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Methodenartikel

Herstellung einer Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung aus einem erwachsenen Mausherzen nach Myokardinfarkt

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DOI:

10.3791/64290

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3. Februar 2023

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1Key Laboratory of Cardiovascular Intervention and Regenerative Medicine of Zhejiang Province, 2Department of Cardiology, Sir Run Run Shaw Hospital, School of Medicine, Zhejiang University Hangzhou

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung einer ausreichenden Anzahl einzelner nicht-kardiomyozyten mit hoher Viabilität aus einem Mausherzen nach einem Myokardinfarkt (MI). Dies kann für die anschließende Einzelzellsequenzierung, Durchflusszytometrie-Analyse und primäre Zellkultur verwendet werden.

Zusammenfassung

Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit weltweit steigender Sterblichkeit. Nicht-Kardiomyozyten machen mehr als die Hälfte der gesamten Herzzellpopulation aus und tragen zur adaptiven Kompensation von Myokardverletzungen bei, einschließlich Entzündungsreaktionen, Gewebereparatur und Narbenbildung. Um die kardiale Mikroumgebung nach einem MI zu untersuchen, wird die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) häufig verwendet, um verschiedene Herzzelltypen und interzelluläre Kommunikation zu identifizieren. Unter den Verfahren der scRNA-seq-Probenvorbereitung ist die Herstellung der Zellsuspension einer der kritischsten Schritte, da die Zellviabilität die Qualität der scRNA-seq-Ergebnisse beeinflussen kann. Daher haben wir ein experimentelles Protokoll zur Herstellung einer nicht-kardiomyozytenartigen Zellsuspension aus Mäuseherzen nach einem Myokardinfarkt entwickelt, wobei der Schwerpunkt auf der Verbesserung der Zelllebensfähigkeit durch die Auswahl milder Verdauungsenzyme, die Kontrolle der Verdauungszeit und die Anwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) liegt. Schließlich isolierten wir CD45+ -Zellen aus der durch dieses Protokoll erhaltenen Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension und führten dann scRNA-seq durch.

Einleitung

Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen, deren Sterblichkeit weltweit zunimmt1. Der Myokardinfarkt wird durch eine unzureichende Durchblutung des umgebenden Myokards verursacht, was auf einen Verschluss der Koronararterien zurückzuführen sein kann, der bei einer atherosklerotischen Plaqueruptur auftritt. Obwohl die perkutane Koronarintervention (PCI) die Sterblichkeitsraten von Patienten mit akutem Myokardinfarkt gesenkt hat, bleibt die hohe Prävalenz der Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt ein Problem2. Die wichtigste Pathophysiologie, die der Herzinsuffizienz nach einem Herzinfarkt zugrunde liegt, ist die kompensatorische Reaktion des Körpers auf Herzverletzungen, bei der der abgestorbene Herzmuskel durch nicht-kontraktile fibrotische Narben ersetzt wird. Diese adaptiven Reaktionen beruhen maßgeblich auf lokalen Entzündungen, die durch die Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen und Herzgewebezellen vermittelt werden, und diese Entzündung wird nun als potenzielles therapeutisches Ziel angesehen, um die fibrotische Narbenbildung zu reduzieren und somit vor einer Herzinsuffizienz nach einem Myokardinfarkt zu schützen 3,4. Interessanterweise erfährt die Mikroumgebung an der Infarktstelle einen zeitabhängigen Übergang der infiltrierenden Zelltypen und -funktionen in verschiedenen Stadien von MI 1,5. Viele Studien haben gezeigt, dass Nicht-Kardiomyozyten (z. B. Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen) eine zentrale Rolle bei der Entzündung nach einem Myokardinfarkt und der Gewebereparatur spielen 5,6. In den letzten Jahren wurde die Einzelzellsequenzierung in großem Umfang als leistungsfähiges Werkzeug zur Aufklärung der Beteiligung und Funktion von Nicht-Kardiomyozyten in der Mikroumgebung nach einem Myokardinfarkteingesetzt 7,8. Dies gibt Einblicke in die Pathophysiologie der Post-MI-Verletzung und -Reparatur sowie in die Entwicklung potenzieller Therapien gegen die Post-MI-Herzinsuffizienz.

Die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine Technik, mit der ganze Transkriptome mithilfe von Next-Generation-Sequencing (NGS) sehr detailliert untersucht werden können7,8,9. In jüngster Zeit hat die Entwicklung von scRNA-Seq das biomedizinische Forschungsfeld revolutioniert. Im Vergleich zur konventionellen Massensequenzierung analysiert scRNA-Seq Genexpressionsprofile und transkriptionelle Heterogenität auf Einzelzellebene 7,8. Diese Technik fördert maßgeblich die Erforschung der zellulären Pathophysiologie von MI 9,10, indem sie verschiedene zirkulierende Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung identifiziert und die Interaktion zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Kardiomyozyten aufdeckt. Diese Ergebnisse tragen außerdem dazu bei, neue therapeutische Angriffspunkte für die Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt zu finden. Im Allgemeinen umfasst das scRNA-seq-basierte Post-MI-Experiment drei Hauptabschnitte: (1) die Etablierung eines Post-MI-Tiermodells; (2) die Herstellung der Zellsuspension; und (3) Probensequenzierung und Datenanalyse. Auffällig ist, dass die Herstellung der Zellsuspension der kritischste Schritt bei der Vorbereitung des scRNA-Seq-Experiments ist, da die Qualität der Zellsuspension die Genauigkeit der Ergebnisse bestimmt.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension aus dem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt zu extrahieren. Bezeichnenderweise sind die spezifischen Details zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Auflösung der Zellen enthalten. Inzwischen sind die in diesem Protokoll verwendeten Geräte, wie z. B. chirurgische Kits für Mäuse, Beatmungsgeräte für Nagetiere und Zentrifugen, in den meisten Tierversuchszentren und biomedizinischen Labors zu finden, und daher sind die Versuchskosten für dieses Protokoll relativ gering. Darüber hinaus kann dieses Protokoll unter Berücksichtigung von Zeitpunkten und Infarktorten als Variablen angewendet werden, um eine Vielzahl von klinischen Szenarien zu simulieren, insbesondere für die Komplikationen nach dem Myokardinfarkt.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren an der Zhejiang University durchgeführt und vom Animal Advisory Committee der Zhejiang University genehmigt.

1. Ligatur der Koronararterien links anterior absteigend (LAD-Ligatur)

HINWEIS: Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden als Modelle verwendet. Die Herzentnahme erfolgte 2 Wochen nach dem Myokardinfarkt. Die linksanteriore absteigende Koronararterien-Ligaturoperation wurde wie zuvor beschrieben und nachgewiesen durchgeführt11.

  1. Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente vor der Operation mit 70%igem Ethanol.
  2. Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie dann mit intraperitonealen Injektionen von 1 % Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg). Beobachten Sie den Zehen-Kneif-Reflex und messen Sie die Atemfrequenz, um die Tiefe der Anästhesie während des Eingriffs zu beurteilen.
  3. Legen Sie die Maus mit einem 37 °C warmen Heizkissen auf den OP-Tisch. Verwenden Sie Augensalbe, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
  4. Enthaaren Sie die linke Brust und den Hals mit Enthaarungscreme und verwenden Sie Wattestäbchen, um Haare zu entfernen. Desinfizieren Sie die Haut mit Jodophor, gefolgt von 70% Alkohol, um den Bereich dreimal zu reinigen.
  5. Führen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Halswirbelsäule (0,8-1,0 cm) unter dem Mikroskop durch. Trennen Sie die Haut, den Muskel und das Gewebe, das die Luftröhre umgibt, und führen Sie dann eine 20-G-Kanüle in die Luftröhre ein.
    Anmerkungen: Beobachten Sie beim Einführen der Kanüle in die Luftröhre unter dem Mikroskop, dass der Schlauch nicht in die Speiseröhre eingeführt wird.
  6. Schließen Sie die Maus an ein Nagetierbeatmungsgerät an, das auf ein Tidalvolumen von 0,2 ml mit 150 Hüben pro Minute eingestellt ist.
  7. Schneiden Sie die Brust der Maus mit einer sterilen Schere schräg entlang der Mittelschlüsselbeinlinie ein. Präparieren Sie das Unterhautgewebe, um die Rippen freizulegen.
  8. Verwenden Sie eine sterile Schere, um die Haut schräg entlang der linken mittleren Schlüsselbeinlinie (0,8-1,0 cm) zu schneiden. Führen Sie eine linke Thorakotomie durch, um die dritte und vierte Rippe zu trennen und das Herz freizulegen. Verwenden Sie einen Rippenaufroller für eine klare Sicht.
  9. Öffnen Sie das Perikard mit einer gekrümmten Pinzette und ligieren Sie dann die linke vordere absteigende Arterie (unterhalb des linken Vorhofanhangs) mit einer 7-0-Seidennaht. Eine blasse Vorderwand des linken Ventrikels deutet darauf hin, dass die myokardiale Perfusion erfolgreich unterbrochen wurde.
  10. Lösen Sie den Rippenretraktor und nähen Sie den Thoraxschnitt in Schichten mit einer 5-0-Seidennaht, während Sie Luft aus dem Brustkorb ausstoßen. Nähen Sie den Halsschnitt mit einer 5-0-Nahtseidennaht.
  11. Entfernen Sie den Trachealtubus von der Maus, sobald ihre Spontanatmung wiederhergestellt ist. Intraperitoneal 0,5 ml vorgewärmte sterile Kochsalzlösung injizieren. Injizieren Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 12 Stunden subkutan, um die Schmerzen zu minimieren.
  12. Legen Sie abschließend die Maus auf das Heizkissen, um auf die Wiederbelebung zu warten. Überwachen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie nicht an übermäßiger Dyspnoe oder Blutungen leidet, indem Sie sie visuell beobachten.
  13. Bringen Sie die Maus nach dem Aufwachen in ihren Käfig zurück. Überwachen Sie die Maus in der ersten Woche täglich, um sicherzustellen, dass ihre Mobilität, Fellpflege und Essgewohnheiten angemessen sind. Ernten Sie das Herz je nach Bedarf des Experiments zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Myokardinfarkt.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die einzellige Suspension 2 Wochen nach dem Myokardinfarkt mit dem Herzen hergestellt.

2. Herstellung der kardialen Einzelzellsuspension

  1. Aufbereitung der Lösungen und Medien
    1. Dissoziationspuffer für kardiales Gewebe: Mischen Sie 10 mg Kollagenase i.v. (600 U/ml), 5 mg Dispase II (0,5 U/ml) und 50 μl DNase I (100 μg/ml) in 5 ml RPMI 1640. Dieses Medium vor Gebrauch im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.
    2. Zellwaschpuffer: 1 % BSA oder 10 % FBS in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, PH 7,4) herstellen und bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren.
    3. Perfusionslösung: PBS (PH 7,4) als Perfusionslösung vorkühlen.
    4. Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC): Verwenden Sie den Lysepuffer für Erythrozyten, wie vom Hersteller angegeben.
      HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte.
  2. Euthanasieren Sie die Maus durch eine intraperitoneale Pentobarbital-Natrium-Injektion (150 mg/kg).
  3. Dissektion des Herzens
    1. Bringen Sie die Maus in Rückenlage, indem Sie ihre Hinterbeine mit Klebeband fixieren.
    2. Besprühen Sie den Körper mit 70%igem Ethanol und schneiden Sie dann senkrecht durch die Bauchhaut und die Muskeln, ohne die Leber zu durchstechen. Öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb und vermeiden Sie dabei eine Punktion des Herzens.
    3. Verwenden Sie das vorgekühlte PBS (PH 7,4), um den linken Ventrikel zu durchbluten, bis die farblose Perfusionsflüssigkeit beobachtet wird (ca. 15 ml PBS [pH 7,4] werden benötigt).
    4. Heben Sie das Herz vorsichtig mit einer Pinzette vom Brustkorb ab und schneiden Sie das überschüssige Gewebe, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist, mit einer Augenschere ab. Legen Sie das Herz in 1 ml vorgekühltes PBS (PH 7,4) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  4. Enzymatische Dissoziation des Herzgewebes
    1. Übertragen Sie das Mausherz in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 150 μL des auf Eis gelegten Dissoziationspuffers des Herzgewebes und schneiden Sie es mit einer Schere in kleine Stücke (~1 mm).
    2. Das zerkleinerte Herzgewebe wird mit 5 ml des Gewebedissoziationspuffers in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt.
      HINWEIS: Das empfohlene Puffervolumen für die Dissoziation von Herzgewebe beträgt 5 ml/Herz.
    3. Legen Sie das Zentrifugenröhrchen für 1 h bei 37 °C in den elektrisch thermostatischen Kolbenschüttler mit 125 U/min. Pipettieren Sie die Gewebesuspension alle 20 Minuten 10 Mal auf und ab.
    4. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-μm-Zellsieb, um unverdautes Gewebe und Klumpen zu entfernen. Fügen Sie 25 ml des Zellwaschpuffers hinzu, um das Originalröhrchen zu spülen, und übertragen Sie es dann, um das Zellsieb zu spülen. Als nächstes wird die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb gefiltert, um Zellklumpen weiter zu entfernen.
    5. Die filtrierte Zellsuspension wird bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann die Zellprobe in 1x RBC-Lysepuffer für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
    6. Fügen Sie viermal mehr Volumen des Zellwaschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
    7. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml des Zellwaschpuffers. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    8. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml des Zellwaschpuffers.
    9. Mischen Sie 18 μl der Zellsuspension mit 2 μl Acridinorange (AO)/Propidiumiodid (PI)-Färbelösung (9:1) und geben Sie 10 μl der Mischung in einen Objektträger der Zählkammer. Bewerten Sie die Zellzahlen und die Viabilität mit einem automatischen Zellzähler.

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Ergebnisse

Eine einzellige Suspension mit hoher Vitalität wurde durch die Umsetzung von Abschnitt 2 dieses Protokolls erhalten. Es konnten jedoch noch Zellfragmente beobachtet werden (Abbildung 1A); Daher wurde eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durchgeführt, um die Qualität weiter zu verbessern16. Nach FACS verringert sich die durchschnittliche Zellgröße von 9,6 μm auf 9,1 μm (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass der Anteil der Zellfragmente in ...

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Diskussion

Ziel dieses Artikels war es, ein Protokoll zur Isolierung einzelner Nicht-Kardiomyozyten aus Mäuseherzen nach Myokardinfarkt zu beschreiben. Das Protokoll kann angewendet werden, um verschiedene Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung mit hoher Qualität zu isolieren, darunter Immunzellen, Endothelzellen und Fibroblasten. Drei wesentliche Faktoren sind entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Zellsuspension für die Einzelzellsequenzierung zu erhalten. Die erste ist die Einstellung der enzymatischen Verdauung. Es ist wi...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Natural Science Funds der Provinz Zhejiang unterstützt (LQ22H020010).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acridinorange / Propidiumiodid FleckLogos biosystemsF23001
Automatisiert  Zelle  ZählerLogos biosystemsL20001
Rinderserum AlbuminServicebioG5001Zytoprotektive Wirkung
Zellzählung ObjektträgerLogos biosystemsL12001
Kollagenase Typ IVGibco17104019Verdauungsenzyme
Dispase IISigmaD4693Verdauungsenzyme
Dnase IRoche11284932001Verhindern Sie das Verklumpen
der Zellen Falcon  40 Mio. Jahre m ZellsiebFalcon352340Zellklumpen entfernen
Falcon  70 Mio. Jahre m Cell StrainerFalcon352350Entfernen Sie unverdautes Gewebe und Klumpen
Flow Cell SorterBeckman CoulterB25982
IodophorOU QING SI
NadelhalterFST12061-01
Ophthalmic PinzetteRWDF14012-10
Ophthalmic ScernsRWDS11036-08
Phosphatgepufferte KochsalzlösungServicebioG4202-500ML
RBC LysepufferBeyotimeC3702-120mlRote Blutkörperchen entfernen
RippenretraktorFST17005-04
NagetierbeatmungsgerätHarvard730043
RPMI 1640 MediumGibco11875093Lösungsmittel  Lösung des Enzyms
Sterile SchereRWDS14014-10
10054963976859

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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