Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.
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Methodenartikel
In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Als Hauptbestandteil von Impfstoffen können Adjuvantien die starken, weit verbreiteten, angeborenen und adaptiven Immunantworten, die mit Antigenen verbunden sind, direkt induzieren oder verstärken. Ophiopogonin D (OP-D), eine gereinigte Komponente, die aus der Pflanze Ophiopogon japonicus extrahiert wird, hat sich als nützliches Impfstoff-Adjuvans erwiesen. Die Probleme der geringen Löslichkeit und Toxizität von OP-D können durch die Verwendung eines niederenergetischen Emulgierungsverfahrens zur Herstellung der Nanoemulsion Ophiopogonin D (NOD) effektiv überwunden werden. In diesem Artikel wird eine Reihe von In-vitro-Protokollen zur Bewertung der Zellaktivität untersucht. Die zytotoxischen Wirkungen von L929 wurden mit einem Zellzähl-Kit-8-Assay bestimmt. Dann wurden die sezernierten Zytokinspiegel und die entsprechenden Immunzellzahlen nach der Stimulation und Kultur von Splenozyten von immunisierten Mäusen durch ELISA- und ELISpot-Methoden nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Antigenaufnahmefähigkeit in aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDCs), die aus C57BL/6-Mäusen isoliert und nach Inkubation mit GM-CSF plus IL-4 gereift waren, durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) beobachtet. Wichtig ist, dass die Makrophagenaktivierung durch die Messung der Zytokine von IL-1β, IL-6 und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) durch ELISA-Kits bestätigt wurde, nachdem Peritonealmakrophagen (PMs) von leeren Mäusen mit dem Adjuvans für 24 Stunden kokulturiert wurden. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll anderen Forschern direkte und effektive experimentelle Ansätze zur Verfügung stellen wird, um die Wirksamkeit der zellulären Reaktion neuartiger Impfstoffadjuvantien zu bewerten.
Einleitung
Impfstoffe sind ein wichtiges Mittel zur Verhütung und Behandlung von Infektionskrankheiten und nichtübertragbaren Krankheiten. Die angemessene Zugabe von Adjuvantien und Verabreichungsvehikeln zu Impfstoffformulierungen ist vorteilhaft für die Verbesserung der Immunogenität von Antigenen und die Erzeugung lang anhaltender Immunantworten1. Neben dem klassischen Adjuvans Alaun (Aluminiumsalz) gibt es sechs Arten von Adjuvantien für Impfstoffe, die derzeit auf dem Markt sind: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG1018
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Protokoll
Alle Zellexperimente wurden in einem zelltechnischen Labor durchgeführt, das mit einfachen Operationssälen, Pufferräumen, sterilen Kulturräumen sowie Identifikations- und Analyseräumen ausgestattet war. Die Arbeitsumgebung und die Arbeitsbedingungen waren frei von mikrobieller Kontamination und anderen schädlichen Faktoren. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und von der Versuchstierschutz- und Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.
1. Autoklavieren und Materialaufbereitung
- Bereiten Sie die Reagenzi....
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Ergebnisse
Die Bewertung der zellulären Aktivität der Adjuvantien OP-D und NOD wurde in vitro gemäß dem Protokoll durchgeführt. L929-Fibroblasten sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von NOD (Abbildung 1). Die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann den Forschern helfen, die Immunantwort besser zu verstehen (Abbildung 2). Die Überwachung von CTLs mit ELISpot ist der Goldstandard für die Beur.......
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Diskussion
Subunit-Impfstoffe bieten eine ausgezeichnete Sicherheit, aber eine schlechte Immunogenität. Die Hauptstrategie zur Verbesserung der Immunogenität besteht darin, Antigene physisch zu adsorbieren oder mit Adjuvantien zu koppeln und sie in die Wirkstoffabgabesysteme zu integrieren, um die Aufnahme und Präsentation durch DCs zu fördern. Natürliche Pflanzensaponine wie Quillaia-Saponin und seine Derivate sind hochtoxisch und nicht für die Entwicklung von Humanimpfstoffengeeignet 17. Daher ist die Unte.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen oder persönlichen Interessen gibt, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch die Zuschüsse Nr. 2021YFC2302603 des National Key Research and Development Program of China, Zuschüsse Nr. 31670938, 32070924, 82041045 und 32000651 des National Natural Science Foundation Program of China, Zuschüsse Nr. 2014jcyjA0107 und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, Grant No. CYS21519 des Postgraduate Research and Innovation Project of Chongqing, Zuschuss Nr. 2020XBK24 der Army Medical University Sonderprojekte und Zuschuss Nr. 202090031021 des National Innovation and Entrepreneurship Program für College-Studenten.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin-EDTA (1x) | GIBCO, USA | 25200056 | |
| 96-Well-Filterplatten | Millipore. Billerica, MA | CLS3922 | |
| AlPO4 | General Chemical Company, USA | null | |
| Automated Cell Counter Countstar | , China | IC1000 | |
| BALB/c Mäuse und C57BL/6 Mäuse | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | null | |
| Caprylic/Capric Triglyceride (GTCC) | Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Peking, China | null | |
| CCK-8 Kits | Dojindo, Japan | CK04 | |
| Zellzählplatte | Costar, Corning, USA | CO010101 | |
| Cell Sieve | biosharp, China | BS-70-CS | |
| Zentrifuge 5810 R | Eppendorf, Deutschland | ||
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D9542 | |
| DMEM basic(1x) medium | GIBCO, USA | C11885500BT | |
| DSZ5000X Inverses Mikroskop | Nikon,Japan | DSZ5000X | |
| EL-35 (Cremophor-35) | Mumbai, Indien | null | |
| ELISpot classic | AID, Deutschland | ELR06 | |
| Fötales Rinderserum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Voll funktionsfähiger Mikroplatten-Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| GFP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P42212 | |
| Glutamax | Invitrogen, USA | 35050061 | |
| Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor | GM-CSF, R& D Systems, USA | 315-03 | |
| HEPES | Invitrogen, USA | 15630106 | |
| HF 90/240 Inkubator | Heal Force, Schweiz | null | |
| IL-4 | PeproTech, USA | 042149 | |
| L929 Zelllinie | FENGHUISHENGWU, China | NCTC Klon 929 (RRID:CVCL_0462) | |
| Laser Scanning Konfokalmikroskopie | Zeiss, Deutschland | LSM 980 | |
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, Frankreich | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, Frankreich | 36372K | |
| Maus IFN-γ ELISA-Kit | Dakewe, China | 1210002 | |
| Maus IFN-& gamma vorbeschichtetes ELISPOT Kit | Dakewe, China | DKW22-2000-096 | |
| Maus IL-17A ELISA Kit | Dakewe, China | 1211702 | |
| Maus IL-17A ELISpotPLUS Kit | ebiosciences, USA | 3521-4HPW-2 | |
| Maus IL-1β ELISA-Kit | Dakewe, China | 1210122 | |
| Maus IL-6 ELISA-Kit | Dakewe, China | 1210602 | |
| Maus TNF-α ELISA-Kit | Dakewe, China | 1217202 | |
| Nicht-essentielle Aminosäuren(100x) | Invitrogen, USA | 11140050 | |
| Ophiopogonin-D | Chengdu Purui Technology Co. Ltd | 945619-74-9 | |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | Invitrogen, USA | 15070063 | |
| Phalloidin | Solarbio, China | CA1620 | |
| Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung | ZSGB-BIO, China | ZLI-9062 | |
| Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen | Solarbio, China | R1010 | |
| RPMI 1640 Medium | Hyclone (Life Technology), USA | SH30809.01 | |
| Natriumpyruvat (100 mM) | Invitrogen, USA | 11360070 | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| β- Mercaptoethanol | Invitrogen, USA | 21985023 |
Referenzen
- Cao, W., et al. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta Biomaterials. 112, 14-28 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeuti....
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Nachdrucke und Genehmigungen
