Summary
В протоколе представлены подробные методы оценки того, способствует ли наноэмульсионный адъювант офиопогонина D эффективным клеточным иммунным реакциям.
Abstract
В качестве основного ингредиента вакцин адъюванты могут непосредственно индуцировать или усиливать мощные, широко распространенные, врожденные и адаптивные иммунные реакции, связанные с антигенами. Было обнаружено, что офиопогонин D (OP-D), очищенный компонент, извлеченный из растения Ophiopogon japonicus, полезен в качестве адъюванта вакцины. Проблемы низкой растворимости и токсичности OP-D могут быть эффективно преодолены с помощью метода низкоэнергетического эмульгирования для получения наноэмульсии офиопогонина D (NOD). В этой статье рассматривается ряд протоколов in vitro для оценки клеточной активности. Цитотоксические эффекты L929 определяли с помощью анализа набора для подсчета клеток-8. Затем секретируемые уровни цитокинов и соответствующие номера иммунных клеток после стимуляции и культивирования спленоцитов у иммунизированных мышей были обнаружены методами ИФА и ELISpot. Кроме того, способность поглощения антигена в дендритных клетках костного мозга (BMDC), которые были выделены у мышей C57BL/6 и созрели после инкубации с GM-CSF плюс IL-4, наблюдалась с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (CLSM). Важно отметить, что активация макрофагов была подтверждена путем измерения уровней цитокинов IL-1β, IL-6 и альфа-фактора некроза опухоли (TNF-α) с помощью наборов ИФА после кокультурирования перитонеальных макрофагов (ПМ) у чистых мышей с адъювантом в течение 24 ч. Есть надежда, что этот протокол предоставит другим исследователям прямые и эффективные экспериментальные подходы к оценке эффективности клеточного ответа новых вакцинных адъювантов.
Introduction
Вакцины являются важным средством профилактики и лечения инфекционных и неинфекционных заболеваний. Соответствующее добавление адъювантов и средств доставки в составы вакцин полезно для повышения иммуногенности антигенов и генерации длительных иммунных реакций1. В дополнение к классическим адъювантным квасцам (алюминиевая соль), существует шесть видов адъювантов для вакцин, которые в настоящее время продаются: MF59 2,3, AS043,AS03 3, AS013, CpG10184 и Matrix-M5. Как правило, когда организм человека сталкивается с вирусной атакой, первая и вторая линии защиты (кожа, слизистая оболочка и макрофаги) берут на себя инициативу в очистке вируса, и, наконец, активируется третья линия защиты, включающая иммунные органы и иммунные клетки. Алюминий и соли алюминия были наиболее широко используемыми адъювантами для вакцин человека с начала 1920-х годов, вызывая эффективный врожденный иммунный ответ6. Однако было высказано предположение, что активация антигенпрезентирующих клеток (АПК) классическими адъювантами, которая стимулирует иммунные клетки генерировать специфические наборы цитокинов и хемокинов, является механизмом, с помощью которого работают адъюванты, и может быть одной из причин, по которой адъюванты оказывают только преходящее воздействие на специфические иммунные реакции7. Наличие ограниченных лицензированных адъювантов для использования человеком является ограничительным фактором для разработки вакцин, которые вызывают эффективные иммунные реакции8.
В настоящее время все большее число адъювантных исследований демонстрирует способность индуцировать сильный клеточный иммунный ответ у мышей. Было показано, что QS-21 индуцирует сбалансированный иммунный ответ Т-хелпер 1 (Th1) и Т-хелпер 2 (Th2), продуцирует более высокие уровни титров антител и продлевает защиту в качестве адъюванта, но его сильная токсичность и гемолитические свойства ограничивают его развитие в качестве автономного клинического адъюванта 9,10. OP-D (рускогенин-O-α-L-рамнопиранозии1-(1→2)-β-D-ксилопиранозил-(1→3)-β-D-фукопиранозид) является одним из стероидных сапонинов, выделенных из корня китайского лекарственного растения Ophiopogon japonicas4. Кроме того, это главный фармакологически активный компонент (Shen Mai San), обнаруженный в Radix Ophiopogonis и, как известно, обладающий определенными фармакологическими свойствами11. Кроме того, он является членом семейства Liliaceae и широко используется для его ингибирующих и защитных эффектов при клеточном воспалении и повреждении миокарда. Например, OP-D улучшает DNCB-индуцированные атопические дерматитоподобные поражения и альфа-фактор некроза опухоли (TNF-α) воспалительные клетки HaCaT у мышей BALB/c12. Важно отметить, что OP-D способствует антиоксидантной защите сердечно-сосудистой системы и защищает сердце от аутофагического повреждения, вызванного доксорубицином, уменьшая как генерацию активных форм кислорода, так и нарушая повреждение митохондриальной мембраны. Эксперименты показали, что прием OP-D с монодесмозидом помогает укрепить иммунное здоровье, увеличить количество лейкоцитов и синтез ДНК, а также продлить срок действия антител13. Ранее было установлено, что OP-D обладает адъювантным эффектом14.
Наноэмульсии представляют собой наноформуляции «масло в воде», состоящие из комбинации поверхностно-активных веществ, масла, соврафактантов и воды12,15. Эти нановакцинные конструкции позволяют инкапсулировать антигены и адъюванты вместе для усиления иммунной стимуляции, защиты антигенов и содействия созреванию дендритных клеток (DC)16. Для разработки этих новых адъювантов, полученных в результате скрининга, важно найти соответствующие методы оценки их способностей клеточного ответа.
Целью этого протокола является систематическая оценка того, могут ли адъюванты усиливать фагоцитоз и экспрессию иммунных клеток в культуре клеток in vitro , и разработка основных экспериментальных методов. Эксперимент разделен на четыре подраздела: (1) токсичность OP-D и NOD для клеток L929 определяется с помощью анализа набора для подсчета клеток-8 (CCK-8); (2) уровни цитокинов эндокринных IFN-γ и IL-17A и соответствующие номера клеток у иммунизированных мышей обнаруживаются с помощью стимуляции спленоцитов и анализов ELISpot; (3) антигенная презентационная способность ДК после адъювантной стимуляции наблюдается с помощью конфокальной микроскопии; и (4) обнаруживаются три вида цитокинов, IL-1β, IL-6 и TNF-α, в супернатантах, полученных из перитонеальных макрофагов (ПМ) у нормальных мышей, кокутивированных с адъювантами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все клеточные эксперименты проводились в лаборатории клеточной инженерии, оснащенной базовыми операционными, буферными комнатами, стерильными культуральными комнатами, а также комнатами идентификации и анализа. Рабочая среда и условия были свободны от микробного загрязнения и других вредных факторов. Эксперименты на животных проводились на основе Руководства по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных Третьего военно-медицинского университета.
1. Автоклавирование и подготовка материалов
- Подготовьте реагенты и расходные материалы, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), ножницы, щипцы и абразивную сетку, путем влажной тепловой стерилизации автоклавированием при 121 °C в течение 20 мин.
- Необходимые реагенты и оборудование см. в Таблице материалов. Формулу пустой наноэмульсии (BNE) см. в таблице 1.
2. Анализ цитотоксичности L929
- Включите водяную баню и отрегулируйте температуру до 37 °C. Соберите один тюбик замороженных клеток L929 из жидкого азота и быстро разморозьте на водяной бане с температурой 37 °C.
- Пипетка клеток в 15 мл стерильной центрифужной трубки быстро после оттаивания, добавьте 2 мл DMEM и хорошо перемешайте.
- Центрифугируйте образцы при 129 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант. Затем добавьте 2 мл DMEM для повторного суспендирования клеток и снова центрифугируйте образцы при 129 х г в течение 5 минут.
- Выбрасывают надосадочный материал, добавляют 6 мл полной среды DMEM (содержащей 10% FBS) для повторного суспендирования и перекладывают в колбу для культивирования T25 в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 для культивирования в течение 48 ч.
- Выбросьте культуральную среду в колбу для культивирования и дважды промыть клетки 2 мл PBS. Затем добавляют 1 мл 0,25% трипсина для переваривания клеток в течение 1-2 мин при 37 °C.
- Когда наблюдается округление клеток, добавьте 4 мл полной среды DMEM, чтобы немедленно прекратить пищеварение и хорошо перемешать. Затем аспирируйте клетки в 15 мл стерильной центрифужной трубки и центрифугу при 129 х г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и повторно суспендируйте клетки в 1 мл полной среды DMEM. Используйте суспензию клеток 20 мкл для подсчета клеток с помощью пластин подсчета клеток и разбавьте оставшиеся ячейки до 1 х 105 клеток / мл с помощью полной среды DMEM.
- Добавьте 100 мкл сверхчистой воды на периферию 96-луночной плиты и добавьте 100 мкл разбавителя клеток только во внутренние скважины. Поместите пластину в инкубатор для адгезивной культуры на 4 ч при температуре 37 °C.
- После того, как клетки прилипнут, добавляют OP-D и NOD отдельно в полной среде DMEM до конечного объема 200 мкл/лунка (конечные концентрации каждого препарата составляют 480 мкг/мл, 240 мкг/мл, 120 мкг/мл, 60 мкг/мл и 30 мкг/мл). Для каждой концентрации используйте три скважины в качестве реплик. Затем поместите клетки обратно в инкубатор и культивируйте еще 24 ч.
- Разбавляют CCK-8 до 10% полной средой DMEM и добавляют 100 мкл/луночные разбавления, содержащие адъювант и клеточные растворы, к 96-луночной пластине. Поместите пластину обратно в инкубатор и высиживайте еще 2-3 ч.
- Часто смешивайте во время покрытия клеточного раствора, чтобы предотвратить неоднородность из-за осаждения клеток. Осторожно встряхните пластину несколько раз до и после добавления CCK-8, чтобы хорошо перемешать среду и раствор CCK-8.
- Измерьте поглощение при 450 нм с помощью микропластичного считывателя. Установите обнуляющую скважину только со средой и CCK-8 для базового значения поглощения. Рассчитайте точные значения поглощения, вычитая обнуленное значение поглощения из полученного значения поглощения при построении графика.
- Убедитесь, что пузырьки не присутствуют ни в одной скважине, прежде чем тестировать с помощью считывателя микропластин, потому что пузырьки будут мешать анализу.
3. Стимуляция спленоцитов
- Иммунизировать мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель 30 мкг белкового антигена плюс 30 мкг адъюванта с помощью внутримышечной инъекции (200 мкл) на 0-й день, 7-й день и 14-й день в соответствии со следующими экспериментальными группами: (1) группа PBS, (2) группа антигена (Ag), (3) антиген + группа OP-D (Ag/OP-D), (4) антиген + BNE (Ag/BNE) группа, (5) группа антиген + NOD (Ag/NOD) и (6) антиген + Группа AlPO4 (Ag/Al).
- Подготовительная комната: На 24-й день после первичной иммунизации удалите мышей из комнаты для животных и усыпьте их путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг/кг 1% пентобарбитала натрия. Поместите мышей в стеклянную посуду и замочите в 75% спирте на 5 минут.
- Поместите трубки центрифуги на стойку для трубок центрифуги, пронумеруйте одноразовые чашки Петри и добавьте 5 мл PBS к каждой чашке Петри с помощью пипетки 10 мл.
- Сделайте разрез 6-8 см ножницами посередине левой вентральной стороны мыши, разорвите кожу, обнажите брюшную стенку и найдите длинную красную полоску селезенки.
- Поднимите брюшину на нижней стороне селезенки щипцами, разрежьте ее и поверните вверх, чтобы обнажить селезенку. Поднимите селезенку щипцами, отделите соединительную ткань под селезенкой офтальмологическими ножницами и удалите селезенку.
- Поместите селезенку в чашку Петри, содержащую 5 мл PBS, и измельчите с помощью сита (200 меш, 70 мкм) и шлифовального стержня. После измельчения переложите жидкость в центрифужную трубку объемом 15 мл с локтевой капельницей в соответствии с нумерацией.
- Центрифугируйте жидкость при 453 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант, добавьте 3 мл буфера лизиса эритроцитов в каждую трубку, повторно суспендируйте клетки и лизируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Добавьте 10-12 мл PBS в каждую трубку, перемешайте трубку вверх ногами и центрифугируйте при 453 х г в течение 5 мин. Выбросьте супернатант, добавьте 10 мл PBS в каждую трубку центрифуги и повторно суспендируйте клетки.
- Возьмите 20 мкл каждого образца в колодце счетной пластины и запишите количество живых клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток.
- Центрифугируйте образцы при 453 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант. Повторно суспендируют клетки, разбавляют до 2,5 х 106 клеток/мл средой RF-10 (информация о рецептуре в таблице 2) и добавляют к 96-луночной пластине при 100 мкл/лунка.
- Разбавить антиген средой RF-10 до 10 мкг/мл, добавить 100 мкл в каждую лунку и инкубировать в течение 3 дней при 37 °C в 5% CO2.
- Аспирировать клеточную суспензию, полученную из каждой группы клеток, в центрифужных трубках объемом 1,5 мл, центрифугу при 453 х г в течение 20 мин и аспирировать супернатант в чистую центрифужную трубку.
- Проводите определение содержания ИФН-γ и ИЛ-17А строго в соответствии с инструкциями комплекта ИФА. Методы и процедуры следующие.
- Приготовить 1x промывочный буферный рабочий раствор (поставляется в комплекте), стандартный раствор градиентной концентрации (разбавить стандартный раствор цитокинов до 500 пг/мл, 250 пг/мл, 125 пг/мл, 62,5 пг/мл, 31,3 пг/мл и 15,6 пг/мл в буфере разбавления R [1x], поставляемом с комплектом), рабочий раствор биотинилированных антител (разбавить раствор биотинилированных антител до 1:100 с использованием буфера разбавления R [1x], поставляемого с комплектом для формирования рабочего раствора), и рабочее решение стрептавидин-HRP по мере необходимости.
- Добавить 100 мкл/лунку разбавленного стандартного раствора цитокина в стандартную скважину, 100 мкл/лунку образца в пробную скважину (для разбавления образца используется буфер разбавления R [1x], поставляемый с комплектом), и 100 мкл/лунка буфера разбавления R (1x) в пустой контрольный колодец.
- Добавьте рабочий раствор биотинилированных антител при 50 мкл/лунку. Хорошо перемешать, накрыть уплотнительной мембраной и инкубировать при 37 °C в течение 90 мин.
- Удалите жидкость из скважин и добавьте 1-кратный рабочий раствор промывочного буфера при 300 мкл/лунку. Выбросьте жидкость из колодцев через 1 мин. Повторите этот процесс 4 раза, позволяя жидкости высохнуть на фильтровальной бумаге каждый раз.
- Добавить 100 мкл/лунку рабочего раствора стрептавидин-HRP. Накройте крышкой и инкубируйте образцы при 37 °C в течение 30 мин. Центрифугируйте образцы при 453 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Моющий раствор, остающийся в реакционном колодце во время процесса промывки, следует тщательно похлопать до тех пор, пока на фильтровальной бумаге не будет видно водяного знака. - Добавьте TMB при 100 мкл/лунку, инкубируйте пластины при 37 °C в течение 5-30 мин в темноте и судите о реакции окончания по глубине цвета в лунке (темно-синий). Обычно за 10-20 минут для развития цвета можно добиться хороших результатов.
- Быстро прекращают реакцию, добавляя стоп-раствор при 100 мкл/лунку. Определите значение поглощения при 450 нм в течение 10 мин после окончания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновешивайте реагент при комнатной температуре в течение 30 мин перед использованием.
4. Анализ ELISpot
- Проводят иммунизацию мышей и сбор спленоцитов точно так, как описано в шагах 3.1-3.10 выше. Выполните анализы на ИФН-γ и Ил-17А в строгом соответствии с инструкцией по комплекту. Методы и процедуры следующие.
- Снимите пластину с герметичной упаковки, промыть 4 раза стерильным PBS (200 мкл/лунка) и добавить 1640 полную питательную среду (200 мкл/лунку), чтобы сбалансировать ее при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Удалить среду и разбавить суспензию спленоцитов средой RF-10 до 2 х 105 клеток/мл, добавив 50 мкл клеток и антигена на лунку (конечная концентрация: 10 мкг/мл).
- Поместите пластину в увлажненный инкубатор при 37 °C с 5% CO2 в течение 48 ч. Не перемещайте пластину в течение этого времени и примите меры, чтобы избежать испарения (например, оберните пластину алюминиевой фольгой).
- Разводят детектирующее антитело (BVD6-24G2-биотин) до 1 мкг/мл (1:1000) в фосфатном буферном физиологическом растворе (0,5 мл:100 мл), содержащем 0,5% фетальной бычьей сыворотки (PBS-0,5% FBS). Добавьте к пластине 100 мкл/лунку и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 2 ч после фильтрации через мембрану 0,22 мкм.
- Отфильтруйте жидкость в колодцах, добавьте 1-кратный промывочный буфер при 200 мкл/лунку и промывку 5x. Каждый раз оставляйте на 30-60 с и в последний раз дайте высохнуть на промокательной бумаге.
- Развести стрептавидин-пероксидазу хрена (1:1000) в PBS-0,5% FBS и добавить 100 мкл/хорошо. Инкубировать пластину в течение 1 ч при комнатной температуре. Вымойте пластину, как показано на шаге 4.6.
- Добавьте 100 мкл/лунку готового к использованию раствора субстрата TMB и развивайте до появления четкого пятна. Остановите развитие цвета, обильно смыв в деионизированной воде (смойте 5x-6x неоднократно). При необходимости снимите водопропускную трубу (мягкий пластик под пластиной) и промойте нижнюю сторону мембраны.
- Изучите и подсчитайте пятна на считывателе ELISpot или рассекающем микроскопе после того, как пластина высохнет.
5. Освоение РС
- Усыпляют BALB/c нормальных мышей путем внутрибрюшинной инъекции 100 мг/кг 1% пентобарбитала натрия. Замочите мышей в 75% спирте в течение 5 минут.
- Вырежьте ножницами разрез на 6-8 см ниже брюшка мыши, а два конца отверстия зажмите, чтобы отделить его в разные стороны и обнажить ноги мыши. Отделите бедренную кость мыши от тела мыши и большеберцовую кость от сустава и сохраните кости нетронутыми на обоих концах.
- Удалите остаточную ткань и хрящи из суставных суставов на обоих концах бедренной кости ножницами и щипцами. Замочите бедренные кости в 75% спирте в течение 5 минут, а затем замочите в стерильном растворе PBS, чтобы смыть поверхностный спирт.
- Ножницами отрежьте концы бедренной кости и промойте костный мозг в стерильной чашке Петри стерильным раствором PBS с последующей аспирацией шприцем 1 мл. Повторите стирку 3x-5x.
- Фильтруйте клеточным ситом (200 меш, 70 мкм) и соберите БМДК в центрифужную трубку объемом 15 мл. Центрифугирование образцов при 290 х г в течение 5 мин. Откажитесь от супернатанта, добавьте 4 мл буфера лизиса эритроцитов, повторно суспендируйте и лизируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавьте 10 мл стерильного раствора PBS для нейтрализации лизата, центрифугу при 290 х г в течение 5 мин и выбросьте супернатант.
- Повторное суспендирование клеток в 1 мл ДМЭМ, содержащего 1% раствор пенициллина-стрептомицина и 10% ФБС и количество. Затем добавьте в среду GM-CSF (20 нг/мл) плюс IL-4 (10 нг/мл), отрегулируйте концентрацию в клетках до 5 х 105/мл и привите клетки на покровах.
- Добавьте клеточную суспензию в 6-луночную пластину со скоростью 2 мл/лунку и поместите пластину в увлажненный инкубатор при 37 °C с 5% CO2 в течение 48 ч. Полностью измените среду через 2 дня, а половину среды измените через 4 дня.
- Отобрали пять лунок с ячейками в хорошем состоянии (крупные и радиолюцентные клетки с дендритными выступами на поверхности клетки) с помощью инвертированного микроскопа при 100-кратном увеличении для эксперимента на седьмой день культивирования. Откажитесь от надосадочного вещества, добавьте 2 мл растворов GFP, OP-D + GFP и NOD + GFP, разбавленных полной средой DMEM (конечная концентрация GFP: 20 мкг/мл; конечная концентрация адъюванта: 10 мкг/мл) в каждую лунку, и инкубируйте пластины при 37 °C в течение 30 мин в темноте.
- Вымойте пластины 3 раза PBS, добавьте 1 мл 4% параформальдегида в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин. Удаляют параформальдегид после фиксации, инкубируют клетки с фаллоидином и DAPI до конечной концентрации 10 мкг/мл в течение 10 мин для окрашивания, а затем промывают 3 раза PBS.
- Добавьте 1 мл PBS в каждую лунку и наблюдайте за поглощением антигена с помощью CLSM, как описано ниже.
- Откройте программное обеспечение CLSM, щелкните Zen System и дождитесь завершения инициализации оборудования.
- Нажмите на ярлыки GFP и DAPI на вкладке «Найти», чтобы найти область, которую можно наблюдать. Выключите флуоресцентный свет и пропускаемый свет.
- Нажмите Smart Setup в меню приобретения, чтобы открыть библиотеку красителей, и добавьте три флуоресцентных красителя: EGFP, фаллоидин и DAPI. Нажмите на Лучший сигнал > OK. Нажмите на канал EGFP во вкладке каналов и нажмите live , чтобы выбрать правильное поле зрения на правом интерфейсе.
- Выберите 1 а.е. для точечного отверстия, поверните тонкий фокусировочный винт, чтобы отрегулировать фокусное расстояние, и выберите соответствующую фокальную плоскость. Нажмите на индикатор диапазона и отрегулируйте комбинацию мощности лазера и усиления мастера так, чтобы на изображении появлялись только спорадические красные точки.
- Отрегулируйте каналы фаллоидина и DAPI с одинаковыми параметрами без изменения мощности лазера.
- Выберите «Остановить жизнь» и нажмите « Режим съемки », чтобы изменить параметры съемки: Размер кадра: 1024 пикселя x 1024 пикселя; Скорость сканирования: 7; Усреднение: 2x. Нажмите «Привязать» и выберите «Разделить», чтобы просмотреть все сделанные изображения. Сохраните изображения.
6. Активация макрофагов
- Погрузите мышей C57BL/6 в 75% спирт после эвтаназии и поместите их лицевой стороной вверх в стеклянную чашку Петри в пронумерованном порядке.
- Пропустите мышей через трансферное окно в стерильную операционную и поставьте на операционный стол на 5 мин.
- Используя шприц, аспирировать 10 мл физиологического раствора, наклонить мышей вниз примерно на 45° и ввести в середину брюшной полости. Достаньте около 5 мл клеточной суспензии в 15 мл центрифужной трубки на каждые 10 мл и повторите инъекцию 3 раза.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 129 х г в течение 5 мин для получения перитонеальных первичных макрофагов мыши. Повторно суспендируйте клетки, отрегулируйте концентрацию клеток до 2 х 106 клеток /мл с помощью rpmI 1640 полной среды (содержащей 10% FBS) и инокулируйте клеточную суспензию в 24-луночную пластину, чтобы обеспечить постоянное количество клеток на лунку (1 мл / лунка).
- Культивирование при 37 °C в 5%CO2 в течение ночи (приблизительно 16-20 ч) с последующей инкубацией с PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD и Ag/Al (конечная концентрация Ag: 5 мкг/мл; адъювантная конечная концентрация: 10 мкг/мл; общий объем: 2 мл) в течение 24 ч. Обнаружение уровней IL-1β, IL-6 и TNF-α в супернатанте культуры с помощью наборов ИФА с использованием методов и процедур, описанных в шагах 3.12-3.19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка клеточной активности адъювантов OP-D и NOD была завершена in vitro в соответствии с протоколом. Фибробласты L929 являются полезной скрининговой моделью для тестирования токсичности NOD in vitro (рисунок 1). Количественная оценка уровней воспалительных цитокинов в селезенке может помочь исследователям лучше понять иммунный ответ (рисунок 2). Мониторинг CTL с помощью ELISpot является золотым стандартом для оценки антиген-специфического Т-клеточного иммунитета в клинических испытаниях и для скрининга вакцин-кандидатов (рисунок 3). Повышенное поглощение антигена ДК может вызвать усиленные адаптивные иммунные реакции (рисунок 4). Макрофаги играют важную роль в представлении антигенов Т-клеткам, а также в индуцировании других антигенпрезентирующих клеток к экспрессии костимуляторных молекул, тем самым инициируя адаптивные иммунные реакции (рисунок 5). Вышеуказанные экспериментальные результаты были опубликованы Tong et al., и различные реакции антител in vivo и эффективность защиты от мышей можно найти в оригинальной статье14.
Рисунок 1: Тест на цитотоксичность клеток L929 in vitro . Показаны цитотоксические эффекты различных градиентных концентраций OP-D и NOD (30 мкг/мл, 60 мкг/мл, 120 мкг/мл, 240 мкг/мл и 480 мкг/мл) при инкубации с клетками L929. Для обнаружения использовался комплект CCK-8. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Различия между двумя группами были проанализированы с использованием непарного, двуххвостого t-теста студента. Все значения выражаются как среднее ± SD (n = 3), а значимые различия выражаются следующим образом: *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Tong et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Уровни IFN-γ и IL-17A в спленоцитах. Спленоциты у вакцинированных мышей стимулировали антигеном в течение 3 дней, а уровни цитокинов (A) IFN-γ и (B) IL-17A в супернатанте измеряли с помощью ИФА. Результаты показали, что производство IFN-γ и IL-17A было значительно увеличено в группе Ag/NOD по сравнению с группами Ag/OP-D, Ag/BNE и Ag/Al (p < 0,01). Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Различия между несколькими группами были проанализированы с использованием односторонней ANOVA, за которой последовал множественный сравнительный тест Туки. Все значения выражаются как среднее ± SD (n = 8), а значимые различия выражаются следующим образом: *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Tong et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количество IFN-γ- и IL-17A-секретирующих клеток в популяции спленоцитов. (A) ELISpot анализ IFN-γ пятнистых антиген-специфических Т-клеток среди спленоцитов. (B) ELISpot анализ IL-17A пятнистых антиген-специфических Т-клеток среди спленоцитов. Подобно результатам цитокинов, группы Ag/OP-D и Ag/NOD показали значительное увеличение соотношений и количества IFN-γ- и IL-17A-образующих клеток в популяции селезеночных лимфоидных Т-клеток. Группа Ag/NOD индуцировала более сильные иммунные реакции Th1 (p < 0,001) и Th17 (p < 0,01), чем другие группы. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Различия между несколькими группами были проанализированы с использованием односторонней ANOVA, за которой последовал множественный сравнительный тест Туки. Все значения выражаются как среднее ± SD (n = 8), а значимые различия выражаются следующим образом: *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Tong et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: CLSM-изображения поглощения антигена БМДК. Фаллоидин окрашивает цитоскелет в красный цвет, DAPI окрашивает ядро в синий цвет, а GFP представляет собой зеленую флуоресценцию. Как показано на рисунке, зеленая флуоресценция наблюдается в CLSM после 30 мин коинкубации групп GFP + OP-D и GFP + NOD с BMDC, но частицы GFP + NOD окружены фагосомоподобными везикулярными структурами, в то время как частицы GFP + OP-D - нет. Эта цифра была изменена по сравнению с Tong et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние адъювантно-градуированного антигена на активацию ПМ. ИФА для обнаружения концентраций цитокинов IL-1β, IL-6 и TNF-α в супернатанте PMs, коинкубированном с PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD и Ag/Al. По сравнению со стимуляцией антигенов, стимуляция Ag/NOD, Ag/OP-D и Ag/Al значительно увеличивала секрецию IL-1β, IL-6 и TNF-α из ПМ (p < 0,05). Активация макрофагов была значительно улучшена в группе NOD по сравнению с группами OP-D и AlPO4 (p < 0,05). Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Различия между несколькими группами были проанализированы с использованием односторонней ANOVA, за которой последовал множественный сравнительный тест Туки. Все значения выражаются как среднее ± SD (n = 8), а значимые различия выражаются следующим образом: *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Tong et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Реагент | Плотность | Масса (на 10 г) |
| Кремофор ЭЛ-35 | масса | 1.92 |
| глицерин | масса | 0.48 |
| Общие условия использования | масса | 0.6 |
| Сверхчистая вода | масса | остаточная сумма |
Таблица 1: Формула БНЭ.
| Реагент | Плотность | Том |
| β- Меркаптоэтанол | 50мкМ | 0.366мкл |
| Фетальная бычья сыворотка | в 1 раз | 10мл |
| Глутамакс | 2мМ | 1мл |
| Глутамакс RPMI 1640 | в 1 раз | 85мл |
| ХЕПЕС | 10мМ | 1мл |
| Заменимые аминокислоты (100x) | в 1 раз | 1мл |
| Пенициллин-стрептомицин раствор | 100U/мл | 1мл |
| Пируват натрия (100 мМ) | 1мМ | 1мл |
Таблица 2: Информация о подготовке к комплектной среде RF-10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Субъединичные вакцины обеспечивают отличную безопасность, но плохую иммуногенность. Основная стратегия повышения иммуногенности заключается в физическом адсорбировании или соединении антигенов с адъювантами и включении их в системы доставки лекарств для содействия поглощению и презентации ДК. Натуральные растительные сапонины, такие как сапонин квиллайи и его производные, высокотоксичны и не подходят для разработки вакцин длячеловека17. Поэтому изучение токсического воздействия вакцин или адъювантов на клетки является необходимым первым шагом в оценке новых вакцин.
Протокол, представленный в этом исследовании, выполнен в соответствии с ISO 10993-5:200918, что обеспечивает некоторую гибкость в изготовлении образцов. Стандартная токсичная клеточная линия, фибробласты L929 и фибробласты десен имеют одинаковые уровни цитотоксичности. Тем не менее, фибробласты L929 стали полезной скрининговой моделью для испытаний на токсичность наноматериалов in vitro из-за их превосходной воспроизводимости19. MTT и CCK-8 обычно используются для анализа жизнеспособности клеток и цитотоксичности. Результаты анализов MTT и CCK-8 противоречат друг другу и не имеют существенной корреляции, но жизнеспособность клеток анализа CCK-8 значительно отличается от жизнеспособности анализа MTT20. Возможное объяснение результатов MTT в предыдущем исследовании заключается в том, что ускорение гибели клеток может быть индуцировано при более высоких концентрациях MTT21. Экспериментальные результаты метода CCK-8 в целом согласуются с результатами испытаний на токсичность для животных22. Поэтому до тех пор, пока не будут доступны новые методы оценки цитотоксичности, использование анализа CCK-8 для обнаружения токсичности OP-D и NOD для клеток L929, вероятно, является лучшим вариантом в настоящее время. Этот метод также будет по-прежнему применяться в области вакцинных материалов и оценки адъювантов.
Селезенка является крупнейшим вторичным лимфоидным органом в организме человека, и количественная оценка уровня воспалительных цитокинов в селезенке может помочь нам понять иммунный ответ23. Считается, что существуют некоторые фундаментальные различия в структуре и типах клеток между селезенкой мышей и человека24, но основное сходство конкретных типов иммунных клеток и функции области селезенки делают исследования с использованием Т-клеток селезенки мышей релевантными24. В этом протоколе мы измерили секреторные уровни цитокина Th1 IFN-γ и цитокина Th17 IL-17A в селезенке с использованием наборов ИФА. Этот анализ обычно используется для количественных определений и имеет высокую чувствительность, поскольку он использует высокоаффинные антитела для смывания неспецифических веществ. Основными ограничениями данного исследования являются длительное время измерения и высокий расход реагентов. Цитокины также можно обнаружить с помощью проточной цитометрии и методов Luminex, но эти методы требуют сложных инструментов, а также дорогостоящего сырья и специализированной подготовки. Поэтому этот простой и экономичный набор ИФА является ценным инструментом для измерения специфических иммунных реакций. ELISpot стал одним из наиболее часто используемых методов определения иммунных реакций специфических цитокиновых пятнистых клеток. Он может быть использован не только для выявления ответов CD8+ Т-клеток, вызванных вакцинопропагандами, но и для распознавания специфических антигенов после иммунизации25. Благодаря высокопроизводительному скринингу и чувствительному пределу обнаружения (1/100 000 клеток) ELISpot широко используется, поскольку он также предлагает преимущества прямого наблюдения за клетками и быстрого анализа. Образование каждого пятна указывает на частоту активации отдельных Т-клеток или В-клетокВызначение клеточного ответа на вакцины и адъюванты имеет большое значение, что делает ELISpot незаменимым в настоящее время.
Представление антигенов ДК является необходимым условием для возникновения иммунных реакций14. ДК, которые используются для поглощения антигена, миграции в лимфатические узлы и активации наивных Т-клеток, являются одним из основных типов клеток для развития Опосредованных Т-клетками иммунных реакций14. Учитывая, что взаимодействие наноэмульсионных частиц с клеточной мембраной является ключевым фактором, определяющим поглощение частиц, фагоцитоз GFP в ДК был определен с использованием CLSM в этом экспериментальном протоколе. Было показано, что ДК могут эффективно транспортировать антигены к дренирующим лимфатическим узлам, что может быть причиной того, что адъюванты повышают иммуногенность антигена in vivo. Кроме того, CLSM является наиболее распространенной коммерческой реализацией метода и широко используется в лабораториях визуализации. Возможность оптического секционирования, четкое разрешение и универсальность 3D-визуализации26 CLSM делают его лучшим инструментом для анализа поглощения антигена DC, даже если он не может быть использован для сбора количественных данных.
Основной комплекс гистосовместимости (MHC I и II) важен для специфического распознавания антигенов. Функциональные молекулы MHC II высоко экспрессируются в АПК и функционируют, индуцируя активацию CD4+ Т-клеток. К ПТР относятся макрофаги, ДК и В-лимфоциты27, которые сильно модулируют адаптивный иммунитет. Макрофаги широко распространены в иммунной системе хозяина и играют ключевую роль в защите и гомеостазе28. Активация макрофагов необходима для инициирования адаптивных иммунных реакций29. Между тем, наноэмульсионные адъюванты, которые имеют тот же размер, что и патогены, могут способствовать распознаванию антигенов и фагоцитозу, активировать воспаление и макрофаги NALP3 и модулировать презентацию антигена28. В этом протоколе ПМ в основном использовались в качестве модели для определения секреции провоспалительных цитокинов IL-1β иTh2, цитокинов IL-6 и TNF-α с помощью ИФА, которая может быть использована для качественной оценки способности активации макрофагов вакцин и адъювантов. Однако степень и механизм активации нужно определять с помощью большего количества экспериментов. Например, секретируются ли EGF, IL-6 и другие факторы, необходимые для активации иммунных клеток, и необходимо изучить связанные с ними сигнальные пути (JAK-STAT, JNK, PI3K-Akt и т. Д.).
Таким образом, был установлен ряд протоколов для подтверждения клеточных реакций in vitro на новые адъюванты, включая цитотоксичность, секрецию цитокинов, поглощение dc и активацию макрофагов. Эти протоколы не только демонстрируют низкую токсичность и высокую клеточную доставку, но также предоставляют подробные процедуры для CCK-8, ELISA и ELISpot. Оценки клеточного ответа иммунопотенциатора растительного происхождения OP-D и его модифицированного мощного наноэмульсионного адъюванта NOD вакцины были завершены in vitro, и протокол был эффективным. Хотя методы ИФА, ELISpot и конфокального лазерного сканирования классически использовались для оценки иммунокомпетентности адъювантов к клеткам in vitro , эти методы имеют много недостатков, таких как длительное время измерения, большие рабочие нагрузки, дорогие материалы и потребность в профессиональных техниках. Многие точные методы и передовые технологии, такие как генные чипы, секвенирование одиночных клеток и технология транскриптома, должны быть использованы в будущих исследованиях для дальнейшего расширения сферы применения метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что нет никаких конкурирующих финансовых или личных интересов, которые могли бы повлиять на работу, о которой сообщается в этой статье.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом No 2021YFC2302603 Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая, грантами No 31670938, 32070924, 82041045 и 32000651 Программы Национального фонда естественных наук Китая, грантами No 2014jcyjA0107 и No 2019jcyjA-msxmx0159 Проектной программы Фонда естественных наук Чунцина, грантом No CYS21519 Проекта исследований и инноваций для аспирантов Чунцина, грант No 2020XBK24 Специальных проектов Армейского медицинского университета и грант No 202090031021 Национальной программы инноваций и предпринимательства для студентов колледжей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-well filter plates | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BALB/c mice and C57BL/6 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| caprylic/capric triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Beijing, China | null | |
| CCK-8 kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Cell Counting Plate | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverted Microscope | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, India | null | |
| ELISpot classic | AID, Germany | ELR06 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF, R&D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Incubator | Heal Force, Switzerland | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 cell line | FENGHUISHENGWU, China | NCTC clone 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss, Germany | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| Mouse IFN-γ ELISA kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Mouse IFN-γ precoated ELISPOT kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Mouse IL-17A ELISA kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Mouse IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Mouse IL-1β ELISA kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Mouse IL-6 ELISA kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Mouse TNF-α ELISA kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Non-essential amino acids(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphate Buffered Saline | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Sodium pyruvate(100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
References
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Kuo, T. Y., et al. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Scientific Reports. 10, 20085 (2020).
- Twentyman, E., et al. Interim recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices for use of the Novavax COVID-19 vaccine in persons aged >/=18 years - United States, July 2022. MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report. 71 (31), 988-992 (2022).
- Wang, Z., et al. Improved aluminum adjuvants eliciting stronger immune response when mixed with hepatitis B virus surface antigens. ACS Omega. 7 (38), 34528-34537 (2022).
- Wang, N., Chen, M., Wang, T. Liposomes used as a vaccine adjuvant-delivery system: From basics to clinical immunization. Journal of Controlled Release. 303, 130-150 (2019).
- Akin, I., et al. Evaluation of the safety and efficacy of Advax(TM) as an adjuvant: A systematic review and meta-analysis. Advances in Medical Sciences. 67 (1), 10-17 (2022).
- Lacaille-Dubois, M. A. Updated insights into the mechanism of action and clinical profile of the immunoadjuvant QS-21: A review. Phytomedicine. 60, 152905 (2019).
- Marty-Roix, R., et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1123-1136 (2016).
- Zhang, Y. Y., et al. Ophiopogonin D attenuates doxorubicin-induced autophagic cell death by relieving mitochondrial damage in vitro and in vivo. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (1), 166-174 (2015).
- An, E. J., et al. Ophiopogonin D ameliorates DNCB-induced atopic dermatitis-like lesions in BALB/c mice and TNF-alpha- inflamed HaCaT cell. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (1), 40-46 (2020).
- Song, X., et al. Effects of polysaccharide from Ophiopogon japonicus on immune response to Newcastle disease vaccine in chicken. Pesquisa Veterinária Brasileira. 36 (12), 1155-1159 (2016).
- Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
- Lin, C. A., et al. Hyaluronic acid-glycine-cholesterol conjugate-based nanoemulsion as a potent vaccine adjuvant for T cell-mediated immunity. Pharmaceutics. 13 (10), 1569 (2021).
- Xu, H. H., et al. Global metabolomic and lipidomic analysis reveals the potential mechanisms of hemolysis effect of ophiopogonin D and ophiopogonin D' in vivo. Chinese Medicine. 16 (1), 3 (2021).
- Drane, D., Gittleson, C., Boyle, J., Maraskovsky, E. ISCOMATRIX adjuvant for prophylactic and therapeutic vaccines. Expert Review of Vaccines. 6 (5), 761-772 (2007).
- Rudolf, R., et al. Microstructure characterisation and identification of the mechanical and functional properties of a new PMMA-ZnO composite. Materials. 13 (12), 2717 (2020).
- Cannella, V., et al. Cytotoxicity evaluation of endodontic pins on L929 cell line. BioMed Research International. 2019, 3469525 (2019).
- Jiao, G., et al. Limitations of MTT and CCK-8 assay for evaluation of graphene cytotoxicity. RSC Advances. 5 (66), 53240-53244 (2015).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827 (2021).
- Li, W., Zhou, J., Xu, Y. Study of the in vitro cytotoxicity testing of medical devices. Biomedical Reports. 3 (5), 617-620 (2015).
- Wu, F., et al. Correlation between elevated inflammatory cytokines of spleen and spleen index in acute spinal cord injury. Journal of Neuroimmunology. 344, 577264 (2020).
- Lewis, S. M., Williams, A., Eisenbarth, S. C. Structure and function of the immune system in the spleen. Science Immunology. 4 (33), (2019).
- Cox, J. H., Ferrari, G., Janetzki, S. Measurement of cytokine release at the single cell level using the ELISPOT assay. Methods. 38 (4), 274-282 (2006).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Zhou, Y., et al. CD4(+) T cell activation and inflammation in NASH-related fibrosis. Frontiers in Immunology. 13, 967410 (2022).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M.
- Quesniaux, V., Erard, F., Ryffel, B. Adjuvant activity on murine and human macrophages. Methods in Molecular Biology. 626, 117-130 (2010).
