Summary
许多上调的基因刺激肿瘤细胞迁移和侵袭，导致预后不良。确定哪些基因调节肿瘤细胞迁移和侵袭至关重要。该协议提出了一种实时研究基因表达增加对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响的方法。
Abstract
肿瘤细胞具有高度的运动性和侵袭性，并显示出基因表达模式的改变。了解基因表达的变化如何调节肿瘤细胞迁移和侵袭对于了解肿瘤细胞浸润到邻近健康组织和转移的机制至关重要。以前，已经证明基因敲低，然后基于阻抗的肿瘤细胞迁移和侵袭实时测量能够识别肿瘤细胞迁移和侵袭所需的基因。最近，针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗增加了人们对使用合成 mRNA 进行治疗的兴趣。本文对合成mRNA方法进行了修正，研究了基因过表达对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。这项研究表明，通过合成 mRNA 转染和基于阻抗的实时测量提高基因表达可能有助于识别刺激肿瘤细胞迁移和侵袭的基因。本方法论文提供了有关检查基因表达改变对肿瘤细胞迁移和侵袭影响的程序的重要细节。
Introduction
肿瘤细胞运动在转移中起着至关重要的作用 1,2。肿瘤细胞扩散到邻近和遥远的健康组织使癌症治疗变得困难，并导致复发3,4。因此，了解肿瘤细胞运动的机制并制定相关的治疗策略至关重要。由于许多肿瘤细胞改变了基因表达谱，因此了解基因表达谱的哪些变化导致肿瘤细胞运动性改变至关重要 5,6。
已经开发了几种测定法来测量 体外细胞迁移。由于只允许在特定时间点进行测量，一些检测仅提供有限的信息，而另一些则实时提供有关肿瘤细胞运动的全面信息7。尽管这些细胞运动测定中的许多可以在给定时间或终点提供定量结果，但它们无法提供有关实验期间细胞迁移速率动态变化的足够详细的信息。此外，根据实验设计、细胞类型和细胞数量，可能很难检查细胞迁移速率的潜在变化。此外，可以通过传统运动测定的简单定量来研究简单处理的效果，但可能需要更复杂的定量来研究各种联合处理的复杂效果8。
已经开发出一种用于监测覆盖有微电极的微量滴定板孔底电流的仪器9。细胞与孔表面的粘附阻碍了电子流动，阻抗与细胞的定量和定性结合相关。孔底存在微电极，可以测量细胞粘附、扩散和增殖。微电极存在于上腔室的微孔膜下方，允许测量细胞迁移和侵袭到下腔室，上腔室涂有细胞外基质 （ECM） 蛋白以允许侵袭10。
此前，已经证明，基于阻抗的肿瘤细胞迁移和侵袭的实时测量在整个实验过程中提供了实时数据，以及在各种实验条件下的即时比较和量化11。在该方法论文中，诱导基因敲低以测试目标蛋白在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用。由于在测试的实验条件下，使用小干扰 RNA （siRNA） 8 电穿孔后需要 3-4 天才能完全实现基因敲低效应，因此在电穿孔后重新接种细胞，并在 3 天后重新收获，以进行基于阻抗的肿瘤细胞迁移和侵袭实时测量。
激酶 （Crk） 和 Crk 样 （CrkL） 的 CT10 调节因子是介导各种生长因子受体激酶通路和非受体酪氨酸激酶通路下游的蛋白质-蛋白质相互作用的接头蛋白12。Crk 和 CrkL 蛋白水平升高会导致几种人类癌症（包括胶质母细胞瘤13）的预后不良。然而，目前尚不清楚 Crk 和 CrkL 蛋白升高如何导致预后不良。因此，确定 Crk 和 CrkL 过表达对肿瘤细胞功能的影响非常重要。此前，进行了一项基因敲低研究，以证明胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭需要内源水平的 Crk 和 CrkL 蛋白8。在这里，已经开发了一种改进的测定系统来解决 Crk 和 CrkL 过表达对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。
最近，由于针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗的开发，mRNA 的体外合成及其治疗应用再次受到关注（由 Verbeke 等人审查 14）。此外，在癌症和其他疾病中使用合成mRNA方面也取得了显着进展15,16。细胞电穿孔是递送合成 mRNA 和诱导瞬时基因修饰的有效方法（Campillo-Davo 等人 17 评论），使用合成 mRNA 可在永生化成纤维细胞中快速有效地表达基因18。本方法论文将使用合成mRNA的基因过表达与实时细胞分析相结合，以研究肿瘤细胞迁移和侵袭。然而，用于 siRNA 的实验方案不适用于合成 mRNA 转染，因为外源蛋白的水平在合成 mRNA 转染时迅速增加并逐渐降低18。因此，该方法已被修改为在转染后立即进行细胞迁移和侵袭的实时分析，而无需额外培养细胞。
本方法论文表明，将基于阻抗的实时测量与用合成mRNA转染肿瘤细胞相结合，可以快速、全面地分析基因上调对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。本方法论文描述了测量胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭如何受 Crk 和 CrkL 过表达影响的详细程序。通过研究合成mRNA对肿瘤细胞迁移的浓度依赖性影响，该论文清楚地描述了蛋白质水平的增加如何刺激肿瘤细胞迁移。此外，还提出了一种改变ECM凝胶浓度的方法，以评估基因表达变化对肿瘤细胞侵袭的影响。
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Protocol
1. mRNA的合成
注意：对于mRNA合成，所有试剂和设备必须在使用前经过特殊处理以灭活RNase。有关本协议中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。
- DNA的线性化
注：将 CrkI 和 CrkL 的小鼠 cDNA 克隆到 pFLAG-CMV-5a 表达载体中，以在 C 末端添加 FLAG 表位标签，并将亚克隆到 pcDNA3.1/myc-His 载体中以掺入 T7 启动子，如前所述18,19。- 向微量离心管中加入 10 μL 10x 反应缓冲液、1.5 μL PmeI （10,000 单位/mL） 和 10 μg 质粒 DNA，用限制性内切酶线性化质粒 DNA。加入无核酸酶的水，使反应体积达到100μL。
- 通过敲击混合，旋转，并将反应混合物在37°C孵育过夜。
- 旋转，向反应混合物中加入 5 μL 10% 十二烷基硫酸钠 （SDS） 和 1 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL，RNA 级）。通过敲击混合，旋转，并在50°C下孵育30分钟。
- 在通风橱下，向质粒反应混合物中加入100μL苯酚：氯仿：异戊醇的底相进行提取。涡旋，然后在室温下以18,800× g 离心5分钟。将上相移至新管中。
- 用氯仿：异戊醇在24：1重复步骤1.1.4。
- 在新管中，加入200μL无核酸酶水，使反应体积达到300μL，然后加入30μL的3M乙酸钠和600μL的100%乙醇。
- 涡旋混合，然后在-20°C下放置30-60分钟，使DNA的乙醇沉淀。
- 在4°C下以18,800× g 离心20分钟，弃去上清液，并用1mL 70%乙醇冲洗沉淀。重复离心10分钟，然后完全除去上清液。
- 打开盖子干燥 2 分钟，加入 30 μL 无核酸酶的水，并重悬 DNA 沉淀。
- 使用分光光度计测定DNA浓度。
- 使用琼脂糖凝胶电泳验证线性化DNA的大小和数量。
- 使用 T7 RNA 聚合酶进行 RNA 合成
- 向微量离心管中加入 2 μL 10x 转录缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP 和 T7 以及 1 μg 线性化 DNA。加入无核酸酶的水，使反应体积达到20μL。
- 通过敲击混合，旋转，并将反应混合物在37°C下孵育2小时用于RNA合成。
- 旋转下来，加入1μL的DNase（2U / μL），并在37°C下孵育15分钟以除去模板DNA。
- RNA的氯化锂沉淀
- 向反应混合物中加入 10 μL 氯化锂 （7.5 M）。通过敲击混合，旋转，并将反应混合物在-20°C下孵育30分钟。
- 在4°C下以18,800× g 离心20分钟，弃去上清液，并用500μL 70%乙醇冲洗沉淀。重复离心10分钟，然后完全除去上清液。
- 打开盖子干燥 2 分钟，加入 30 μL 无核酸酶的水，并重悬 RNA 沉淀。
- 上限
- 将RNA样品在65°C加热10分钟，然后将其置于冰上冷却。
- 加入 10x 加帽缓冲液、10 mM GTP 和 1 mM （10x） S-腺苷甲硫氨酸 （SAM） 各 5 μL，加帽酶混合物和 O-甲基转移酶混合物各 2 μL，以及 1.25 μL RNase 抑制剂。通过敲击混合，旋转，并将反应混合物在37°C下孵育1小时。
- Poly（A） 尾矿
- 旋转样品，然后加入 6 μL 无核酸酶水、20 μL 5x E-PAP 缓冲液、10 μL 25 mM MnCl2、10 μL 10 mM ATP 和 4 μL E-PAP poly（A） 拖尾酶。通过敲击混合，旋转，并将反应混合物在37°C下孵育2小时。
- 氯化锂沉淀和合成mRNA的定量
- 加入50μL氯化锂（7.5M），并按照步骤1.3.1-1.3.3所述进行氯化锂沉淀。
- 使用分光光度计测量mRNA的浓度。
- 使用甲醛（1%-2%）琼脂糖（1%）凝胶电泳验证mRNA的大小和数量。
2. 细胞侵袭和迁移 （CIM） 板的细胞外基质 （ECM） 凝胶涂层
注：细胞侵袭和迁移 （CIM） 板是商业制造的 16 孔板，用于基于阻抗的实时细胞分析。对于细胞侵袭测定，如前所述，用ECM凝胶涂覆CIM板，但进行了一些修改11。
- 从冰箱中取出等分试样的ECM凝胶原液，并将其放在冰上。
- 通过将 990 μL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）（不含血清或抗生素）与 10 μL ECM 凝胶在微量离心管中混合，将 ECM 凝胶 （10 mg/mL） 稀释至工作浓度 （100 μg/mL）。通过轻柔的移液进行混合。
- 将 60 μL 稀释的 ECM 凝胶加入 CIM 板上室的 16 个孔中的每一个。应用反向移液方法，同时避免气泡20,21。
注意：优化每个细胞系的ECM凝胶浓度。对于胶质母细胞瘤细胞系，使用 0.1 μg/μL 至 1 μg/μL ECM 凝胶进行优化。 - 将CIM板的上腔室与板盖脱开，放在CO2 培养箱内的保护性塑料片上约4小时以形成凝胶层。
注意：在用ECM凝胶涂覆CIM板期间，CIM板上室的电极不应与实验者的手或设备的表面直接接触，包括生物安全柜或CO2 培养箱。
3. 肿瘤细胞的制备
注意：所有细胞培养材料必须保持无菌。如前所述，在生物安全柜下收集和电穿孔肿瘤细胞，并配备适当的个人防护设备 （PPE），但进行了一些修改11.
- 肿瘤细胞培养
- 在37°C下，在5%CO2 培养箱（培养条件）中，在10mL DMEM中培养U-118MG细胞，每100mm x 20 mm聚苯乙烯组织培养皿中含有5%胎牛血清（FBS）和1%抗生素。
- 肿瘤细胞的血清耗竭
注：在细胞迁移和侵袭测定之前，必须通过使用高浓度的FBS将细胞暴露于FBS中存在的化学引诱剂。- 除去旧培养基，每培养皿加入 10 mL 预热的含有 0.5% FBS 和 1% 抗生素的 DMEM（低血清培养基）。
- 重复步骤 3.2.1。
- 将细胞在37°C下在5%CO2 培养箱中孵育4小时或更长时间。
- 收获肿瘤细胞
- 除去旧培养基，每培养皿加入 8 mL 预热的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），除去 DPBS，加入预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（2 mL/培养皿）以覆盖表面，并在 CO2 培养箱中孵育 30 秒。
- 小心吸出胰蛋白酶-EDTA，加入低血清培养基（7 mL /培养皿），然后将细胞收集到50 mL或15 mL离心管中。
- 分装少量细胞，并使用手持式自动细胞计数仪对细胞进行计数。
- 计算细胞总数和 10,000 个细胞/μL 所需的体积。
- 通过在室温下以100× g 离心细胞5分钟来旋转细胞，吸出上清液，加入含有0.5%FBS（不含抗生素）的计算体积的DMEM，并轻轻重悬细胞沉淀。
- 每次处理时，将 110 μL 含有 110 万个细胞的细胞悬液转移到微量离心管中。
- 重复步骤3.3.6，将细胞转移到四个微量离心管中，进行四种不同的处理。
注意：CIM 板共有 16 个孔。设计四种不同的处理进行比较，以便可以为每个处理分配四个CIM板孔。使用电穿孔细胞进行以下实验：蛋白质印迹分析（每 35 mm 组织培养皿 30 万个细胞）、四个孔的实时细胞迁移测定（10 万个细胞/孔）和四个孔的实时细胞侵袭测定（10 万个细胞/孔）用于每次处理。如果实验设计发生变化，调整需要电穿孔的电池数量。
4. 肿瘤细胞的电穿孔
- 要除去培养基，将 1 mL DPBS 添加到每个试管中的细胞悬液中，将细胞悬液旋转 3 次，每次 10 秒，同时使用微型离心机每 10 秒将试管旋转 180°，并使用微量移液管除去上清液。
注意：形成紧凑但易于重悬的细胞沉淀非常重要。 - 向细胞沉淀中加入 110 μL 重悬缓冲液 R，以 10 μL 形式获得 10 万个细胞。
- 将合成的 mRNA 添加到细胞沉淀中，以获得 0.2-20 ng/μL 的浓度，具体取决于所需的表达水平。通过轻敲或轻柔移液轻轻混合并重悬细胞沉淀。
注：使用不同浓度的合成mRNA，使用蛋白质印迹分析检查蛋白质表达，并确定导致所需表达水平的合成mRNA的浓度，以研究蛋白质表达与生物学效应之间的特定相关性。 - 用电穿孔系统在 1,350 V 下电穿孔 10 μL 细胞悬液 10 ms，每次三个脉冲。
- 将电穿孔细胞转移到含有 1.1 mL 含有 0.5% FBS 的 DMEM 的新微量离心管中。
- 重复电穿孔，直到细胞悬液的其余部分被电穿孔。将微量离心管中的电穿孔细胞合并，在 1.1 mL 中获得 110 万个细胞。
注：100 μL 和 10 μL 电穿孔吸头均可用于电穿孔大量细胞，但 10 μL 和 100 μL 的电穿孔吸头包含在两个单独的试剂盒中，需要单独购买。重悬缓冲液 R 包含在两种试剂盒中。 - 完成所有相应的电穿孔后，轻轻地重悬合并的细胞。
- 将 30 万个细胞接种在 35 mm x 10 mm 聚苯乙烯组织培养皿中，加入含有 5% FBS 的 2 mL DMEM，并在培养条件下培养细胞 1 天，用于总细胞裂解物制备和蛋白质印迹分析。
- 将其余的电穿孔细胞保持在室温下，直到实时细胞分析系统准备就绪。
5. 设置实时细胞分析仪、程序和 CIM 板
注：如前所述，准备实时细胞分析仪和两个CIM板11.
- 实时细胞分析仪的平衡
- 使用前数小时将实时细胞分析仪移至 CO2 培养箱中，以在培养条件下平衡系统。
- 设置分析程序
- 双击桌面上的 实时细胞分析软件图标，打开分析程序。
- 打开 “默认实验模式设置 ”选项后，选择用于分别运行三个实验的选项。
注意： 每个支架都有一个单独的窗口。有不同的选项卡可以设置测量间隔和持续时间、数据分析和其他实验条件。 - 通过单击 “数字 ”选项卡打开每个底座。
- 单击“实验 注释 ”选项卡，选择要保存数据的文件夹，然后输入实验的名称。
- 单击 “布局 ”选项卡，通过一次选择四个孔并输入样品信息，为每个处理条件设置四重孔，然后单击 “应用”。
- 单击 “计划 ”选项卡 | 添加一个步骤 以设置电池阻抗测量的两步模式。然后，单击 “应用 ”以设置第一步。
- 再次单击“ 添加步骤 ”，输入 10 分钟作为间隔，输入 48 小时作为迁移和入侵的持续时间，然后单击 “应用 ”以设置第二步。
注意： 第一步进行一次性基线测量（一次扫描，间隔 1 分钟）。第二步在摇篮上测量实验的细胞阻抗（例如，以10分钟的间隔进行289次扫描，持续48小时）。根据实验设计调整间隔和持续时间。 - 移动到下一个底座，然后重复步骤 5.2.3-5.2.7 进行设置。
- CIM板的制备
- 在细胞阻抗测量开始前一小时，用含有10%血清或其他化学引诱剂的160μLDMEM填充CIM板下腔室的孔。
- 将包含ECM凝胶涂层孔（用于侵入）或未涂层孔（用于迁移）的上腔室与下腔室组装在一起。
- 将 50 μL 低血清培养基加入 CIM 板上室的孔中用于细胞迁移测定，并将 CIM 板置于系统的支架中。
- 单击“消息”选项卡，并确保显示“连接正常”消息。CIM板现在已准备好进行实验。
- 在进行实时细胞分析之前，将组装好的CIM板在CO2 培养箱中预孵育30-60分钟，以使CIM板适应培养条件。
6. 实时细胞分析和数据导出
注意：如前所述，执行基线读数、细胞接种、细胞阻抗测量和数据导出11.
- 基线读数
注意：在CIM板适应后，在将细胞添加到上室的孔中之前，应读取基线。- 单击每个底座的 “开始 ”按钮。当 “另存为 ”窗口出现时，保存实验文件以执行基线读数。
- 细胞接种
- 从支架上取下 CIM 板，并将其放入板架上的生物安全柜中。
- 根据控制单元中的程序，将 100 μL（含有 100,000 个细胞）电穿孔细胞加入 CIM 板上室的孔中。应用反向移液方法，同时避免气泡。
- 在室温下将CIM板留在生物安全柜下30分钟，以确保细胞均匀地分布在孔底。
- 电池阻抗测量
- 将完全组装好的 CIM 板移回相应的底座。单击底座开始按钮 开始 第二步的电池阻抗测量。
- 单击“ 绘图 ”选项卡，然后单击“ 全部添加 ”按钮，然后选择“ 平均 ”和“ STD DEV ”框以实时可视化数据。
注意：x 轴的默认绘图选项是时间，y 轴的标格索引是。“绘图选择”部分允许用户为 y 轴选择替代选项：“归一化像元索引”或“增量像元索引”。完成最终扫描后，实验完成，结果自动保存。
- 导出数据进行分析
- 单击“绘图”选项卡，然后选择“平均”和“STD DEV”框，以分别复制每个孔的数据。
- 右键单击绘图区域，然后选择 “以列表格式复制数据”。
- 打开一个空的电子表格文件，粘贴数据，然后保存该文件。
- 返回分析程序，单击每个底座的 “板 ”选项卡，然后选择“ 释放 ”以关闭底座的实验。
- 返回电子表格文件，调整原始数据的时间，使第二步的开始时间成为测量的实际开始时间。
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Representative Results
Crk 和 CrkL 蛋白在许多细胞类型的运动中起着重要作用，包括神经元22、T 细胞23、成纤维细胞 18,19 和多种肿瘤细胞13。由于已报道 Crk 和 CrkL 蛋白在胶质母细胞瘤24,25,26 中升高，因此本研究研究了 CrkI（Crk 的剪接变体）过表达对胶质母细胞瘤细胞迁移的影响。用不同浓度的合成 CrkI mRNA 电穿孔 U-118MG 细胞，并分析蛋白质水平和细胞迁移。用不同浓度的合成 CrkI mRNA 电穿孔 U-118MG 胶质母细胞瘤细胞在转染后 1 天导致 FLAG 标记的 CrkI 蛋白的浓度依赖性增加（图 1A）。0.2 ng/μL 和 2 ng/μL mRNA 导致外源性 CrkI 蛋白检测不到或表达适中，而 20 ng/μL mRNA 的表达水平远高于内源性 CrkI 蛋白。
使用实时细胞分析系统进行的细胞迁移测定结果表明，使用0.2 ng/μL或2 ng/μL CrkI mRNA进行电穿孔对细胞迁移没有太大影响。然而，用 20 ng/μL CrkI mRNA 电穿孔导致细胞迁移的明显刺激，更多细胞在 2 小时至 13 小时之间迁移（图 1B）。CrkI蛋白水平与细胞迁移的比较表明，CrkI蛋白水平的增加刺激了胶质母细胞瘤细胞迁移。看来CrkI蛋白水平应该高于某个阈值，以引起细胞迁移的实质性刺激。如果以不同的方式测量细胞迁移以计数或观察特定时间点迁移的细胞，则可能需要付出更多的努力来识别细胞迁移中的这种变化。
为了研究CrkL过表达如何影响胶质母细胞瘤细胞通过不同浓度ECM蛋白的ECM凝胶层侵袭，用合成的CrkL mRNA电穿孔U-118MG细胞，并分析蛋白水平和细胞通过ECM凝胶层的侵袭。用合成的 CrkL mRNA 电穿孔 U-118MG 胶质母细胞瘤细胞在转染后 1 天导致 FLAG 标记的 CrkL 蛋白的强烈表达（图 2A）。随着ECM蛋白浓度的增加，对照细胞的侵袭减慢（图2B）。CrkL过表达的细胞也显示出细胞侵袭的ECM凝胶浓度依赖性降低（图2C）。在不同ECM凝胶浓度下，对照细胞和CrkL过表达细胞之间的比较表明，CrkL过表达通常刺激细胞通过ECM凝胶层侵袭（图2D-G）。然而，根据ECM凝胶浓度的不同，两种细胞群之间的差异在不同的时间点变得明显。
对于 0.1 μg/μL ECM 凝胶，CrkL 过表达介导的细胞侵袭刺激在 8 小时和 20 小时之间很明显（图 2D），但 32 小时后细胞侵袭的差异可以忽略不计。对于0.2μg/μL ECM凝胶，有和没有CrkL过表达的细胞侵袭差异始终最小（图2E）。对于0.5μg/μL ECM凝胶，细胞侵袭的差异在24小时和36小时之间很明显（图2F）。对于1μg/ μL ECM凝胶，CrkL对细胞侵袭的过表达作用在48小时时变得略微明显（图2G）。结果表明，随着ECM凝胶浓度的增加，检测对照细胞和CrkL过表达细胞之间差异的窗口会转移到以后的时间。研究结果还表明，在不同时间点，ECM凝胶浓度的增加对两种细胞群的影响不同。例如，在12小时时，CrkL过表达细胞仅在0.1μg/ μL ECM凝胶下显示出显着更高的侵袭（图2H）。然而，在24小时时，CrkL过表达的细胞在测试的ECM凝胶浓度下显示出略高或相似的侵袭（图2I）。因此，重要的是要研究细胞侵袭中的时间依赖性和ECM凝胶浓度依赖性差异，以全面了解具有和不具有CrkL过表达的两种细胞群之间的差异。这些结果表明，将使用合成mRNA的瞬时过表达与基于阻抗的实时细胞分析相结合，为分析基因过表达与肿瘤细胞迁移和侵袭之间的潜在相关性提供了强大的工具。检查合成 mRNA 和 ECM 凝胶中浓度变化的影响将提供更准确和详细的信息。
图 1：CrkI 过表达对胶质母细胞瘤细胞迁移的影响。 U-118MG 细胞用指示浓度 （ng/μL） 的 FLAG 标记的 CrkI mRNA 进行电穿孔。（A） 对于蛋白质印迹分析，在制备总细胞裂解物之前将电穿孔细胞培养 1 天。比较转染合成 CrkI mRNA 后的蛋白水平。使用抗 Crk 和抗 CrkL 抗体检测内源性和 FLAG 标记蛋白，并比较内源性蛋白和 FLAG 标记蛋白的比例。Vinculin和α-微管蛋白用作上样对照。（B） 对于细胞迁移分析，将电穿孔细胞接种到 CIM 板上，无需进一步培养。每个样品从四个孔中获得细胞指数值，并显示其平均值±SD值。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：CrkL过表达对胶质母细胞瘤细胞侵袭的影响。U-118MG 细胞用无核酸酶的 H2O 或 20 ng/μL 带 FLAG 标签的 CrkL mRNA 电穿孔。（A） 对于蛋白质印迹分析，在制备总细胞裂解物之前将电穿孔细胞培养 1 天。比较转染合成 CrkL mRNA 后的蛋白水平。使用抗 Crk 和抗 CrkL 抗体检测内源性和 FLAG 标记蛋白，并比较内源性蛋白和 FLAG 标记蛋白的比例。Vinculin和α-微管蛋白用作上样对照。（B-G）对于细胞侵袭分析，将电穿孔细胞接种到带有ECM凝胶涂层的CIM板上，无需进一步培养。每个样品从四个孔中获得细胞指数值，并显示其平均值±SD值。（B）比较不同ECM凝胶浓度的对照细胞的细胞侵袭数据。（C）比较不同ECM凝胶浓度的CrkL过表达细胞的细胞侵袭数据。（D-G）比较对照细胞和CrkL过表达细胞之间的细胞侵袭数据，以达到指示的ECM凝胶浓度。（H） 对照细胞和 CrkL 过表达细胞之间 12 小时细胞侵袭的比较。（I） 对照细胞和 CrkL 过表达细胞之间 24 小时细胞侵袭的比较。缩写：ECM=细胞外基质;CIM = 细胞侵袭和迁移。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：基因敲低或基因过表达后的实验程序示意图 。 （A） siRNA转染后实时细胞分析的实验程序。由于在实验条件下，siRNA转染后需要3-4天才能诱导完全基因敲低，因此在电穿孔后将细胞重新铺板并培养3天，然后才能进行实时细胞分析。（B） 合成mRNA转染后实时细胞分析的实验程序。由于合成mRNA转染的蛋白表达速度很快，因此在同一天使用电穿孔细胞进行实时细胞分析。注意两种实验程序之间的差异;使用 siRNA 进行基因敲低的电穿孔后 3 天进行实时细胞分析，而使用合成 mRNA 进行基因过表达的电穿孔后立即进行实时细胞分析。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
迁移和侵袭是肿瘤细胞的重要特征。测量肿瘤细胞的运动性并了解控制肿瘤细胞运动的潜在机制为治疗干预提供了重要的见解2,27。已经开发了几种方法来研究细胞迁移7.使用划痕或培养插入物的伤口愈合测定是一种简单且常用的方法，可提供间隙闭合的对比图像。单个细胞追踪测定需要通过延时成像监测单个细胞，为此可以用荧光染料标记细胞。伤口愈合测定和单个细胞追踪测定都测量细胞的自发运动。
借助延时成像和密集的申请后数据处理，这两种测定都可以提供样品之间的定量比较28。然而，这些测定不适用于研究细胞通过ECM蛋白层的侵袭。相比之下，transwell 迁移和侵袭测定通过具有或不具有 ECM 蛋白层的 transwell 插入膜测量定向细胞迁移。然而，这些测定的持续监测是不可行的，因为迁移的细胞需要在给定的时间点收集，并且transwell不能再次使用。所有这些检测都需要大量的时间和精力进行数据处理或动手实验来收集和计数细胞，从而导致潜在的与操作者相关的变化。这些检测的最大挑战是在不同时间点对多种联合治疗进行复杂的定量比较。
使用本研究中提出的实时细胞分析系统可以进行定量、连续和全面的监测，以测量细胞迁移和侵袭，并且该系统与其他简单的细胞运动测定相比具有许多优势，后者在有限的固定时间点提供结果。与其他检测一样，实时细胞分析的实验条件需要针对每个细胞系进行优化，因为不同细胞系的迁移和侵袭会受到细胞数量的差异影响。此外，细胞侵袭速率随着ECM凝胶浓度的增加而降低（图2B，C）。因此，建议测试不同的ECM凝胶浓度，并比较这些不同ECM凝胶浓度下基因表达变化对细胞侵袭的影响。
使用实时细胞分析系统，优化变得简单明了，因为检测系统可以实时生成数据，无需手动操作。检测系统可识别细胞迁移或侵袭的速度以及它们何时达到最大细胞迁移或侵袭水平。获得有关细胞运动的信息可以对不同治疗组进行详细的比较分析，这可以通过使用程序的内置功能来完成。此外，实时检测系统的灵敏度允许通过浓度依赖性基因表达来识别和定量细胞迁移和侵袭的细微变化，如图 1 和 图 2 所示。
以前，提供了一个详细的程序，使用基于阻抗的实时细胞分析系统测量基因敲低后的肿瘤细胞迁移和侵袭。由于用 siRNA 电穿孔细胞后需要 3-4 天才能完成基因敲除，因此在电穿孔后重新接种细胞。电穿孔细胞培养 3 天，然后重新收获进行实时细胞分析，使整个实验分为两步：第 1 天进行电穿孔，第 4 天进行实时细胞分析，如图 3 所示。相比之下，用合成 mRNA 电穿孔细胞后的基因表达快速且高效，因为用合成 mRNA 电穿孔的成纤维细胞进行 GFP 的延时分析显示转染后 5 小时有强烈的 GFP 信号;荧光强度在24 h左右达到最大值，之后荧光信号18逐渐下降。
此外，在这项工作中，当用合成mRNA电穿孔CrkI（图1A）和CrkL（图2A）时，U-118MG细胞显示出外源蛋白的强烈表达，这与先前的观察结果一致8。因此，在电穿孔后立即进行实时细胞分析是合适的。在收获细胞进行电穿孔之前，应执行实时细胞分析的一些步骤。整个实验是一个一步过程，包括第1天的电穿孔和实时细胞分析。基于阻抗的实时细胞分析系统已广泛用于研究各种实体瘤细胞中的肿瘤细胞迁移和侵袭，包括乳腺癌29、结直肠癌 30、黑色素瘤 31、卵巢癌 32、头颈部鳞癌 33、肾细胞癌 34、胰腺癌 35、肝细胞癌 36 和非小细胞肺癌细胞10.因此，结合使用 mRNA 进行基因过表达或使用 siRNA 进行基因敲低，使得细胞迁移和侵袭的实时测量更加有用和适用。
该协议的局限性在于，该方法需要在测量细胞迁移和侵袭之前解离和收获细胞。解离、收获和重悬过程中的酶和机械处理可能会影响分析37。此外，当细胞从酶和机械处理中恢复时，细胞迁移可能会延迟。如果细胞在单细胞解离和收集过程中容易被胰蛋白酶消化或其他机械处理损坏，或者在这些操作后需要较长的恢复时间，则该方法可能不合适。这一限制也适用于transwell迁移测定，这是测量定向细胞迁移的另一种方法。此外，细胞制备后的电穿孔可能使细胞更容易受到损伤38。因此，优化每个细胞系的电穿孔条件以及电穿孔对照细胞以进行更准确的比较非常重要。
电穿孔系统的制造商主页提供了电穿孔的推荐参数（参见 材料表中的脚注）。在细胞解离和重悬过程中使用一致且损害最小的实验条件对于获得可重复的结果至关重要。此外，将 mRNA 的量、蛋白水平和细胞运动性联系起来对于区分 mRNA 转染的特异性和非特异性效应至关重要。在这项工作中，观察到如果mRNA浓度超过一定水平，它会非特异性地抑制细胞功能，包括细胞迁移和侵袭（数据未显示）。因此，滴定mRNA的浓度很重要。此外，当蛋白质表达达到峰值水平时，进行实时细胞分析至关重要，因为蛋白质表达在 mRNA 转染时是瞬时的。与其他细胞运动测定一样，这种实时细胞分析的结果可能会受到迁移过程中细胞增殖的影响。因此，建议另外进行细胞增殖试验，以了解细胞增殖对细胞迁移和侵袭结果的影响。
已知 Crk 和 CrkL 的蛋白质水平在某些类型的人类癌症中升高。由于 Crk 和 CrkL 的表达与各种肿瘤细胞功能相关，并且它们的过表达会导致预后不良，因此 Crk 和 CrkL 已被提议作为癌症治疗的治疗靶点13。以前，在胶质母细胞瘤细胞中诱导基因敲低，以证明胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭是 Crk 和 CrkL 活性的可靠标志物。目前的研究提供了一种系统的基因表达方法，使用合成的mRNA诱导Crk和CrkL的过表达。利用实时细胞分析系统，Crk和CrkL的蛋白水平与胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭之间存在密切相关性。研究结果进一步支持了Crk和CrkL在胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭中起重要作用的假设。与之前的方法论文11一起，本研究提供了一种概念验证方法，用于研究基因表达变化与肿瘤细胞迁移和侵袭之间的潜在相关性。
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Disclosures
作者没有要披露的利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢堪萨斯城儿童慈善中心的医学写作中心编辑了这份手稿。这项工作得到了娜塔莉的 A.R.T. 基金会（对 TP）的支持，并得到了儿童慈善医院 （CMH） 和堪萨斯大学癌症中心 （KUCC） 的 MCA 合作伙伴咨询委员会资助（对 TP）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
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