Summary
Protokollen presenterer detaljerte metoder for å vurdere om nanoemulsjonsophiopogonin D-adjuvansen fremmer effektive cellulære immunresponser.
Abstract
Som en hovedingrediens i vaksiner kan adjuvanser direkte indusere eller forbedre de kraftige, utbredte, medfødte og adaptive immunresponsene forbundet med antigener. Ophiopogonin D (OP-D), en renset komponent ekstrahert fra planten Ophiopogon japonicus, har vist seg å være nyttig som vaksineadjuvans. Problemene med lav oppløselighet og toksisitet av OP-D kan effektivt overvinnes ved å bruke en lav-energi emulgering metode for å forberede nanoemulsjon ophiopogonin D (NOD). I denne artikkelen undersøkes en rekke in vitro-protokoller for evaluering av cellulær aktivitet. De cytotoksiske effektene av L929 ble bestemt ved hjelp av en celletellingssett-8-analyse. Deretter ble de utskilte cytokinnivåene og tilsvarende immuncelletall etter stimulering og kultur av splenocytter fra immuniserte mus oppdaget ved ELISA- og ELISpot-metoder. I tillegg ble antigenopptaksevnen i benmargsavledede dendrittiske celler (BMDC), som ble isolert fra C57BL / 6-mus og modnet etter inkubering med GM-CSF pluss IL-4, observert ved laserskanning konfokalmikroskopi (CLSM). Det er viktig at makrofagaktivering ble bekreftet ved å måle nivåene av IL-1β, IL-6 og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) cytokiner ved ELISA-sett etter coculturing peritoneal makrofager (PM) fra blanke mus med adjuvansen i 24 timer. Det er håpet at denne protokollen vil gi andre forskere direkte og effektive eksperimentelle tilnærminger for å evaluere de cellulære responseffektene av nye vaksineadjuvanser.
Introduction
Vaksiner er et viktig middel for å forebygge og behandle smittsomme og ikke-smittsomme sykdommer. Riktig tilsetning av adjuvanser og leveringsmidler til vaksineformuleringer er gunstig for å øke immunogeniteten til antigener og generere langvarige immunresponser1. I tillegg til klassisk adjuvant alun (aluminiumsalt) er det seks typer adjuvanser for vaksiner som for tiden markedsføres: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG1018 4 og Matrix-M5. Vanligvis, når menneskekroppen møter et virusangrep, tar den første og andre forsvarslinjen (hud, slimhinner og makrofager) ledelsen i å rydde viruset, og til slutt aktiveres den tredje forsvarslinjen, som involverer immunorganer og immunceller. Aluminium- og aluminiumsalter har vært de mest brukte hjelpestoffene for humane vaksiner siden tidlig på 1920-tallet, noe som fremkaller en effektiv medfødt immunrespons6. Det har imidlertid blitt foreslått at aktiveringen av antigenpresenterende celler (APC) av klassiske adjuvanser, som stimulerer immuncellene til å generere spesifikke sett med cytokiner og kjemokiner, er mekanismen som adjuvanser virker på og kan være en av grunnene til at adjuvanser bare utøver forbigående effekter på spesifikke immunresponser7. Tilstedeværelsen av begrensede lisensierte adjuvanser til menneskelig bruk er en restriktiv faktor for å utvikle vaksiner som fremkaller effektive immunresponser8.
For tiden demonstrerer et økende antall adjuvante studier evnen til å indusere en sterk cellulær immunrespons hos mus. QS-21 har vist seg å indusere en balansert T-hjelper 1 (Th1) og T-hjelper 2 (Th2) immunrespons, produsere høyere nivåer av antistofftitere og forlenge beskyttelsen som adjuvans, men dens sterke toksisitet og hemolytiske egenskaper begrenser utviklingen som en frittstående klinisk adjuvans 9,10. OP-D (ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranoside) er en av de steroide saponinene isolert fra roten til den kinesiske medisinske planten Ophiopogon japonicas4. I tillegg er det den viktigste farmakologisk aktive komponenten (Shen Mai San) som finnes i Radix Ophiopogonis og er kjent for å ha visse farmakologiske egenskaper11. Videre er det medlem av Liliaceae-familien og er mye brukt for sine hemmende og beskyttende effekter i cellulær betennelse og myokardskade. For eksempel forbedrer OP-D DNCB-induserte atopiske dermatittlignende lesjoner og tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) inflammatoriske HaCaT-celler i BALB / c mus12. Det er viktig at OP-D fremmer den antioksidative beskyttelsen av kardiovaskulærsystemet og beskytter hjertet mot doksorubicinindusert autofagisk skade ved å redusere både reaktiv oksygenartgenerering og forstyrre mitokondriell membranskade. Eksperimenter har vist at å ta OP-D med mono-desmosid bidrar til å øke immunforsvaret, øke antall hvite blodlegemer og DNA-syntese, og få antistoffer til å vare lenger13. Det er tidligere funnet at OP-D har en adjuvant effekt14.
Nanoemulsjoner er olje-i-vann nanoformuleringer sammensatt av en kombinasjon av overflateaktive stoffer, olje, cosurfactants, og vann12,15. Disse nanovaccine designene tillater antigener og adjuvanser å bli innkapslet sammen for å forbedre immunstimulering, beskytte antigenene og fremme dendritisk celle (DC) modning16. For utvikling av disse nye adjuvansene hentet fra screening, er det viktig å finne passende metoder for å evaluere deres cellulære responsevner.
Formålet med denne protokollen er å systematisk vurdere om adjuvanser kan forsterke fagocytose og ekspresjon av immunceller i in vitro cellekultur og å utdype de viktigste eksperimentelle metodene. Forsøket er delt inn i fire underavsnitt: (1) toksisiteten til OP-D og NOD til L929-celler bestemmes av celletellingssett-8 (CCK-8) -analysen; (2) cytokinnivåene av endokrine IFN-γ og IL-17A og tilsvarende celletall hos immuniserte mus oppdages ved splenocyttstimulering og ELISpot-analyser; (3) antigenpresentasjonsevnen til DCs etter adjuvant stimulering observeres ved bruk av konfokal mikroskopi; og (4) de tre typene cytokiner, IL-1β, IL-6 og TNF-α, i supernatantene oppnådd fra peritoneale makrofager (PM) hos normale mus som er kokulturert med adjuvanser, oppdages.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle celleforsøk ble utført i et celleteknisk laboratorium utstyrt med grunnleggende operasjonsrom, bufferrom, sterile kulturrom og identifikasjons- og analyserom. Arbeidsmiljøet og forholdene var fri for mikrobiell forurensning og andre skadelige faktorer. Dyreforsøkene ble utført basert på retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av laboratoriedyrevelferds- og etikkkomiteen ved det tredje militære medisinske universitetet.
1. Autoklavering og materialforberedelse
- Klargjør reagensene og forbruksvarer, for eksempel fosfatbufret saltvann (PBS), saks, tang og slipemiddel, ved fuktig varmesterilisering ved autoklavering ved 121 ° C i 20 minutter.
- For nødvendige reagenser og utstyr, se materialtabellen. For formelen for den tomme nanoemulsjonen (BNE), sjekk tabell 1.
2. L929 cytotoksisitetsanalyse
- Slå på vannbadet og juster temperaturen til 37 °C. Samle ett rør med frosne L929-celler fra flytende nitrogen og tine raskt i et 37 °C vannbad.
- Pipetter cellene inn i et 15 ml sterilt sentrifugerrør raskt etter tining, tilsett 2 ml DMEM og bland godt.
- Sentrifuger prøvene ved 129 x g i 5 minutter og kast supernatanten. Deretter legger du til 2 ml DMEM for å resuspendere cellene, og sentrifugerer prøvene igjen ved 129 x g i 5 minutter.
- Kast supernatanten, tilsett 6 ml DMEM komplett medium (inneholdende 10 % FBS) for resuspendering, og overfør til en T25-kulturkolbe i en 37 °C inkubator med 5 % CO2 til dyrkning i 48 timer.
- Kast kulturmediet i kulturkolben og vask cellene to ganger med 2 ml PBS. Tilsett deretter 1 ml 0,25% trypsin for å fordøye cellene i 1-2 minutter ved 37 °C.
- Når avrunding av cellene observeres, tilsett 4 ml DMEM komplett medium for å avslutte fordøyelsen umiddelbart og bland godt. Aspirer deretter cellene i et 15 ml sterilt sentrifugerør og sentrifuge ved 129 x g i 5 minutter.
- Fjern supernatanten og resuspend cellene i 1 ml DMEM komplett medium. Bruk en 20 μL cellesuspensjon for celletelling ved hjelp av celletellingsplater og fortynn de resterende cellene til 1 x 105 celler / ml med DMEM komplett medium.
- Tilsett 100 μL ultrarent vann i periferien av en 96-brønnsplate og tilsett kun 100 μL cellefortynningsmiddel til de indre brønnene. Plasser platen i inkubatoren for klebrig kultur i 4 timer ved 37 ° C.
- Etter at cellene har festet seg, legg til OP-D og NOD separat i DMEM komplett medium til et endelig volum på 200 μL / brønn (de endelige konsentrasjonene av hvert legemiddel er 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml og 30 μg / ml). For hver konsentrasjon, bruk tre brønner som replikerer. Deretter plasserer du cellene tilbake i inkubatoren og kulturen i ytterligere 24 timer.
- Fortynn CCK-8 til 10% med DMEM komplett medium og tilsett 100 μL / brønnfortynninger som inneholder adjuvans- og celleløsninger til 96-brønnsplaten. Plasser platen tilbake i inkubatoren og inkuber i ytterligere 2-3 timer.
- Bland ofte mens du pletterer celleoppløsningen for å forhindre inhomogenitet på grunn av celleutfelling. Rist platen forsiktig flere ganger før og etter tilsetning av CCK-8 for å blande mediet og CCK-8-løsningen godt.
- Mål absorbansen ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Sett opp en nullstillingsbrønn med bare medium og CCK-8 for en baseline absorbansverdi. Beregn nøyaktige absorbansverdier ved å trekke den nullede absorbansverdien fra den oppnådde absorbansverdien ved plotting.
- Bekreft at ingen bobler er tilstede i noen brønner før du tester med mikroplateleseren fordi bobler vil forstyrre analysen.
3. Stimulering av splenocytter
- Immuniser BALB / c mus i alderen 6-8 uker med 30 μg proteinantigen pluss 30 μg adjuvans via en intramuskulær injeksjon (200 μL) på dag 0, dag 7 og dag 14 i henhold til følgende eksperimentelle grupper: (1) PBS-gruppe, (2) antigen (Ag) gruppe, (3) antigen + OP-D (Ag / OP-D) gruppe, (4) antigen + BNE (Ag / BNE) gruppe, (5) antigen + NOD (Ag/NOD) gruppe, og (6) antigen + AlPO4 (Ag/Al) gruppe.
- Forberedelsesrom: På dag 24 etter primærimmunisering, fjern musene fra dyrerommet og avlive dem ved en intraperitoneal injeksjon på 100 mg / kg 1% natriumpentobarbital. Legg musene i en glassfat og suge i 75% alkohol i 5 minutter.
- Plasser sentrifugerørene på et sentrifugerørstativ, nummerer engangs petriskåler, og tilsett 5 ml PBS til hver petriskål med en 10 ml pipette.
- Lag et 6-8 cm snitt med saks midt på venstre ventrale side av musen, riv opp huden, utsett bukveggen og finn miltens lange røde stripe.
- Løft bukhinnen på den nedre siden av milten med tang, kutt den åpen og vri den oppover for å eksponere milten. Løft milten med tang, skill bindevevet under milten med oftalmisk saks, og fjern milten.
- Plasser milten i en petriskål som inneholder 5 ml PBS og fres med sil (200 mesh, 70 μm) og slipestang. Etter sliping, overfør væsken til et 15 ml sentrifugerrør med en albuedråper i samsvar med nummereringen.
- Sentrifuge væsken ved 453 x g i 5 minutter. Kast supernatanten, tilsett 3 ml lysisbuffer for røde blodlegemer til hvert rør, resuspend cellene og lyse ved romtemperatur i 10 minutter.
- Tilsett 10-12 ml PBS til hvert rør, bland røret opp ned og sentrifuger ved 453 x g i 5 minutter. Kast supernatanten, tilsett 10 ml PBS til hvert sentrifugerør, og resuspend cellene.
- Ta 20 μL av hver prøve i en brønn på celletellingsplaten og registrer antall levende celler ved hjelp av en automatisert celleteller.
- Sentrifuger prøvene ved 453 x g i 5 minutter og kast supernatanten. Resuspendere cellene, fortynn til 2,5 x 106 celler/ml med RF-10 medium (formuleringsinformasjon i tabell 2), og tilsett en 96-brønns plate ved 100 μL/brønn.
- Fortynn antigenet med RF-10 medium til 10 μg / ml, tilsett 100 μL til hver brønn, og inkuber i 3 dager ved 37 ° C i 5% CO2.
- Aspirer cellesuspensjonen oppnådd fra hver gruppe celler i 1,5 ml sentrifugerør, sentrifuge ved 453 x g i 20 minutter, og aspirer supernatanten i et rent sentrifugerør.
- Utfør IFN-γ og IL-17A innholdsdeteksjon strengt i henhold til ELISA-settinstruksjonene. Metodene og prosedyrene er som følger.
- Forbered 1x vaskebufferarbeidsløsning (følger med settet), standard gradientkonsentrasjonsløsning (fortynnet cytokin standardløsning til 500 pg / ml, 250 pg / ml, 125 pg / ml, 62,5 pg / ml, 31,3 pg / ml og 15,6 pg / ml i fortynningsbufferen R [1x] som følger med settet), biotinylert antistoffarbeidsløsning (fortynnet biotinylert antistoffløsning til 1:100 ved bruk av fortynningsbufferen R [1x] som følger med settet for å danne arbeidsløsningen), og streptavidin-HRP arbeidsløsning etter behov.
- Tilsett 100 μL/brønn fortynnet cytokinstandardløsning i standardbrønnen, 100 μL/prøvebrønn i prøvebrønnen (fortynningsbufferen R [1x] som følger med settet brukes til prøvefortynning) og 100 μL/brønn med fortynningsbuffer R (1x) i den tomme kontrollbrønnen.
- Tilsett biotinylert antistoff arbeidsløsning ved 50 μL / brønn. Bland godt, dekk til med en tetningsmembran og inkuber ved 37 °C i 90 minutter.
- Fjern væsken fra brønnene og tilsett 1x vaskebuffer arbeidsløsning ved 300 μL / brønn. Kast væsken fra brønnene etter 1 min. Gjenta denne prosessen 4x slik at væsken tørker på filterpapir hver gang.
- Tilsett 100 μL / brønn streptavidin-HRP arbeidsløsning. Dekk til og inkuber prøvene ved 37 °C i 30 minutter. Sentrifuger prøvene ved 453 x g i 5 minutter og kast supernatanten.
MERK: Vaskeoppløsningen som er igjen i reaksjonsbrønnen under vaskeprosessen, bør klappes grundig til det ikke vises noe vannmerke på filterpapiret. - Tilsett TMB ved 100 μL / brønn, inkuber platene ved 37 ° C i 5-30 minutter i mørket, og døm termineringsreaksjonen i henhold til fargedybden i brønnen (mørk blå). Vanligvis kan 10-20 min for fargeutvikling oppnå gode resultater.
- Avslutt reaksjonen raskt ved å tilsette stoppoppløsning ved 100 μL / brønn. Oppdag absorbansverdien ved 450 nm innen 10 minutter etter avslutning.
NOTAT: Juster reagenset ved romtemperatur i 30 minutter før bruk.
4. ELISpot-analyse
- Utfør immunisering av musene og samlingen av splenocytter nøyaktig som beskrevet i trinn 3.1-3.10 ovenfor. Utfør analysene for IFN-γ og IL-17A i henhold til settinstruksjonene. Metodene og prosedyrene er som følger.
- Fjern platen fra den forseglede pakken, vask 4x med steril PBS (200 μL / brønn), og tilsett 1640 komplette kulturmedium (200 μL / brønn) for å balansere den ved romtemperatur i 2 timer.
- Fjern mediet og fortynn splenocyttsuspensjonen med RF-10-medium til 2 x 105 celler/ml, tilsett 50 μL celler og antigen per brønn (sluttkonsentrasjon: 10 μg/ml).
- Plasser platen i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer. Ikke flytt platen i løpet av denne tiden, og ta forholdsregler for å unngå fordampning (f.eks. pakk platen med aluminiumsfolie).
- Fortynn deteksjonsantistoffet (BVD6-24G2-biotin) til 1 μg / ml (1: 1000) i fosfatbufret saltvann (0,5 ml: 100 ml) som inneholder 0,5% føtalt bovint serum (PBS-0,5% FBS). Tilsett 100 μL / brønn på platen, og inkuber den ved romtemperatur i 2 timer etter filtrering gjennom en 0,22 μm membran.
- Dekanter væsken i brønnene, tilsett 1x vaskebuffer ved 200 μL / brønn, og vask 5x. La stå i 30-60 s hver gang, og for siste gang, la tørke på blottingpapir.
- Fortynn streptavidin-pepperrotperoksidase (1: 1000) i PBS-0,5% FBS og tilsett 100 μL / brønn. Inkuber platen i 1 time ved romtemperatur. Vask platen som i trinn 4.6.
- Tilsett 100 μL / brønn med bruksklar TMB-substratløsning og utvikle til et klart sted vises. Stopp fargeutviklingen ved å vaske mye i avionisert vann (skyll 5x-6x gjentatte ganger). Fjern om nødvendig kulverten (den myke plasten under platen), og skyll undersiden av membranen.
- Undersøk og telle flekkene på en ELISpot-leser eller dissekere mikroskop etter at platen har tørket.
5. Opptak av DCs
- Avliv BALB/c normale mus ved en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg 1 % natriumpentobarbital. Soak musene i 75% alkohol i 5 minutter.
- Klipp et 6-8 cm snitt under musens underliv med saks, og klem de to endene av åpningen for å skille den i forskjellige retninger og eksponere musens ben. Skill musens lårben fra musekroppen og tibia fra leddet, og hold beinene intakte i begge ender.
- Fjern gjenværende vev og brusk fra leddleddene i begge ender av lårbenet med saks og tang. Bløtlegg lårbenene i 75% alkohol i 5 minutter, og suge deretter i steril PBS-løsning for å vaske av overflatealkoholen.
- Klipp av endene av lårbenet med saks, og skyll benmargen i en steril petriskål med steril PBS-løsning etterfulgt av aspirasjon med en 1 ml sprøyte. Gjenta vasken 3x-5x.
- Filtrer etter en cellesikt (200 nett, 70 μm) og samle BMDC-ene i et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuge prøvene ved 290 x g i 5 minutter. Kast supernatanten, tilsett 4 ml lysisbuffer for røde blodlegemer, resuspendere og lyse ved romtemperatur i 5 minutter.
- Tilsett 10 ml steril PBS-løsning for å nøytralisere lysatet, sentrifuge ved 290 x g i 5 minutter, og kast supernatanten.
- Resuspend cellene i 1 ml DMEM inneholdende 1% penicillin-streptomycin løsning og 10% FBS og telle. Deretter legger du til GM-CSF (20 ng / ml) pluss IL-4 (10 ng / ml) til mediet, justerer cellekonsentrasjonen til 5 x 105 / ml og inokulerer cellene på deksler.
- Tilsett cellesuspensjonen til en 6-brønns plate ved 2 ml / brønn, og legg platen i en fuktet inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 48 timer. Bytt mediet helt etter 2 dager, og bytt halvparten av mediet etter 4 dager.
- Velg fem brønner med celler i god stand (store og radiolystente celler med dendritiske fremspring på celleoverflaten) ved hjelp av et omvendt mikroskop ved 100x forstørrelse for eksperimentet på den syvende dagen av kulturen. Kast supernatanten, tilsett 2 ml GFP-, OP-D + GFP- og NOD + GFP-oppløsninger fortynnet med DMEM komplett medium (GFP sluttkonsentrasjon: 20 μg/ml; adjuvant sluttkonsentrasjon: 10 μg/ml) til hver brønn, og inkuber platene ved 37 °C i 30 minutter i mørket.
- Vask platene 3x med PBS, tilsett 1 ml 4% paraformaldehyd til hver brønn, og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter. Fjern paraformaldehydet etter fiksering, inkuber cellene med phalloidin og DAPI til en endelig konsentrasjon på 10 μg / ml i 10 minutter for farging, og vask deretter 3x med PBS.
- Tilsett 1 ml PBS i hver brønn, og observer antigenopptaket ved bruk av CLSM, som beskrevet nedenfor.
- Åpne CLSM-programvaren, klikk på ZEN System, og vent til maskinvareinitialiseringen er fullført.
- Klikk på GFP- og DAPI-snarveiene i lokaliseringsfanen for å finne området som kan observeres. Slå av fluorescerende lys og overført lys.
- Klikk på Smart Setup i oppkjøpsmenyen for å åpne fargestoffbiblioteket, og legg til tre fluorescerende fargestoffer: EGFP, phalloidin og DAPI. Klikk på Beste signal > OK. Klikk på EGFP-kanalen i kanalfanen og klikk på Live for å velge riktig synsfelt på høyre grensesnitt.
- Velg 1 AU for nålehullet, roter den fine fokuseringsskruen for å justere brennvidden, og velg riktig fokalplan. Klikk på Range Indicator og juster kombinasjonen av laserkraft og masterforsterkning slik at bare sporadiske røde prikker vises på bildet.
- Juster phalloidin- og DAPI-kanalene med de samme parametrene uten å endre lasereffekten.
- Velg Stop Live og klikk på Acquisition Mode for å endre opptaksparametrene: Rammestørrelse: 1024 piksler x 1024 piksler; Skannehastighet: 7; Gjennomsnitt: 2x. Klikk på Snap og velg Split for å se alle bildene som er tatt. Lagre bildene.
6. Makrofag aktivering
- Senk C57BL/6-mus i 75% alkohol etter eutanasi og legg dem med forsiden opp i en petriskål i glass i nummerert rekkefølge.
- Før musene gjennom overføringsvinduet inn i det sterile operasjonsrommet og sett på operasjonsbordet i 5 minutter.
- Bruk en sprøyte, aspirer 10 ml saltvann, vipp musene nedover med ca. 45 °, og injiser i midten av bukhulen. Trekk ca. 5 ml cellesuspensjon inn i et 15 ml sentrifugerør for hver 10 ml og gjenta injeksjonen 3x.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 129 x g i 5 minutter for å oppnå museperitoneale primære makrofager. Resuspend cellene, juster cellekonsentrasjonen til 2 x 106 celler / ml med RPMI 1640 komplett medium (inneholdende 10% FBS), og inokulere cellesuspensjonen i en 24-brønns plate for å sikre et konsistent antall celler per brønn (1 ml / brønn).
- Dyrkning ved 37 °C i 5 % CO 2 over natten (ca. 16-20 timer), etterfulgt av inkubasjon med PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD og Ag/Al (Ag sluttkonsentrasjon: 5 μg/ml; adjuvant sluttkonsentrasjon: 10 μg/ml; totalvolum:2 ml) i 24 timer. Oppdag nivåene av IL-1β, IL-6 og TNF-α i kultursupernatant med ELISA-sett ved hjelp av metodene og prosedyrene beskrevet i trinn 3.12-3.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den cellulære aktivitetsevalueringen av adjuvansene OP-D og NOD ble fullført in vitro i henhold til protokollen. L929 fibroblaster er en nyttig screeningmodell for in vitro toksisitetstesting av NOD (figur 1). Kvantifiseringen av inflammatoriske cytokinnivåer i milten kan hjelpe forskere bedre å forstå immunresponsen (figur 2). Monitorering av CTL med ELISpot er gullstandarden for vurdering av antigenspesifikk T-celleimmunitet i kliniske studier og for screening av vaksinekandidater (figur 3). DCs økte opptak av et antigen kan fremkalle forbedrede adaptive immunresponser (figur 4). Makrofager spiller en viktig rolle i å presentere antigener til T-celler, samt indusere andre antigenpresenterende celler til å uttrykke costimulatoriske molekyler, og derved initiere adaptive immunresponser (figur 5). Ovennevnte eksperimentelle resultater ble publisert av Tong et al., og de forskjellige antistoffresponsene in vivo og beskyttelseseffektivitet mot mus finnes i den opprinnelige artikkelen14.
Figur 1: In vitro cytotoksisitetstest av L929-celler. De cytotoksiske effektene av forskjellige gradientkonsentrasjoner av OP-D og NOD (30 μg/mL, 60 μg/mL, 120 μg/mL, 240 μg/ml og 480 μg/ml) ved inkubering med L929-celler vises. Et CCK-8-sett ble brukt til deteksjon. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en statistisk analyseprogramvare. Forskjeller mellom de to gruppene ble analysert ved hjelp av en uparret, tosidig Student t-test. Alle verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n = 3), og signifikante forskjeller uttrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tallet er modifisert fra Tong et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nivåer av IFN-γ og IL-17A i splenocytter. Splenocytter fra vaksinerte mus ble stimulert med antigenet i 3 dager, og nivåene av cytokinene (A) IFN-γ og (B) IL-17A i supernatanten ble målt med ELISA. Resultatene viste at produksjonen av IFN-γ og IL-17A var signifikant økt i Ag/NOD-gruppen sammenlignet med Ag/OP-D-, Ag/BNE- og Ag/Al-gruppene (s < 0,01). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en statistisk analyseprogramvare. Forskjeller mellom de flere gruppene ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest. Alle verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n = 8), og signifikante forskjeller uttrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tallet er modifisert fra Tong et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Antall IFN-γ- og IL-17A-sekresjonsceller i splenocyttpopulasjonen. (A) ELISpot-analyse av IFN-γ spotdannende antigenspesifikke T-celler blant splenocytter. (B) ELISpot-analyse av IL-17A spotdannende antigenspesifikke T-celler blant splenocytter. I likhet med cytokinresultatene viste Ag / OP-D- og Ag / NOD-gruppene signifikant økte forhold og antall IFN-γ- og IL-17A-dannende celler i miltlymfoid T-cellepopulasjonen. Ag/NOD-gruppen induserte sterkere Th1 (p < 0,001) og Th17 (p < 0,01) immunresponser enn de andre gruppene. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en statistisk analyseprogramvare. Forskjeller mellom de flere gruppene ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest. Alle verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n = 8), og signifikante forskjeller uttrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tallet er modifisert fra Tong et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: CLSM-bilder av antigenopptak med BMDC. Phalloidin flekker cytoskjelettet i rødt, DAPI flekker kjernen i blått, og GFP presenterer grønn fluorescens. Som vist i figuren observeres grønn fluorescens i CLSM etter 30 minutters sammenblanding av GFP + OP-D og GFP + NOD-gruppene med BMDC, men GFP + NOD-partiklene er omgitt av fagosomlignende vesikulære strukturer, mens GFP + OP-D-partiklene ikke er det. Dette tallet er modifisert fra Tong et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Virkningen av adjuvansformulert antigen på aktiveringen av partimedlemmer. ELISA for påvisning av konsentrasjonene av cytokinene IL-1β, IL-6 og TNF-α i supernatant av PMs sammenfalt med PBS, Ag, Ag / OP-D, Ag / NOD og Ag / Al. Sammenlignet med antigenstimulering økte Ag / NOD, Ag / OP-D og Ag / Al-stimulering alle signifikant IL-1β, IL-6 og TNF-α sekresjon fra PMs (p < 0,05). Aktiveringen av makrofager ble signifikant forbedret i NOD-gruppen sammenlignet med OP-D- og AlPO4-gruppene (p < 0,05). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en statistisk analyseprogramvare. Forskjeller mellom de flere gruppene ble analysert ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiple sammenligningstest. Alle verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n = 8), og signifikante forskjeller uttrykkes som følger: *p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001. Dette tallet er modifisert fra Tong et al.14. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Tetthet | Masse (per 10g) |
| Cremophor EL-35 | Bulk | 1.92 |
| Glyserol | Bulk | 0.48 |
| GTCC | Bulk | 0.6 |
| Ultrarent vann | Bulk | restbeløp |
Tabell 1: Formelen til BNE.
| Reagent | Tetthet | Volum |
| β- Merkaptoetanol | 50 μM | 0,366 μL |
| Foster Bovine Serum | 1X | 10 ml |
| Glutamax | 2 mM | 1 ml |
| Glutamax RPMI 1640 | 1X | 85 ml |
| HEPES | 10mM | 1 ml |
| Ikke-essensielle aminosyrer (100x) | 1X | 1 ml |
| Penicillin-streptomycin løsning | 100U/ml | 1 ml |
| Natriumpyruvat (100 mM) | 1 mM | 1 ml |
Tabell 2: Klargjøringsinformasjon for RF-10 komplett medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subenhetsvaksiner gir utmerket sikkerhet, men dårlig immunogenisitet. Hovedstrategien for å forbedre immunogenisiteten er å fysisk adsorbere eller parere antigener med adjuvanser og innlemme dem i legemiddelleveringssystemene for å fremme opptak og presentasjon av DCs. Naturlige plante saponiner som quillaia saponin og dets derivater er svært giftige og er ikke egnet for utvikling av humane vaksiner17. Derfor er studiet av toksiske effekter av vaksiner eller adjuvanser på celler et nødvendig første skritt i evalueringen av nye vaksiner.
Protokollen som presenteres i denne studien utføres i henhold til ISO 10993-5: 200918, noe som gir en viss fleksibilitet i prøvefabrikasjon. Standard giftig cellelinje, L929 fibroblaster og gingival fibroblaster har lignende nivåer av cytotoksisitet. Imidlertid har L929 fibroblaster blitt en nyttig screeningmodell for in vitro toksisitetstester av nanomaterialer på grunn av deres utmerkede reproduserbarhet19. MTT og CCK-8 brukes ofte til celle levedyktighet og cytotoksisitetsanalyser. Resultatene av MTT- og CCK-8-analyser motsier hverandre og er ikke signifikant korrelert, men cellens levedyktighet av CCK-8-analysen er signifikant forskjellig fra MTT-analysen20. En mulig forklaring på MTT-resultatene i den forrige studien er at akselererende celledød kan induseres ved høyere MTT-konsentrasjoner21. De eksperimentelle resultatene av CCK-8-metoden er generelt i samsvar med resultatene av dyretoksisitetstester22. Derfor, inntil nye cytotoksisitetsevalueringsmetoder er tilgjengelige, er bruk av CCK-8-analysen for å oppdage toksisiteten til OP-D og NOD til L929-celler sannsynligvis det beste alternativet for tiden. Denne metoden vil også fortsette å bli brukt innen vaksinematerialer og adjuvant evaluering.
Milten er det største sekundære lymfoide organet i menneskekroppen, og kvantifiseringen av inflammatoriske cytokinnivåer i milten kan hjelpe oss å forstå immunresponsen23. Det antas at det er noen grunnleggende forskjeller i strukturen og celletyper mellom milten hos mus og mennesker 24, men den grunnleggende likheten mellom spesifikke immuncelletyper og miltområdets funksjon gjør studier ved bruk av musene milt T-celler relevante24. I denne protokollen målte vi sekretoriske nivåer av Th1-cytokinet IFN-γ og Th17-cytokinet IL-17A i milten ved hjelp av ELISA-sett. Denne analysen brukes vanligvis til kvantitative bestemmelser og har høy følsomhet fordi den bruker antistoffer med høy affinitet for å vaske bort ikke-spesifikke stoffer. De viktigste begrensningene i denne studien er den lange måletiden og det høye forbruket av reagenser. Cytokiner kan også detekteres med flowcytometri og Luminex-metoder, men disse metodene krever komplekse instrumenter, samt dyre råvarer og spesialisert opplæring. Derfor er dette enkle og økonomiske ELISA-settet et verdifullt verktøy for å måle spesifikke immunresponser. ELISpot har blitt en av de mest brukte teknikkene for å bestemme immunresponsene til spesifikke cytokinspotdannende celler. Det kan brukes ikke bare til å oppdage CD8 + T-celleresponser fremkalt av vaksinekandidater, men også for anerkjennelse av spesifikke antigener etter immunisering25. Med høy gjennomstrømningsscreening og en sensitiv deteksjonsgrense (1/100 000 celler), er ELISpot mye brukt, da det også gir fordeler med direkte observasjon av celler og rask analyse. Dannelsen av hvert sted indikerer frekvensen av aktivering av individuelle T-celler eller B-cellerEvalueringen av cellulær respons på vaksiner og adjuvanser er av stor betydning, noe som gjør ELISpot uerstattelig for tiden.
Presentasjon av antigener av DCs er en forutsetning for å fremkalle immunresponser14. DC, som brukes til antigenopptak, migrasjon til lymfeknuter og aktivering av naive T-celler, er en av de essensielle celletypene for utvikling av T-cellemedierte immunresponser14. Med tanke på at samspillet mellom nanoemulsjonspartikler og cellemembranen er en nøkkeldeterminant for partikkelopptak, ble GFP-fagocytose i DCs bestemt ved bruk av CLSM i denne eksperimentelle protokollen. Det har vist seg at DCs effektivt kan transportere antigener til drenerende lymfeknuter, noe som kan være grunnen til at adjuvanser forbedrer antigenimmunogenitet in vivo. I tillegg er CLSM den vanligste kommersielle implementeringen av teknikken og er mye brukt i bildebehandlingslaboratorier. Den optiske seksjoneringsevnen, den klare oppløsningen og allsidigheten til 3D-bildebehandling26 av CLSM gjør det til det beste verktøyet for å analysere antigenopptak av DCer, selv om det ikke kan brukes til innsamling av kvantitative data.
Det store histokompatibilitetskomplekset (MHC I og II) er viktig for spesifikk anerkjennelse av antigener. MHC II funksjonelle molekyler er sterkt uttrykt i APC og funksjon for å indusere CD4 + T-celleaktivering. APC inkluderer makrofager, DC og B-lymfocytter27, som sterkt modulerer adaptiv immunitet. Makrofager er utbredt i vertsimmunsystemet og spiller en nøkkelrolle i forsvar og homeostase28. Aktivering av makrofager er viktig for å initiere adaptive immunresponser29. I mellomtiden kan nanoemulsjonsadjuvanser som er like store som patogener fremme antigengjenkjenning og fagocytose, aktivere NALP3-inflammasomer og makrofager og modulere antigenpresentasjon28. I denne protokollen ble PMs hovedsakelig brukt som en modell for å bestemme sekresjonen av de proinflammatoriske cytokinene IL-1β ogTh2, cytokiner IL-6 og TNF-α av ELISA, som kan brukes til kvalitativt å evaluere makrofagaktiveringsevnen til vaksiner og adjuvanser. Imidlertid må graden og mekanismen for aktivering bestemmes av flere eksperimenter. For eksempel, om EGF, IL-6 og andre faktorer som er nødvendige for aktivering av immunceller, utskilles, og de relaterte signalveiene (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt, etc.) må studeres.
Oppsummert er det etablert en rekke protokoller for å bekrefte in vitro-cellulære responser på nye hjelpestoffer, inkludert cytotoksisitet, cytokinsekresjon, DC-opptak og makrofagaktivering. Disse protokollene viser ikke bare lav toksisitet og høy cellulær levering, men gir også detaljerte prosedyrer for CCK-8, ELISA og ELISpot. Cellulær respons vurderinger av plante-avledet immunopotentiator OP-D og dens modifiserte kraftige nanoemulsjon vaksine adjuvant NOD ble fullført in vitro, og protokollen var effektiv. Selv om ELISA, ELISpot og konfokale laserskanningsteknikker klassisk har blitt brukt til å evaluere in vitro-immunkompetansen til adjuvanser til celler, har disse metodene mange ulemper, for eksempel lange måletider, store arbeidsbelastninger, dyre materialer og behovet for profesjonelle teknikere. Mange nøyaktige metoder og avanserte teknologier, som genbrikker, enkeltcellesekvensering og transkriptomteknologi, må brukes i fremtidige studier for å utvide omfanget av teknikken ytterligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er noen konkurrerende økonomiske eller personlige interesser som kunne ha påvirket arbeidet som er rapportert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd nr. 2021YFC2302603 fra National Key Research and Development Program of China, tilskudd nr. 31670938, 32070924, 82041045 og 32000651 av National Natural Science Foundation Program of China, tilskudd nr. 2014jcyjA0107 og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 av Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, tilskudd nr. CYS21519 av Postgraduate Research and Innovation Project of Chongqing, tilskudd nr. 2020XBK24 av Army Medical University Spesielle prosjekter, og tilskudd nr. 202090031021 av National Innovation and Entrepreneurship Program for studenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
