Summary
Le protocole présente des méthodes détaillées pour évaluer si l’adjuvant de nanoémulsion ophiopogonine D favorise des réponses immunitaires cellulaires efficaces.
Abstract
En tant qu’ingrédient principal des vaccins, les adjuvants peuvent directement induire ou améliorer les réponses immunitaires puissantes, généralisées, innées et adaptatives associées aux antigènes. L’ophiopogonine D (OP-D), un composant purifié extrait de la plante Ophiopogon japonicus, s’est avérée utile comme adjuvant vaccinal. Les problèmes de faible solubilité et de toxicité de l’OP-D peuvent être efficacement surmontés en utilisant une méthode d’émulsification à faible énergie pour préparer la nanoémulsion d’ophiopogonine D (NOD). Dans cet article, une série de protocoles in vitro pour l’évaluation de l’activité cellulaire sont examinés. Les effets cytotoxiques de L929 ont été déterminés à l’aide d’un test de comptage cellulaire kit-8. Ensuite, les niveaux de cytokines sécrétées et le nombre de cellules immunitaires correspondantes après la stimulation et la culture de splénocytes de souris immunisées ont été détectés par les méthodes ELISA et ELISpot. De plus, la capacité d’absorption de l’antigène dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BMDC), qui ont été isolées chez des souris C57BL/6 et mûries après incubation avec GM-CSF plus IL-4, a été observée par microscopie confocale à balayage laser (CLSM). Il est important de noter que l’activation des macrophages a été confirmée en mesurant les niveaux de cytokines IL-1β, IL-6 et du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) par des kits ELISA après coculture de macrophages péritonéaux (PM) de souris blanches avec l’adjuvant pendant 24 heures. On espère que ce protocole fournira à d’autres chercheurs des approches expérimentales directes et efficaces pour évaluer l’efficacité de la réponse cellulaire de nouveaux adjuvants vaccinaux.
Introduction
Les vaccins sont un moyen important de prévenir et de traiter les maladies infectieuses et non transmissibles. L’ajout approprié d’adjuvants et de véhicules d’administration aux formulations vaccinales est bénéfique pour renforcer l’immunogénicité des antigènes et générer des réponses immunitaires durables1. En plus de l’adjuvant classique alun (sel d’aluminium), il existe six types d’adjuvants pour les vaccins qui sont actuellement commercialisés: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG1018 4 et Matrix-M5. Généralement, lorsque le corps humain rencontre une attaque virale, les première et deuxième lignes de défense (peau, muqueuse et macrophages) prennent la tête de l’élimination du virus, et enfin, la troisième ligne de défense, impliquant les organes immunitaires et les cellules immunitaires, est activée. L’aluminium et les sels d’aluminium sont les adjuvants les plus utilisés pour les vaccins humains depuis le début des années 1920, provoquant une réponse immunitaire innée efficace6. Cependant, il a été proposé que l’activation des cellules présentatrices d’antigènes (APC) par les adjuvants classiques, qui stimule les cellules immunitaires à générer des ensembles spécifiques de cytokines et de chimiokines, est le mécanisme par lequel les adjuvants agissent et peut être l’une des raisons pour lesquelles les adjuvants n’exercent que des effets transitoires sur des réponses immunitaires spécifiques7. La présence d’adjuvants homologués limités à usage humain est un facteur restrictif pour la mise au point de vaccins qui provoquent des réponses immunitaires efficaces8.
Actuellement, un nombre croissant d’études adjuvantes démontrent la capacité d’induire une forte réponse immunitaire cellulaire chez la souris. Il a été démontré que le QS-21 induit une réponse immunitaire équilibrée T-helper 1 (Th1) et T-helper 2 (Th2), produit des niveaux plus élevés de titres d’anticorps et prolonge la protection en tant qu’adjuvant, mais sa forte toxicité et ses propriétés hémolytiques limitent son développement en tant qu’adjuvant clinique autonome 9,10. OP-D (ruscogénine-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) est l’une des saponines stéroïdiennes isolées de la racine de la plante médicinale chinoise Ophiopogon japonicas4. De plus, c’est le principal composant pharmacologiquement actif (Shen Mai San) trouvé dans Radix Ophiopogonis et est connu pour avoir certaines propriétés pharmacologiques11. De plus, il fait partie de la famille des Liliaceae et est largement utilisé pour ses effets inhibiteurs et protecteurs dans l’inflammation cellulaire et les lésions myocardiques. Par exemple, l’OP-D améliore les lésions de type dermatite atopique induites par la DNCB et les cellules HaCaT inflammatoires du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) chez les souris BALB / c12. Il est important de noter que l’OP-D favorise la protection antioxydante du système cardiovasculaire et protège le cœur contre les lésions autophages induites par la doxorubicine en réduisant à la fois la génération d’espèces réactives de l’oxygène et la perturbation des dommages à la membrane mitochondriale. Des expériences ont montré que la prise d’OP-D avec du mono-desmoside aide à stimuler la santé immunitaire, à augmenter le nombre de globules blancs et la synthèse de l’ADN, et à prolonger la durée de vie des anticorps13. Il a déjà été constaté que l’OP-D a un effet adjuvant14.
Les nanoémulsions sont des nanoformulations huile-dans-eau composées d’une combinaison de tensioactifs, d’huile, de cotensioactifs et d’eau12,15. Ces conceptions de nanovaccins permettent d’encapsuler les antigènes et les adjuvants ensemble pour améliorer la stimulation immunitaire, protéger les antigènes et favoriser la maturation des cellules dendritiques (DC)16. Pour le développement de ces nouveaux adjuvants obtenus par dépistage, il est important de trouver des méthodes appropriées pour évaluer leurs capacités de réponse cellulaire.
Le but de ce protocole est d’évaluer systématiquement si les adjuvants peuvent améliorer la phagocytose et l’expression des cellules immunitaires en culture cellulaire in vitro et d’élaborer les principales méthodes expérimentales. L’expérience est divisée en quatre sous-sections : (1) la toxicité des cellules OP-D et NOD pour les cellules L929 est déterminée par le test du kit de comptage cellulaire 8 (CCK-8); (2) les taux de cytokines de l’IFN-γ endocrinienne et de l’IL-17A et le nombre de cellules correspondant chez les souris immunisées sont détectés par stimulation splénocytaire et tests ELISpot; (3) la capacité de présentation de l’antigène des CD après stimulation adjuvante est observée par microscopie confocale; et (4) les trois types de cytokines, IL-1β, IL-6 et TNF-α, dans les surnageants obtenus à partir de macrophages péritonéaux (PM) chez des souris normales cocultivées avec des adjuvants sont détectés.
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Protocol
Toutes les expériences cellulaires ont été réalisées dans un laboratoire d’ingénierie cellulaire équipé de salles d’opération de base, de salles tampons, de salles de culture stérile et de salles d’identification et d’analyse. L’environnement et les conditions de travail étaient exempts de contamination microbienne et d’autres facteurs nocifs. Les expériences sur les animaux ont été menées sur la base des Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité de bien-être et d’éthique des animaux de laboratoire de la troisième Université médicale militaire.
1. Autoclavage et préparation du matériel
- Préparer les réactifs et les consommables, tels que la solution saline tamponnée au phosphate (PBS), les ciseaux, les pinces et les mailles abrasives, par stérilisation à la chaleur humide à l’autoclave à 121 °C pendant 20 min.
- Pour connaître les réactifs et l’équipement requis, consultez le tableau des matériaux. Pour la formule de la nanoémulsion vierge (BNE), consultez le tableau 1.
2. Essai de cytotoxicité L929
- Allumez le bain-marie et réglez la température à 37 °C. Prélever un tube de cellules L929 congelées dans de l’azote liquide et décongeler rapidement dans un bain-marie à 37 °C.
- Pipeter les cellules dans un tube centrifuge stérile de 15 ml rapidement après la décongélation, ajouter 2 ml de DMEM et bien mélanger.
- Centrifuger les échantillons à 129 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Ensuite, ajoutez 2 ml de DMEM pour remettre les cellules en suspension et centrifugez à nouveau les échantillons à 129 x g pendant 5 min.
- Jeter le surnageant, ajouter 6 mL de milieu complet DMEM (contenant 10 % de FBS) pour la remise en suspension et transférer dans un ballon de culture T25 dans un incubateur à 37 °C contenant 5 % de CO2 en culture pendant 48 h.
- Jeter le milieu de culture dans le ballon de culture et laver les cellules deux fois avec 2 mL de PBS. Ensuite, ajoutez 1 mL de trypsine à 0,25% pour digérer les cellules pendant 1-2 min à 37 °C.
- Lorsque l’arrondi des cellules est observé, ajouter 4 mL de milieu complet DMEM pour terminer la digestion immédiatement et bien mélanger. Ensuite, aspirez les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml et centrifugez à 129 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet DMEM. Utiliser une suspension cellulaire de 20 μL pour le comptage des cellules à l’aide de plaques de comptage de cellules et diluer les cellules restantes à 1 x 105 cellules/mL avec un milieu complet DMEM.
- Ajouter 100 μL d’eau ultrapure à la périphérie d’une plaque de 96 puits et ajouter 100 μL de diluant cellulaire aux puits internes seulement. Placer la plaque dans l’incubateur pour la culture adhérente pendant 4 h à 37 °C.
- Une fois les cellules adhérentes, ajouter l’OP-D et le NOD séparément dans le milieu complet DMEM jusqu’à un volume final de 200 μL/puits (les concentrations finales de chaque médicament sont de 480 μg/mL, 240 μg/mL, 120 μg/mL, 60 μg/mL et 30 μg/mL). Pour chaque concentration, utiliser trois puits comme répétitions. Ensuite, replacez les cellules dans l’incubateur et cultivez-les pendant encore 24 heures.
- Diluer CCK-8 à 10 % avec un milieu complet DMEM et ajouter 100 μL/puits de dilutions contenant l’adjuvant et les solutions cellulaires dans la plaque de 96 puits. Replacez la plaque dans l’incubateur et incuber pendant encore 2-3 h.
- Mélanger fréquemment tout en placant la solution cellulaire pour éviter l’inhomogénéité due à la précipitation cellulaire. Secouez doucement la plaque plusieurs fois avant et après l’ajout du CCK-8 pour bien mélanger le milieu et la solution CCK-8.
- Mesurer l’absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Mettez en place un puits de mise à zéro avec seulement un milieu et CCK-8 pour une valeur d’absorbance de base. Calculez des valeurs d’absorbance précises en soustrayant la valeur d’absorbance mise à zéro de la valeur d’absorbance obtenue lors du traçage.
- Confirmer qu’aucune bulle n’est présente dans les puits avant le test avec le lecteur de microplaques, car les bulles interféreront avec le test.
3. Stimulation des splénocytes
- Immuniser les souris BALB/c âgées de 6 à 8 semaines avec 30 μg d’antigène protéique plus 30 μg d’adjuvant par injection intramusculaire (200 μL) au jour 0, au jour 7 et au jour 14 selon les groupes expérimentaux suivants : (1) groupe PBS, (2) groupe antigène (Ag), (3) antigène + groupe OP-D (Ag/OP-D), (4) antigène + groupe BNE (Ag/BNE), (5) groupe antigène + NOD (Ag/NOD) et (6) groupe antigène + AlPO4 (Ag/Al).
- Salle de préparation : Le jour 24 après la primovaccination, retirer les souris de la salle animalière et les euthanasier par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %. Placez les souris dans un plat en verre et faites tremper dans 75% d’alcool pendant 5 min.
- Placez les tubes de centrifugation sur une grille à tubes à centrifuger, numérotez les boîtes de Petri jetables et ajoutez 5 ml de PBS à chaque boîte de Petri avec une pipette de 10 ml.
- Faites une incision de 6 à 8 cm avec des ciseaux au milieu de la face ventrale gauche de la souris, déchirez la peau, exposez la paroi abdominale et localisez la longue bande rouge de la rate.
- Soulevez le péritoine sur le côté inférieur de la rate avec une pince, coupez-le et retournez-le vers le haut pour exposer la rate. Soulevez la rate avec une pince, séparez le tissu conjonctif sous la rate avec des ciseaux ophtalmiques et retirez la rate.
- Placer la rate dans une boîte de Petri contenant 5 mL de PBS et moudre avec un tamis (200 mailles, 70 μm) et une barre de broyage. Après broyage, transférer le liquide dans un tube à centrifuger de 15 mL avec un compte-gouttes de coude conformément à la numérotation.
- Centrifuger le liquide à 453 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, ajouter 3 mL de tampon de lyse des globules rouges à chaque tube, remettre les cellules en suspension et lyser à température ambiante pendant 10 minutes.
- Ajouter 10-12 mL de PBS dans chaque tube, mélanger le tube à l’envers et centrifuger à 453 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, ajouter 10 mL de PBS à chaque tube centrifuge et remettre les cellules en suspension.
- Prélever 20 μL de chaque échantillon dans un puits de la plaque de comptage des cellules et enregistrer le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
- Centrifuger les échantillons à 453 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspendre les cellules, diluer à 2,5 x 106 cellules/mL avec un milieu RF-10 (information sur la formulation dans le tableau 2) et ajouter à une plaque de 96 puits à 100 μL/puits.
- Diluer l’antigène avec le milieu RF-10 à 10 μg/mL, ajouter 100 μL à chaque puits et incuber pendant 3 jours à 37 °C dans 5 % de CO2.
- Aspirer la suspension cellulaire obtenue à partir de chaque groupe de cellules dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL, centrifuger à 453 x g pendant 20 minutes et aspirer le surnageant dans un tube à centrifuger propre.
- Effectuer la détection des contenus IFN-γ et IL-17A strictement en suivant les instructions du kit ELISA. Les méthodes et procédures sont les suivantes.
- Préparer 1x solution de travail tampon de lavage (fournie avec le kit), solution de concentration à gradient standard (diluer la solution étalon de cytokines à 500 pg / mL, 250 pg / mL, 125 pg / mL, 62,5 pg / mL, 31,3 pg / mL et 15,6 pg / mL dans le tampon de dilution R [1x] fourni avec le kit), solution de travail d’anticorps biotinylés (solution d’anticorps biotinylés diluée à 1:100 en utilisant le tampon de dilution R [1x] fourni avec le kit pour former la solution de travail), et une solution de travail streptavidine-HRP au besoin.
- Ajouter 100 μL/puits de solution étalon de cytokines diluées dans le puits étalon, 100 μL/puits d’échantillon dans le puits d’échantillon (le tampon de dilution R [1x] fourni avec la trousse est utilisé pour la dilution de l’échantillon) et 100 μL/puits de tampon de dilution R (1x) dans le puits témoin blanc.
- Ajouter la solution de travail d’anticorps biotinylés à 50 μL/puits. Bien mélanger, couvrir d’une membrane d’étanchéité et incuber à 37 °C pendant 90 min.
- Retirer le liquide des puits et ajouter 1x solution de travail tampon de lavage à 300 μL/puits. Jetez le liquide des puits après 1 min. Répétez ce processus 4x en laissant le liquide sécher sur du papier filtre à chaque fois.
- Ajouter 100 μL/puits de solution de travail streptavidine-HRP. Couvrir et incuber les échantillons à 37 °C pendant 30 min. Centrifuger les échantillons à 453 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
REMARQUE: La solution de lavage restant dans le puits de réaction pendant le processus de lavage doit être soigneusement tapotée jusqu’à ce qu’aucun filigrane ne puisse être vu sur le papier filtre. - Ajouter TMB à 100 μL/puits, incuber les plaques à 37 °C pendant 5-30 min dans l’obscurité, et juger de la réaction de terminaison en fonction de la profondeur de couleur dans le puits (bleu foncé). Habituellement, 10-20 min pour le développement des couleurs peuvent obtenir de bons résultats.
- Mettre fin rapidement à la réaction en ajoutant une solution d’arrêt à 100 μL/puits. Détecter la valeur d’absorbance à 450 nm dans les 10 minutes suivant la terminaison.
NOTE: Équilibrer le réactif à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation.
4. Test ELISpot
- Effectuer l’immunisation des souris et la collecte des splénocytes exactement comme décrit aux étapes 3.1 à 3.10 ci-dessus. Effectuer les tests pour l’IFN-γ et l’IL-17A en stricte conformité avec les instructions du kit. Les méthodes et procédures sont les suivantes.
- Retirer la plaque de l’emballage scellé, laver 4x avec du PBS stérile (200 μL/puits) et ajouter 1640 milieux de culture complets (200 μL/puits) pour l’équilibrer à température ambiante pendant 2 h.
- Retirer le milieu et diluer la suspension de splénocytes avec un milieu RF-10 à 2 x 105 cellules/mL, en ajoutant 50 μL de cellules et d’antigène par puits (concentration finale : 10 μg/mL).
- Placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 48 h. Ne déplacez pas la plaque pendant ce temps et prenez des mesures pour éviter l’évaporation (p. ex., enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium).
- Diluer l’anticorps de détection (BVD6-24G2-biotine) à 1 μg/mL (1:1 000) dans une solution saline tamponnée au phosphate (0,5 mL:100 mL) contenant 0,5 % de sérum fœtal bovin (PBS-0,5 % FBS). Ajouter 100 μL/puits dans la plaque et l’incuber à température ambiante pendant 2 h après filtration à travers une membrane de 0,22 μm.
- Décanter le liquide dans les puits, ajouter 1x tampon de lavage à 200 μL/puits et laver 5x. Laisser sécher 30 à 60 s à chaque fois et, pour la dernière fois, laisser sécher sur du papier buvard.
- Diluer la streptavidine-peroxydase de raifort (1:1 000) dans du PBS-0,5 % de FBS et ajouter 100 μL/puits. Incuber la plaque pendant 1 h à température ambiante. Lavez la plaque comme indiqué à l’étape 4.6.
- Ajouter 100 μL/puits de solution de substrat TMB prête à l’emploi et développer jusqu’à ce qu’un point clair apparaisse. Arrêtez le développement de la couleur en lavant abondamment à l’eau désionisée (rincer 5x-6x à plusieurs reprises). Si nécessaire, retirez le ponceau (le plastique souple sous la plaque) et rincez la face inférieure de la membrane.
- Examinez et comptez les taches sur un lecteur ELISpot ou un microscope à dissection après le séchage de la plaque.
5. Adoption par les pays en développement
- Euthanasier les souris normales BALB/c par injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de pentobarbital sodique à 1 %. Faire tremper les souris dans de l’alcool à 75% pendant 5 min.
- Coupez une incision de 6 à 8 cm sous l’abdomen de la souris avec des ciseaux et serrez les deux extrémités de l’ouverture pour la séparer dans différentes directions et exposer les pattes de la souris. Séparez le fémur de la souris du corps de la souris et le tibia de l’articulation et gardez les os intacts aux deux extrémités.
- Enlevez le tissu résiduel et le cartilage des articulations aux deux extrémités du fémur à l’aide de ciseaux et de pinces. Faire tremper les fémurs dans de l’alcool à 75% pendant 5 minutes, puis tremper dans une solution stérile de PBS pour laver l’alcool de surface.
- Couper les extrémités des fémurs avec des ciseaux et rincer la moelle osseuse dans une boîte de Petri stérile avec une solution stérile de PBS suivie d’une aspiration avec une seringue de 1 mL. Répétez le lavage 3x-5x.
- Filtrer à l’aide d’un tamis cellulaire (200 mesh, 70 μm) et recueillir les BMDC dans un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger les échantillons à 290 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant, ajouter 4 mL de tampon de lyse des globules rouges, remettre en suspension et lyser à température ambiante pendant 5 minutes.
- Ajouter 10 mL de solution PBS stérile pour neutraliser le lysat, centrifuger à 290 x g pendant 5 minutes et jeter le surnageant.
- Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM contenant 1 % de solution de pénicilline-streptomycine et 10 % de FBS et comptez. Ensuite, ajoutez du GM-CSF (20 ng / mL) plus IL-4 (10 ng / mL) au milieu, ajustez la concentration cellulaire à 5 x 105 / ml et inoculez les cellules sur des lamelles de couverture.
- Ajouter la suspension cellulaire à une plaque de 6 puits à 2 mL/puits et placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 48 h. Changez complètement le milieu après 2 jours et changez la moitié du milieu après 4 jours.
- Sélectionner cinq puits avec des cellules en bon état (grandes cellules radiotransparentes avec des protubérances dendritiques à la surface de la cellule) à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 100x pour l’expérience du septième jour de culture. Jeter le surnageant, ajouter 2 mL de solutions GFP, OP-D + GFP et NOD + GFP diluées avec un milieu complet DMEM (concentration finale GFP : 20 μg/mL; concentration finale adjuvant : 10 μg/mL) dans chaque puits et incuber les plaques à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité.
- Laver les assiettes 3x avec du PBS, ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4% à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 min. Retirer le paraformaldéhyde après fixation, incuber les cellules avec de la phalloïdine et du DAPI à une concentration finale de 10 μg/mL pendant 10 min pour la coloration, puis laver 3x avec du PBS.
- Ajouter 1 mL de PBS à chaque puits et observer l’absorption de l’antigène à l’aide du CLSM, comme décrit ci-dessous.
- Ouvrez le logiciel CLSM, cliquez sur Système ZEN et attendez la fin de l’initialisation du matériel.
- Cliquez sur les raccourcis GFP et DAPI dans l’onglet Localiser pour trouver la zone qui peut être observée. Éteignez la lumière fluorescente et la lumière transmise.
- Cliquez sur Smart Setup dans le menu d’acquisition pour ouvrir la bibliothèque de colorants et ajoutez trois colorants fluorescents : EGFP, phalloïdine et DAPI. Cliquez sur Meilleur signal > OK. Cliquez sur le canal EGFP dans l’onglet canaux et cliquez sur En direct pour sélectionner le champ de vision correct sur la bonne interface.
- Sélectionnez 1 UA pour le trou d’épingle, faites pivoter la vis de mise au point fine pour régler la distance focale et sélectionnez le plan focal approprié. Cliquez sur Range Indicator (Indicateur de portée ) et ajustez la combinaison de puissance laser et de gain principal afin que seuls des points rouges sporadiques apparaissent sur l’image.
- Ajustez les canaux phalloïdine et DAPI avec les mêmes paramètres sans modifier la puissance du laser.
- Sélectionnez Arrêter en direct et cliquez sur Mode d’acquisition pour modifier les paramètres de prise de vue: Taille du cadre: 1024 pixels x 1024 pixels; Vitesse de numérisation: 7; Moyenne: 2x. Cliquez sur Snap et sélectionnez Split pour voir toutes les images prises. Enregistrez les images.
6. Activation des macrophages
- Plongez les souris C57BL/6 dans de l’alcool à 75 % après l’euthanasie et placez-les face vers le haut dans une boîte de Petri en verre dans l’ordre numéroté.
- Passez les souris par la fenêtre de transfert dans la salle d’opération stérile et placez-les sur la table d’opération pendant 5 minutes.
- À l’aide d’une seringue, aspirer 10 mL de solution saline, incliner les souris vers le bas à environ 45° et injecter au milieu de la cavité abdominale. Prélever environ 5 mL de suspension cellulaire dans un tube centrifuge de 15 mL pour chaque 10 mL et répéter l’injection 3x.
- Centrifuger la suspension cellulaire à 129 x g pendant 5 min pour obtenir des macrophages primaires péritonéaux de souris. Remettez les cellules en suspension, ajustez la concentration de cellules à 2 x 106 cellules/ml avec le milieu complet RPMI 1640 (contenant 10 % de FBS) et inoculez la suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits pour assurer un nombre constant de cellules par puits (1 mL/puits).
- Culture à 37 °C dans 5 % de CO 2 pendant une nuit (environ 16-20 h), suivie d’une incubation avec PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD et Ag/Al (concentration finale d’Ag : 5 μg/mL; concentration finale de l’adjuvant : 10 μg/mL; volume total :2 mL) pendant 24 h. Détecter les niveaux d’IL-1β, d’IL-6 et de TNF-α dans le surnageant de culture à l’aide de kits ELISA en utilisant les méthodes et procédures décrites aux étapes 3.12-3.19.
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Representative Results
L’évaluation de l’activité cellulaire des adjuvants OP-D et NOD a été réalisée in vitro conformément au protocole. Les fibroblastes L929 sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro du NOD (Figure 1). La quantification des taux de cytokines inflammatoires dans la rate peut aider les chercheurs à mieux comprendre la réponse immunitaire (Figure 2). La surveillance des LTC avec ELISpot est l’étalon-or pour évaluer l’immunité des lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les essais cliniques et pour le dépistage des candidats vaccins (Figure 3). L’absorption accrue d’un antigène par les CD peut provoquer des réponses immunitaires adaptatives accrues (Figure 4). Les macrophages jouent un rôle important dans la présentation des antigènes aux lymphocytes T, ainsi que dans l’induction d’autres cellules présentatrices d’antigènes à exprimer des molécules costimulantes, initiant ainsi des réponses immunitaires adaptatives (Figure 5). Les résultats expérimentaux ci-dessus ont été publiés par Tong et al., et les différentes réponses en anticorps in vivo et l’efficacité de protection contre les souris peuvent être trouvées dans l’articleoriginal 14.
Figure 1 : Test de cytotoxicité in vitro des cellules L929. Les effets cytotoxiques de différentes concentrations de gradient d’OP-D et de NOD (30 μg/mL, 60 μg/mL, 120 μg/mL, 240 μg/mL et 480 μg/mL) lorsqu’ils sont incubés avec des cellules L929 sont démontrés. Un kit CCK-8 a été utilisé pour la détection. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Les différences entre les deux groupes ont été analysées à l’aide d’un test t de Student bilatéral non apparié. Toutes les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± ET (n = 3), et les différences significatives sont exprimées comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001. Ce chiffre a été modifié à partir de Tong et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Niveaux d’IFN-γ et d’IL-17A dans les splénocytes. Les splénocytes de souris vaccinées ont été stimulés avec l’antigène pendant 3 jours, et les niveaux des cytokines (A) IFN-γ et (B) IL-17A dans le surnageant ont été mesurés par ELISA. Les résultats ont montré que la production d’IFN-γ et d’IL-17A était significativement augmentée dans le groupe Ag/NOD par rapport aux groupes Ag/OP-D, Ag/BNE et Ag/Al (p < 0,01). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Les différences entre les multiples groupes ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey. Toutes les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± ET (n = 8), et les différences significatives sont exprimées comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001. Ce chiffre a été modifié à partir de Tong et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Nombre de cellules sécrétrices d’IFN-γ et d’IL-17A dans la population de splénosocytes. (A) Analyse ELISpot des cellules T spécifiques de l’antigène formant des IFN-γ parmi les splénocytes. (B) Analyse ELISpot des lymphocytes T spécifiques de l’antigène localisé formant l’IL-17A parmi les splénocytes. Comme pour les résultats des cytokines, les groupes Ag/OP-D et Ag/NOD ont montré une augmentation significative des ratios et du nombre de cellules formant des IFN-γ et IL-17A dans la population de lymphoïdes T spléniques. Le groupe Ag/NOD a induit des réponses immunitaires Th1 (p < 0,001) et Th17 (p < 0,01) plus fortes que les autres groupes. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Les différences entre les multiples groupes ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey. Toutes les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± ET (n = 8), et les différences significatives sont exprimées comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001. Ce chiffre a été modifié à partir de Tong et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Images CLSM de l’absorption d’antigènes par les BMDC. La phalloïdine colore le cytosquelette en rouge, DAPI colore le noyau en bleu et GFP présente une fluorescence verte. Comme le montre la figure, une fluorescence verte est observée dans le CLSM après 30 min de coïncubation des groupes GFP + OP-D et GFP + NOD avec les BMDC, mais les particules GFP + NOD sont entourées de structures vésiculeuses de type phagosome, alors que les particules GFP + OP-D ne le sont pas. Ce chiffre a été modifié à partir de Tong et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Impact de l’antigène formulé avec adjuvant sur l’activation des MP. ELISA pour la détection des concentrations des cytokines IL-1β, IL-6 et TNF-α dans le surnageant des particules coincubées avec PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD et Ag/Al. Par rapport à la stimulation antigénique, la stimulation Ag/NOD, Ag/OP-D et Ag/Al a toutes augmenté significativement la sécrétion d’IL-1β, d’IL-6 et de TNF-α par les PM (p < 0,05). L’activation des macrophages a été significativement améliorée dans le groupe NOD par rapport aux groupes OP-D et AlPO4 (p < 0,05). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Les différences entre les multiples groupes ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey. Toutes les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± ET (n = 8), et les différences significatives sont exprimées comme suit : *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001. Ce chiffre a été modifié à partir de Tong et al.14. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réactif | Densité | Masse (par 10g) |
| Cremophor EL-35 | vrac | 1.92 |
| glycérol | vrac | 0.48 |
| Le | vrac | 0.6 |
| Eau ultrapure | vrac | Montant résiduel |
Tableau 1 : La formule de BNE.
| Réactif | Densité | Volume |
| β- Mercaptoéthanol | 50μM | 0,366 μL |
| Sérum fœtal bovin | 1X | 10 ml |
| Glutamax | 2mM | 1 ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85 ml |
| HEPES | 10mM | 1 ml |
| Acides aminés non essentiels (100x) | 1X | 1 ml |
| Solution de pénicilline-streptomycine | 100U/ml | 1 ml |
| Pyruvate de sodium (100 mM) | 1mM | 1 ml |
Tableau 2 : Informations de préparation pour le milieu complet RF-10.
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Discussion
Les vaccins sous-unitaires offrent une excellente innocuité, mais une faible immunogénicité. La principale stratégie pour améliorer l’immunogénicité consiste à adsorber physiquement ou à coupler les antigènes avec des adjuvants et à les incorporer dans les systèmes d’administration des médicaments afin de favoriser l’adoption et la présentation par les pays en développement. Les saponines végétales naturelles telles que la saponine de quillaia et ses dérivés sont hautement toxiques et ne conviennent pas au développement de vaccins humains17. Par conséquent, l’étude des effets toxiques des vaccins ou des adjuvants sur les cellules est une première étape nécessaire dans l’évaluation de nouveaux vaccins.
Le protocole présenté dans cette étude est réalisé conformément à l’ISO 10993-5:200918, ce qui permet une certaine flexibilité dans la fabrication des échantillons. La lignée cellulaire toxique standard, les fibroblastes L929 et les fibroblastes gingivaux ont des niveaux similaires de cytotoxicité. Cependant, les fibroblastes L929 sont devenus un modèle de criblage utile pour les tests de toxicité in vitro des nanomatériaux en raison de leur excellente reproductibilité19. MTT et CCK-8 sont couramment utilisés pour les tests de viabilité cellulaire et de cytotoxicité. Les résultats des tests MTT et CCK-8 se contredisent et ne sont pas significativement corrélés, mais la viabilité cellulaire du test CCK-8 est significativement différente de celle du test MTT20. Une explication possible des résultats du MTT dans l’étude précédente est que l’accélération de la mort cellulaire peut être induite à des concentrations plus élevées de MTT21. Les résultats expérimentaux de la méthode CCK-8 sont généralement cohérents avec les résultats des essais de toxicité chez l’animal22. Par conséquent, jusqu’à ce que de nouvelles méthodes d’évaluation de la cytotoxicité soient disponibles, l’utilisation du test CCK-8 pour détecter la toxicité de l’OP-D et du NOD pour les cellules L929 est probablement la meilleure option à l’heure actuelle. Cette méthode continuera également d’être appliquée dans le domaine du matériel vaccinal et de l’évaluation des adjuvants.
La rate est le plus grand organe lymphoïde secondaire du corps humain, et la quantification des taux de cytokines inflammatoires dans la rate peut nous aider à comprendre la réponse immunitaire23. On pense qu’il existe des différences fondamentales dans la structure et les types cellulaires entre la rate des souris et des humains 24, mais la similitude fondamentale des types de cellules immunitaires spécifiques et la fonction de la région de la rate rendent les études utilisant les cellules T de la rate de souris pertinentes24. Dans ce protocole, nous avons mesuré les niveaux sécrétoires de la cytokine Th1 IFN-γ et de la cytokine Th17 IL-17A dans la rate à l’aide de kits ELISA. Ce test est généralement utilisé pour les déterminations quantitatives et a une sensibilité élevée car il utilise des anticorps de haute affinité pour éliminer les substances non spécifiques. Les principales limites de cette étude sont le long temps de mesure et la forte consommation de réactifs. Les cytokines peuvent également être détectées avec la cytométrie en flux et les méthodes Luminex, mais ces méthodes nécessitent des instruments complexes, ainsi que des matières premières coûteuses et une formation spécialisée. Par conséquent, ce kit ELISA simple et économique est un outil précieux pour mesurer des réponses immunitaires spécifiques. ELISpot est devenu l’une des techniques les plus couramment utilisées pour déterminer les réponses immunitaires de cellules spécifiques formant des cytokines. Il peut être utilisé non seulement pour détecter les réponses des lymphocytes T CD8+ provoquées par les candidats vaccins, mais aussi pour la reconnaissance d’antigènes spécifiques après immunisation25. Avec un criblage à haut débit et une limite de détection sensible (1/100 000 cellules), ELISpot est largement utilisé car il offre également des avantages d’observation directe des cellules et d’analyse rapide. La formation de chaque point indique la fréquence d’activation des cellules T individuelles ou des cellules BL’évaluation de la réponse cellulaire aux vaccins et aux adjuvants est d’une grande importance, ce qui rend ELISpot irremplaçable à l’heure actuelle.
La présentation d’antigènes par les CD est une condition préalable pour déclencher des réponses immunitaires14. Les DC, qui sont utilisés pour l’absorption de l’antigène, la migration vers les ganglions lymphatiques et l’activation des lymphocytes T naïfs, sont l’un des types de cellules essentielles au développement des réponses immunitaires médiées par les lymphocytes T14. Étant donné que l’interaction des particules de nanoémulsion avec la membrane cellulaire est un déterminant clé de l’absorption des particules, la phagocytose GFP dans les CD a été déterminée à l’aide du CLSM dans ce protocole expérimental. Il a été démontré que les CD peuvent transporter efficacement les antigènes vers les ganglions lymphatiques drainants, ce qui peut expliquer pourquoi les adjuvants améliorent l’immunogénicité des antigènes in vivo. En outre, le CLSM est la mise en œuvre commerciale la plus courante de la technique et est largement utilisé dans les laboratoires d’imagerie. La capacité de sectionnement optique, la résolution claire et la polyvalence de l’imagerie 3D26 du CLSM en font le meilleur outil pour analyser l’absorption d’antigènes par les centres de distribution, même s’il ne peut pas être utilisé pour la collecte de données quantitatives.
Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH I et II) est important pour la reconnaissance spécifique des antigènes. Les molécules fonctionnelles du CMH II sont fortement exprimées dans les APC et ont pour fonction d’induire l’activation des lymphocytes T CD4+. Les APC comprennent les macrophages, les DC et les lymphocytes B27, qui modulent fortement l’immunité adaptative. Les macrophages sont largement distribués dans le système immunitaire de l’hôte et jouent un rôle clé dans la défense et l’homéostasie28. L’activation des macrophages est essentielle pour initier des réponses immunitaires adaptatives29. Pendant ce temps, les adjuvants de nanoémulsion de la même taille que les agents pathogènes peuvent favoriser la reconnaissance de l’antigène et la phagocytose, activer les inflammasomes et les macrophages NALP3 et moduler la présentation de l’antigène28. Dans ce protocole, les particules ont été principalement utilisées comme modèle pour déterminer la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires IL-1β et Th2, des cytokines IL-6 et TNF-α par ELISA, qui peuvent être utilisées pour évaluer qualitativement la capacité d’activation des macrophages des vaccins et des adjuvants. Cependant, le degré et le mécanisme d’activation doivent être déterminés par d’autres expériences. Par exemple, si l’EGF, l’IL-6 et d’autres facteurs nécessaires à l’activation des cellules immunitaires sont sécrétés et les voies de signalisation associées (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, etc.) doivent être étudiées.
En résumé, une série de protocoles pour confirmer les réponses cellulaires in vitro aux nouveaux adjuvants, y compris la cytotoxicité, la sécrétion de cytokines, l’absorption de DC et l’activation des macrophages, ont été établis. Ces protocoles démontrent non seulement une faible toxicité et une livraison cellulaire élevée, mais fournissent également des procédures détaillées pour CCK-8, ELISA et ELISpot. Les évaluations de la réponse cellulaire de l’immunopotentialisateur d’origine végétale OP-D et de son puissant adjuvant de vaccin à nanoémulsion modifié NOD ont été réalisées in vitro, et le protocole a été efficace. Bien que les techniques ELISA, ELISpot et de balayage confocale laser aient été classiquement utilisées pour évaluer l’immunocompétence in vitro des adjuvants aux cellules, ces méthodes présentent de nombreux inconvénients, tels que de longs temps de mesure, de lourdes charges de travail, des matériaux coûteux et le besoin de techniciens professionnels. De nombreuses méthodes précises et technologies de pointe, telles que les puces génétiques, le séquençage de cellules uniques et la technologie du transcriptome, doivent être utilisées dans de futures études pour élargir davantage la portée de la technique.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers ou personnels concurrents qui auraient pu influencer le travail rapporté dans cet article.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la subvention n ° 2021YFC2302603 du Programme national de recherche et de développement clé de la Chine, les subventions n ° 31670938, 32070924, 82041045 et 32000651 du programme de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine, les subventions n ° 2014jcyjA0107 et n ° 2019jcyjA-msxmx0159 du programme de projet de la Fondation des sciences naturelles de Chongqing, la subvention n ° CYS21519 du projet de recherche et d’innovation de troisième cycle de Chongqing, subvention n ° 2020XBK24 de l’Université médicale de l’armée Projets spéciaux et subvention n ° 202090031021 du Programme national d’innovation et d’entrepreneuriat pour les étudiants collégiaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
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