- 10 μL כדי לחשמל נפח גדול של תאים, אך עצות האלקטרופורציה עבור 10 μL ו- 100 μL כלולות בשתי ערכות נפרדות ויש לרכוש אותן בנפרד. חיץ המתלים R כלול בשתי הערכות.
  7. עם השלמת כל האלקטרופורציות המתאימות, השהה מחדש בעדינות את התאים המאוגרים.
  8. צלחת 0.3 מיליון תאים בצלחת תרבית רקמת פוליסטירן 35 מ"מ x 10 מ"מ עם 2 מ"ל DMEM המכיל 5% FBS, ותרבית את התאים במשך יום אחד בתנאי התרבית להכנת ליזט התא הכולל וניתוח כתמים מערביים.
  9. שמור את שאר התאים המתחשמלים בטמפרטורת החדר עד שמערכת ניתוח התאים בזמן אמת תהיה מוכנה.

5. הגדרת מנתח התאים בזמן אמת, התוכנית ולוחות CIM

הערה: הכן את מנתח התאים בזמן אמת ושני לוחות CIM, כמתוארלעיל 11.

  1. שיווי משקל של מנתח תאים בזמן אמת
    1. העבר את מנתח התאים בזמן אמת לאינקובטורCO2 מספר שעות לפני השימוש כדי לאזן את המערכת בתנאי התרבית.
  2. הגדרת תוכנית הניתוח
    1. פתח את תוכנית הניתוח על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת ניתוח התאים בזמן אמת בשולחן העבודה.
    2. לאחר שהאפשרות Default Experiment Pattern Setup פתוחה, בחר באפשרות להפעלת שלושה ניסויים בנפרד.
      הערה: לכל עריסה יש חלון נפרד. ישנן כרטיסיות שונות להגדרת מרווח המדידה ומשך, ניתוח נתונים ותנאי ניסוי אחרים.
    3. פתח כל עריסה על ידי לחיצה על הכרטיסייה מספר .
    4. לחץ על הכרטיסייה הערות ניסוי , בחר את התיקיה שבה הנתונים יישמרו והזן את שם הניסוי.
    5. לחץ על הכרטיסייה פריסה , הגדר בארות מרובעות עבור כל תנאי טיפול על ידי בחירת ארבע בארות בכל פעם והזנת פרטי הדגימה ולאחר מכן לחץ על החל.
    6. לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים | הוסף שלב כדי להגדיר את המצב הדו-שלבי של מדידות עכבת התא. לאחר מכן, לחץ על החל כדי להגדיר את הצעד הראשון.
    7. לחץ על הוסף שלב שוב, הזן 10 דקות עבור מרווח הזמן ו 48 שעות עבור משך עבור הגירה ופלישה, ולחץ על החל כדי להגדיר את השלב השני.
      הערה: השלב הראשון כולל מדידה חד-פעמית של קו הבסיס (טאטוא אחד במרווח של דקה). השלב השני מודד את עכבת התא עבור הניסוי (לדוגמה, 289 טאטוא עם מרווח של 10 דקות במשך 48 שעות) בעריסה. התאם את המרווח ומשך הזמן בהתאם לתכנון הניסוי.
    8. עבור לעריסה הבאה והגדר אותה על-ידי חזרה על שלבים 5.2.3-5.2.7.
  3. הכנת לוחות CIM
    1. שעה לפני תחילת מדידת עכבת התא, מלא את הבארות של החדר התחתון של צלחת CIM עם 160 μL של DMEM המכיל 10% סרום או chemoattractants אחרים.
    2. הרכיבו את החדר העליון המכיל את הבארות מצופות הג'ל ECM (לפלישה) או בארות לא מצופות (להגירה) עם החדר התחתון.
    3. הוסף 50 μL של מדיום נמוך בסרום לבארות של החדר העליון של צלחת CIM עבור בדיקת נדידת תאים, ומקם את צלחת CIM בעריסה של המערכת.
    4. לחץ על הכרטיסייה הודעה וודא שההודעה חיבורים בסדר מוצגת. לוח CIM מוכן כעת לניסוי.
    5. דגרו מראש על צלחת CIM שהורכבה באינקובטור CO2 למשך 30-60 דקות לפני ניתוח התאים בזמן אמת כדי להתאים את צלחת CIM למצב התרבית.

6. ניתוח תאים בזמן אמת וייצוא נתונים

הערה: בצע קריאה בסיסית, זריעת תאים, מדידת עכבת תאים וייצוא נתונים כמתוארלעיל 11.

  1. קריאה בסיסית
    הערה: יש לקרוא את קו הבסיס לאחר התאקלמות לוח CIM ולפני הוספת התאים לבארות החדר העליון.
    1. לחץ על לחצן התחל עבור כל עריסה. כשהחלון Save As מופיע, שמור את הקובץ הניסיוני כדי לבצע את הקריאה הבסיסית.
  2. זריעת תאים
    1. הסר את צלחת CIM מהעריסה והנח אותה בארון הבטיחות הביולוגית על מחזיק הצלחת.
    2. הוסף 100 μL (המכיל 100,000 תאים) של תאים מחושמלים לבארות של החדר העליון של לוח CIM בהתאם לתוכנית ביחידת הבקרה. יש ליישם את שיטת הפיטינג ההפוך תוך הימנעות מבועות אוויר.
    3. השאירו את צלחת CIM מתחת לארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לוודא שהתאים מתפשטים באופן שווה על קרקעית הבאר.
  3. מדידת עכבת תאים
    1. העבר את צלחת CIM שהורכבה במלואה בחזרה לעריסה המתאימה. לחץ על לחצן התחל העריסה כדי להתחיל את מדידת עכבת התא לשלב השני.
    2. לחץ על הכרטיסייה מגרש ולאחר מכן לחץ על הלחצן הוסף הכל ובחר בתיבות ממוצע ו - STD DEV כדי להציג את הנתונים באופן חזותי בזמן אמת.
      הערה: אפשרות ברירת המחדל להתוויה היא Time עבור ציר x ואינדקס תאים עבור ציר y. המקטע 'בחירת התווייה ' מאפשר למשתמש לבחור אפשרויות חלופיות לציר y: אינדקס תאים מנורמל או אינדקס תא דלתא. לאחר ביצוע הטאטוא הסופי, הניסוי הושלם, והתוצאות נשמרות באופן אוטומטי.
  4. ייצוא הנתונים לניתוח
    1. לחץ על הכרטיסייה מגרש ובחר את התיבות ממוצע ו - STD DEV כדי להעתיק את הנתונים עבור כל באר בנפרד.
    2. לחץ לחיצה ימנית על אזור ההתווייה ובחר העתק נתונים בתבנית רשימה.
    3. פתח קובץ גיליון אלקטרוני ריק, הדבק את הנתונים ולאחר מכן שמור את הקובץ.
    4. חזור לתוכנית הניתוח, לחץ על הכרטיסייה צלחת עבור כל עריסה ובחר שחרור כדי לסגור את הניסוי עבור העריסה.
    5. חזור לקובץ הגיליון האלקטרוני והתאם את זמן הנתונים הגולמיים כך ששעת ההתחלה בשלב השני תהפוך לשעת ההתחלה בפועל של המדידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלבוני Crk ו-CrkL ממלאים תפקידים חשובים בתנועתיות של סוגי תאים רבים, כולל תאי עצב22, תאי T23, פיברובלסטים 18,19 ומגוון תאי גידול13. מאחר שחלבוני Crk ו-CrkL דווחו כבעלי רמות גבוהות בגליובלסטומה24,25,26, נחקרו במחקר זה ההשפעות של ביטוי יתר של CrkI, גרסה של Crk, על נדידת תאי גליובלסטומה. תאי U-118MG עברו אלקטרופוזציה בריכוזים שונים של mRNA סינתטי מסוג CrkI ונותחו עבור רמות חלבון ונדידת תאים. האלקטרופורציה של תאי גליובלסטומה U-118MG עם ריכוזים משתנים של mRNA סינתטי CrkI הביאה לעלייה תלוית ריכוז בחלבון CrkI המתויג על ידי FLAG יום אחד לאחר הטרנספקציה (איור 1A). בעוד 0.2 ng/μL ו-2 ng/μL mRNA הובילו לביטוי צנוע או בלתי ניתן לגילוי של חלבון CrkI האקסוגני, 20 ng/μL mRNA הביא לרמת ביטוי גבוהה בהרבה מחלבון CrkI אנדוגני.

התוצאות מבדיקת נדידת התאים באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת הצביעו על כך שהאלקטרופורציה עם mRNA מסוג 0.2 ng/μL או 2 ng/μL CrkI mRNA לא השפיעה באופן משמעותי על נדידת התא. אולם אלקטרופורציה עם mRNA CrkI של 20 ננוגרם/מיקרוליטר הובילה לגירוי ברור של נדידת תאים, כאשר יותר תאים נדדו בין שעתיים ל-13 שעות (איור 1B). ההשוואה בין רמת החלבון CrkI לבין נדידת התאים גילתה כי נדידת תאי גליובלסטומה עוררה על ידי העלייה ברמת החלבון CrkI. נראה כי רמת החלבון CrkI צריכה להיות גבוהה מסף מסוים כדי לגרום לגירוי משמעותי של נדידת תאים. אם נדידת התאים הייתה נמדדת בדרכים שונות כדי לספור או לצפות בתאים הנודדים בנקודות זמן מסוימות, ייתכן שהיה נדרש מאמץ רב יותר כדי לזהות שינוי מסוג זה בנדידת תאים.

כדי לחקור כיצד ביטוי יתר של CrkL משפיע על פלישת תאי גליובלסטומה דרך שכבות ג'ל ECM עם ריכוזים שונים של חלבוני ECM, תאי U-118MG עברו אלקטרופורציה עם mRNA סינתטי CrkL ונותחו במונחים של רמות החלבון ופלישת התאים דרך שכבת ג'ל ECM. האלקטרופורציה של תאי גליובלסטומה U-118MG עם mRNA סינתטי של CrkL הובילה לביטוי חזק של חלבון CrkL המתויג על ידי FLAG יום אחד לאחר הטרנספקציה (איור 2A). ככל שהריכוז של חלבוני ECM עלה, הפלישה של תאי הבקרה הואטה (איור 2B). תאים בעלי ביטוי יתר של CrkL הראו גם ירידה תלוית ריכוז ג'ל ECM בפלישת תאים (איור 2C). ההשוואה בין תאי הבקרה לבין תאי ביטוי יתר של CrkL בריכוזים שונים של ג'ל ECM הצביעה על כך שביטוי יתר של CrkL בדרך כלל עורר פלישה של תאים דרך שכבת הג'ל ECM (איור 2D-G). עם זאת, ההבדל בין שתי אוכלוסיות התאים נעשה ברור בנקודות זמן שונות בהתאם לריכוז ג'ל ECM.

עבור ג'ל ECM של 0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר, גירוי CrkL בתיווך ביטוי יתר של פלישת תאים היה ברור בין 8 שעות ל-20 שעות (איור 2D), אולם ההבדל בפלישת תאים היה זניח לאחר 32 שעות. עבור ג'ל ECM של 0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר, ההבדל בפלישת תאים עם וללא ביטוי יתר של CrkL היה מינימלי בכל עת (איור 2E). עבור ג'ל ECM של 0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר, ההבדל בפלישת התאים היה ניכר בין 24 שעות ל-36 שעות (איור 2F). עבור ג'ל ECM של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר, השפעת ביטוי היתר של CrkL על פלישת תאים התבררה מעט לאחר 48 שעות (איור 2G). התוצאות מצביעות על כך שהחלון לזיהוי ההבדל בין תאי הבקרה לבין תאי ביטוי יתר של CrkL משתנה לזמנים מאוחרים יותר ככל שריכוז ג'ל ECM עולה. התוצאות גם מצביעות על כך ששתי אוכלוסיות התאים הושפעו באופן דיפרנציאלי מהעלייה בריכוז ג'ל ECM בנקודות זמן שונות. לדוגמה, ב-12 שעות, התאים בעלי ביטוי יתר של CrkL הראו פלישה גבוהה יותר באופן משמעותי רק ב-0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר ECM ג'ל (איור 2H). אולם לאחר 24 שעות, התאים בעלי ביטוי יתר של CrkL הראו פלישה מעט גבוהה יותר או דומה בריכוזי ג'ל ECM שנבדקו (איור 2I). לכן, חשוב לחקור הן את ההבדלים תלויי הזמן והן את ההבדלים תלויי ריכוז ג'ל ECM בפלישת תאים כדי לקבל מבט מקיף על ההבדלים בין שתי אוכלוסיות התאים עם וללא ביטוי יתר של CrkL. תוצאות אלה מראות כי שילוב ביטוי יתר חולף באמצעות mRNA סינתטי עם ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה מספק כלי רב עוצמה לניתוח המתאם הפוטנציאלי בין ביטוי יתר של גנים לבין נדידת תאי הגידול ופלישה. בחינת ההשפעות של שינויי ריכוז ב-mRNA סינתטי ובג'ל ECM תספק מידע מדויק ומפורט יותר.

Figure 1
איור 1: ההשפעות של ביטוי יתר של CrkI על נדידת תאי גליובלסטומה. תאי U-118MG עברו אלקטרופוזציה עם הריכוזים המצוינים (ng/μL) של mRNA CrkI המתויג כ-FLAG. (A) עבור ניתוחי הכתם המערבי, התאים המחושמלים עברו תרבית במשך יום אחד לפני הכנת הליזט הכולל של התא. הושוו רמות החלבון לאחר טרנספקציה עם mRNA סינתטי CrkI . נוגדנים Anti-Crk ו- Anti-CrkL שימשו לזיהוי חלבונים אנדוגניים וחלבונים המתויגים ב- FLAG ולהשוואת היחס בין החלבונים האנדוגניים לחלבונים המתויגים ב- FLAG. Vinculin ו- α-tubulin שימשו כפקדי העמסה. (B) עבור ניתוחי נדידת תאים, התאים שהתחשמלו צופו על לוח CIM ללא תרבית נוספת. ערכי אינדקס התא התקבלו מארבע בארות עבור כל דגימה, וערכי ה- SD ± הממוצע שלהם מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השפעות של ביטוי יתר של CrkL על פלישה לתאי גליובלסטומה. תאי U-118MG התחשמלו עם H2O נטול נוקלאז או 20 ng/μL FLAG-tagged CrkL mRNA. (A) עבור ניתוחי הכתם המערבי, התאים המחושמלים עברו תרבית במשך יום אחד לפני הכנת הליזט הכולל של התא. הושוו רמות החלבונים בטרנספקציה עם mRNA סינתטי CrkL. נוגדנים Anti-Crk ו- Anti-CrkL שימשו לזיהוי חלבונים אנדוגניים וחלבונים המתויגים ב- FLAG ולהשוואת היחס בין החלבונים האנדוגניים לחלבונים המתויגים ב- FLAG. Vinculin ו- α-tubulin שימשו כפקדי העמסה. (ב-ג) לצורך ניתוח הפלישה לתאים, התאים המחושמלים צופו על צלחת CIM עם ציפוי ג'ל ECM ללא תרבית נוספת. ערכי אינדקס התא התקבלו מארבע בארות עבור כל דגימה, וערכי SD ± הממוצע שלהם מוצגים. (B) הושוו נתוני פלישת התאים מתאי הבקרה עם ריכוזי ג'ל ECM שונים. (C) הושוו נתוני הפלישה של התאים בעלי ביטוי יתר של CrkL עם ריכוזי ג'ל ECM שונים. (ד-ג) נתוני הפלישה לתאים בין תאי הבקרה לבין תאי ביטוי יתר של CrkL הושוו עבור ריכוז ג'ל ECM שצוין. (H) השוואה של פלישת התאים ב-12 שעות בין תאי הבקרה לבין תאי CrkL-overexpression. (I) השוואה של פלישת התאים ב-24 שעות בין תאי הבקרה לבין תאי CrkL-overexpression. קיצורים: ECM = מטריצה חוץ-תאית; CIM = פלישה והגירה של תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: דיאגרמות סכמטיות של ההליכים הניסיוניים בעקבות הפלת גנים או ביטוי יתר של גנים . (A) ההליך הניסיוני של אנליזת תאים בזמן אמת לאחר התמרת siRNA. מכיוון שנדרשים 3-4 ימים כדי לגרום להפלה מלאה של גנים לאחר טרנספקציה של siRNA בתנאי הניסוי, התאים צופו מחדש וגודלו בתרבית במשך 3 ימים לאחר האלקטרופורציה לפני שהיו מוכנים לניתוח תאים בזמן אמת. (B) ההליך הניסיוני לאנליזת תאים בזמן אמת לאחר טרנספקציית mRNA סינתטית. מכיוון שביטוי החלבונים מהתמרה סינתטית של mRNA הוא מהיר, התאים המחושלים שימשו לניתוח תאים בזמן אמת באותו היום. שימו לב להבדל בין שני הליכי הניסוי; בעוד שאנליזת תאים בזמן אמת בוצעה 3 ימים לאחר האלקטרופורציה לפירוק גנים באמצעות siRNAs, ניתוח תאים בזמן אמת בוצע מיד לאחר האלקטרופורציה לביטוי יתר של גנים עם mRNA סינתטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגירה ופלישה הן תכונות חשובות של תאי גידול. מדידת התנועתיות של תאי הגידול והבנת המנגנון הבסיסי השולט בתנועתיות תאי הגידול מספקים תובנות קריטיות לגבי התערבויות טיפוליות 2,27. מספר שיטות פותחו לחקר נדידת תאים7. בדיקת ריפוי פצעים באמצעות שריטות או תוספות תרבית היא שיטה פשוטה ונפוצה המספקת תמונות מנוגדות של סגירת רווח. בדיקת המעקב אחר תאים בודדים דורשת ניטור של תאים בודדים באמצעות דימות בהילוך מהיר, שעבורו ניתן לתייג את התאים בצבעים פלואורסצנטיים. הן בדיקת ריפוי הפצע והן בדיקת מעקב התאים הבודדת מודדות את התנועה הספונטנית של תאים.

בעזרת הדמיה בהילוך מהיר ועיבוד נתונים אינטנסיבי לאחר הדרישה, שתי הבדיקות יכולות לספק השוואות כמותיות בין מדגמים28. עם זאת, בדיקות אלה אינן מתאימות לחקר פלישת תאים דרך שכבת חלבון ECM. לעומת זאת, מבחני נדידת הטרנסוול והפלישה מודדים נדידת תאים מכוונת דרך קרום החדרת טרנסוול עם או בלי שכבת חלבון ECM. עם זאת, ניטור מתמשך אינו אפשרי עם בדיקות אלה מכיוון שיש לאסוף את התאים הנודדים בנקודת זמן נתונה, ולא ניתן להשתמש שוב בטרנסוול. כל הבדיקות הללו דורשות זמן ומאמץ משמעותיים לעיבוד נתונים או לניסויים מעשיים כדי לאסוף ולספור את התאים, וכתוצאה מכך נוצרות וריאציות פוטנציאליות הקשורות לאופרטור. האתגר הגדול ביותר של בדיקות אלה הוא ביצוע השוואות כמותיות מתוחכמות בין טיפולים מרובים ומשולבים בנקודות זמן שונות.

השימוש במערכת ניתוח תאים בזמן אמת המוצגת בעבודה זו מאפשר ניטור כמותי, רציף ומקיף למדידת נדידת תאים ופלישה, ולמערכת זו יתרונות רבים על פני מבחני תנועתיות תאים פשוטים אחרים, המספקים תוצאות בנקודות זמן מוגבלות וקבועות. כמו בבדיקות אחרות, תנאי הניסוי של ניתוחי תאים בזמן אמת צריכים להיות אופטימליים עבור כל קו תא, מכיוון שהנדידה והפלישה של קווי תאים שונים יכולים להיות מושפעים באופן דיפרנציאלי ממספר התא. יתר על כן, קצב הפלישה לתאים יורד ככל שהריכוז של ג'ל ECM עולה (איור 2B,C). לכן, מומלץ לבדוק ריכוזים שונים של ג'ל ECM ולהשוות את ההשפעות של שינויים בביטוי גנים על פלישת תאים תחת ריכוזי ג'ל ECM שונים אלה.

עם מערכת ניתוח תאים בזמן אמת, אופטימיזציה היא קלה ופשוטה, כמו מערכת הבדיקה מייצרת נתונים בזמן אמת ללא זמן מעשי. מערכת הבדיקה מזהה תוך כמה זמן התאים נודדים או פולשים ומתי הם מגיעים לרמת נדידת התאים או הפלישה המקסימלית. קבלת מידע זה על תנועתיות התא מאפשרת ניתוח השוואתי מפורט בין קבוצות טיפול שונות, אשר ניתן לעשות בפשטות על ידי שימוש בתכונות המובנות של התוכנית. יתר על כן, הרגישות של מערכת הבדיקה בזמן אמת מאפשרת זיהוי וכימות של שינויים עדינים בנדידת תאים ובפלישה על ידי ביטוי גנים תלויי ריכוז, כפי שמודגם באיור 1 ובאיור 2.

בעבר, נוהל מפורט סופק למדידת נדידת תאי הגידול ופלישת תאים לאחר הפלת גנים באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת מבוססת עכבה. מכיוון שפירוק גנים לוקח 3-4 ימים לאחר שהתאים עוברים אלקטרופורציה עם siRNAs, התאים צופו מחדש לאחר אלקטרופורציה. התאים המחושמלים גודלו בתרבית במשך 3 ימים לפני שנקצרו מחדש לצורך ניתוח תאים בזמן אמת, מה שהפך את הניסוי כולו לתהליך דו-שלבי: אלקטרופורציה ביום 1 וניתוח תאים בזמן אמת ביום 4, כפי שמוצג באיור 3. לעומת זאת, ביטוי גנים באלקטרופורציה של תאים עם mRNA סינתטי הוא מהיר ויעיל, שכן ניתוח בהילוך מהיר של פיברובלסטים שהתחשמלו עם mRNA סינתטי עבור GFP הראה אות GFP חזק 5 שעות לאחר ההדבקה; עוצמת הפלואורסצנטיות הגיעה למקסימום סביב 24 שעות, ולאחר מכן חלה ירידה הדרגתית באות הפלואורסצנטי18.

נוסף על כך, בעבודה זו, תאי U-118MG הראו ביטוי חזק של החלבון האקסוגני כאשר התחשמלו עם mRNA סינתטי עבור CrkI (איור 1A) ועבור CrkL (איור 2A), בהתאם לתצפיות קודמות8. לכן, ראוי לבצע את ניתוח התאים בזמן אמת מיד לאחר אלקטרופורציה. חלק מהשלבים לניתוח תאים בזמן אמת צריכים להתבצע לפני קצירת התאים להתחשמלות. הניסוי כולו הוא תהליך חד שלבי הכולל אלקטרופורציה וניתוח תאים בזמן אמת ביום הראשון. מערכת ניתוח תאים בזמן אמת מבוססת עכבה שימשה באופן נרחב לחקר נדידת תאי גידול ופלישה בתאי גידול מוצקים שונים, כולל סרטן השד29, סרטן המעי הגס 30, מלנומה 31, סרטן השחלות 32, סרטן קשקש ראש וצוואר 33, קרצינומה של תאי הכליה 34, קרצינומה של הלבלב 35, קרצינומה של הפטוצלולר 36, ותאי סרטן ריאה של תאים שאינם קטנים 10. לכן, השימוש המשולב בביטוי יתר של גנים באמצעות mRNA או הפלת גנים באמצעות siRNA הופך את המדידה בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה לשימושית וישימה יותר.

המגבלה של פרוטוקול זה היא ששיטה זו דורשת ניתוק וקצירת תאים ממש לפני מדידת נדידת התאים ופלישתה. הטיפולים האנזימטיים והמכניים במהלך דיסוציאציה, קציר והשעיה עשויים להשפיע על הניתוח37. בנוסף, יכול להיות עיכוב בנדידת התאים בזמן שהתאים מתאוששים מהטיפולים האנזימטיים והמכניים. שיטה זו עשויה שלא להתאים אם התאים ניזוקים בקלות על ידי טריפסיניזציה או טיפולים מכניים אחרים במהלך דיסוציאציה ואיסוף של תא בודד או דורשים זמן התאוששות ארוך לאחר מניפולציות אלה. מגבלה זו חלה גם על בדיקת נדידת טרנסוול, שהיא שיטה נוספת למדידת נדידת תאים מכוונת. בנוסף, האלקטרופורציה בעקבות הכנת התאים עלולה להפוך את התאים לפגיעים יותר לנזק38. לכן, חשוב לייעל את התנאים לאלקטרופורציה עבור כל קו תאים וגם לאלקטרופורציה של תאי הבקרה לצורך השוואות מדויקות יותר.

דף הבית של היצרן למערכת האלקטרופורציה מספק את הפרמטרים המומלצים לאלקטרופורציה (ראו הערת שוליים בטבלת החומרים). שימוש בתנאי ניסוי עקביים ומזיקים באופן מינימלי במהלך דיסוציאציה והשעיה של תאים הוא קריטי להשגת תוצאות הניתנות לשחזור. יתר על כן, הקורלציה בין כמות ה-mRNA, רמת החלבון ותנועתיות התא חיונית להבחנה בין ההשפעות הספציפיות והלא ספציפיות של טרנספקציית mRNA. בעבודה זו נצפה כי אם ריכוז ה-mRNA עלה על רמה מסוימת, הוא עיכב באופן לא ספציפי תפקודים תאיים, כולל נדידת תאים ופלישה (נתונים שאינם מוצגים). לכן, חשוב לטיטר את ריכוז ה-mRNA. בנוסף, קריטי לבצע את ניתוח התאים בזמן אמת כאשר ביטוי החלבון נמצא ברמתו בשיא, שכן ביטוי חלבון הוא חולף עם transfection mRNA. כמו במבחני תנועתיות תאים אחרים, התוצאות של ניתוח תאים בזמן אמת יכולות להיות מבולבלות על ידי התפשטות התאים במהלך הנדידה. לכן, מומלץ לבצע בנוסף בדיקת התפשטות תאים כדי להבין את ההשפעה של התפשטות תאים על נדידת התאים ותוצאות הפלישה.

רמות החלבון של Crk ו- CrkL ידועות כגבוהות בסוגים מסוימים של סרטן אנושי. מכיוון שהביטוי של Crk ו-CrkL נמצא בקורלציה עם תפקודים שונים של תאי הגידול וביטוי היתר שלהם תורם לפרוגנוזה גרועה, Crk ו-CrkL הוצעו כמטרות טיפוליות לטיפול בסרטן13. בעבר, הפלה גנטית נגרמה בתאי גליובלסטומה כדי להדגים כי נדידת תאי גליובלסטומה ופלישה הם סמנים חזקים לפעילות Crk ו- CrkL. המחקר הנוכחי מספק גישה שיטתית לביטוי גנים כדי לגרום לביטוי יתר של Crk ו- CrkL באמצעות mRNA סינתטי. נמצא קשר הדוק בין רמות החלבון של Crk ו- CrkL לבין נדידת תאי גליובלסטומה ופלישה באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת. התוצאות תומכות עוד יותר בהשערה כי Crk ו- CrkL ממלאים תפקידים חיוניים בנדידת תאי גליובלסטומה ופלישה. יחד עם מסמך השיטות הקודם11, מחקר זה מספק גישת הוכחת היתכנות לחקירת מתאם פוטנציאלי בין שינויים בביטוי גנים לבין נדידת תאי גידול ופלישה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים למרכז לכתיבה רפואית ב-Children's Mercy Kansas City על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי קרן A.R.T. של נטלי (ל- T.P.) ועל ידי מענק המועצה המייעצת של MCA Partners מבית החולים Children's Mercy Hospital (CMH) ומרכז הסרטן של אוניברסיטת קנזס (KUCC) (ל- T.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AlphaImager HP ProteinSimple 92-13823-00 Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody Sigma T9026 Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16 Agilent Technologies, Inc 5665825001 Cell invasion and migration plates
Crk antibody BD Biosciences 610035 Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody Santa Cruz sc-319 Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) ATCC 302002 Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Corning 21-031-CV Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30910.03 Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 51030285 CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody Li-Cor 926-32210 Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody Li-Cor 926-32211 Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride  Invitrogen AM9480 Used for RNA precipitation
Matrigel matrix Corning 354234 Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit Invitrogen AM1334 Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers Invitrogen AM7150 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge ISC BioExpress C1301P-ISC Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA TaKaRa 637301 Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant Tecan M200PRO Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system  ThermoFisher Scientific MPK5000 Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit ThermoFisher Scientific MPK1025 Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit ThermoFisher Scientific MPK10096 Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer Invitrogen AM8676 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye Invitrogen AM8552 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer Invitrogen AM8671 Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water Teknova W3331 Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager Li-Cor Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His Invitrogen V80020 The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a Millipore Sigma E7523 Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol  Sigma P2069 Used for DNA extraction
PmeI New England BioLabs R0560L Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit Invitrogen AM1350 Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) Corning 353003 Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) Corning 353001 Used for culturing transfected cells
Proteinase K Invitrogen 25530049 Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1 Labconco Corporation 304410001 Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R ThermoFisher Scientific A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap Invitrogen AM9780 RNA decontamination solution
Scepter Millipore C85360 Handheld automated cell counter 
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit Cellscript C-SCMT0625 Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system Cellscript C-SCCE0625 Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution Invitrogen 15553-035 Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge Thermo Scientific 75004532 Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Used for dissociation of cells
U-118MG  ATCC HTB15 An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody Sigma V9131 Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP Agilent Technologies, Inc 380601050 Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

Tags

חקר הסרטן גיליון 196 נדידת תאי גידול פלישה העברת MRNA סינתטי דפוסי ביטוי גנים חדירת תאי גידול גרורות הפלת גנים מדידה מבוססת עכבה חיסוני MRNA מטרות טיפוליות ביטוי יתר של גנים טרנספקציה סינתטית של MRNA גירוי נייר שיטה ביטוי גנים שונה
מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, T., Large, N. Real-Time… More

Park, T., Large, N. Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection. J. Vis. Exp. (196), e64274, doi:10.3791/64274 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter