Summary
Het artikel is gebaseerd op de creatie van een aangepast protocol voor het scannen, detecteren, sorteren en identificeren van gedigitaliseerde objecten die overeenkomen met benthische riviermabrieren met behulp van een semi-automatische beeldvormingsprocedure. Deze procedure maakt het mogelijk om de individuele grootteverdelingen en groottemetingen van een macro-ongewervelde gemeenschap in ongeveer 1 uur te verwerven.
Abstract
Lichaamsgrootte is een belangrijke functionele eigenschap die kan worden gebruikt als een bio-indicator om de effecten van verstoringen in natuurlijke gemeenschappen te beoordelen. De structuur van de gemeenschapsgrootte reageert op biotische en abiotische gradiënten, waaronder antropogene verstoringen in taxa en ecosystemen. De handmatige meting van kleine organismen zoals benthische macro-ongewervelde dieren (bijvoorbeeld >500 μm tot enkele centimeters lang) is echter tijdrovend. Om de schatting van de structuur van de gemeenschapsgrootte te versnellen, hebben we hier een protocol ontwikkeld om semi-automatisch de individuele lichaamsgrootte van geconserveerde riviermabrieren te meten, die een van de meest gebruikte bio-indicatoren zijn voor het beoordelen van de ecologische status van zoetwaterecosystemen. Dit protocol is aangepast aan een bestaande methodologie die is ontwikkeld om marien mesozooplankton te scannen met een scansysteem dat is ontworpen voor watermonsters. Het protocol bestaat uit drie hoofdstappen: (1) het scannen van subsamples (fijne en grove monstergroottefracties) van riviermacro-ongewervelde dieren en het verwerken van de gedigitaliseerde afbeeldingen om elk gedetecteerd object in elke afbeelding te individualiseren; (2) het creëren, evalueren en valideren van een leerset door middel van kunstmatige intelligentie om de individuele beelden van macro-ongewervelde dieren semi-automatisch te scheiden van afval en artefacten in de gescande monsters; en (3) het weergeven van de groottestructuur van de macro-ongewervelde gemeenschappen. Naast het protocol omvat dit werk de kalibratieresultaten en somt het verschillende uitdagingen en aanbevelingen op om de procedure aan te passen aan macro-ongewervelde monsters en om verdere verbeteringen te overwegen. Over het algemeen ondersteunen de resultaten het gebruik van het gepresenteerde scansysteem voor de automatische meting van de lichaamsgrootte van riviermacro-ongewervelde dieren en suggereren ze dat de weergave van hun groottespectrum een waardevol hulpmiddel is voor de snelle biobeoordeling van zoetwaterecosystemen.
Introduction
Benthische macro-ongewervelde dieren worden op grote schaal gebruikt als bio-indicatoren om de ecologische toestand van waterlichamen te bepalen1. De meeste indices om macro-ongewervelde gemeenschappen te beschrijven, richten zich op taxonomische statistieken. Nieuwe biobeoordelingsinstrumenten die lichaamsgrootte integreren, worden echter aangemoedigd om een alternatief of complementair perspectief te bieden aan taxonomische benaderingen 2,3.
Lichaamsgrootte wordt beschouwd als een metatrait die gerelateerd is aan andere vitale eigenschappen zoals metabolisme, groei, ademhaling en beweging4. Bovendien kan de lichaamsgrootte de trofische positie en interacties bepalen5. De relatie tussen individuele lichaamsgrootte en de genormaliseerde biomassa (of abundantie) per grootteklasse in een gemeenschap wordt gedefinieerd als het groottespectrum6 en volgt het algemene patroon van een lineaire afname van genormaliseerde biomassa naarmate de individuele grootte toeneemt op een logaritmische schaal7. De helling van deze lineaire relatie is uitgebreid theoretisch bestudeerd en empirische studies in ecosystemen hebben het gebruikt als een ecologische indicator van de structuur van de gemeenschapsgrootte4. Een andere synthetische indicator van de gemeenschapsgroottestructuur die met succes is gebruikt in studies naar het functioneren van biodiversiteit en ecosysteem, is de diversiteit van de gemeenschapsgrootte, die wordt weergegeven als de Shannon-index van de grootteklassen van het groottespectrum of het analoge, die wordt berekend op basis van de individuele grootteverdelingen8.
In zoetwaterecosystemen wordt de groottestructuur van verschillende faunagroepen gebruikt als een ataxische indicator om de respons van biotische gemeenschappen op milieugradiënten 9,10,11 en op antropogene verstoringen 12,13,14,15,16 te beoordelen. Macro-ongewervelde dieren zijn geen uitzondering en hun groottestructuur reageert ook op veranderingen in het milieu17,18 en antropogene verstoringen, zoals mijnbouw19, landgebruik20 of stikstof (N) en fosfor (P) verrijking20,21,22. Het meten van honderden individuen om de structuur van de gemeenschapsgrootte te beschrijven, is echter een vervelende en tijdrovende taak die vaak wordt vermeden als een routinemeting in laboratoria vanwege een gebrek aan tijd. Zo zijn verschillende semi-automatische of automatische beeldvormingsmethoden ontwikkeld om monsters te classificeren en te meten 23,24,25,26. De meeste van deze methoden zijn echter meer gericht op taxonomische classificatie dan op de individuele grootte van de organismen en zijn niet klaar voor gebruik voor alle soorten macro-ongewervelde dieren. In de mariene planktonecologie is een scanbeeldanalysesysteem op grote schaal gebruikt om de grootte en taxonomische samenstelling van zoöplanktongemeenschappen te bepalen 27,28,29,30,31. Dit instrument is te vinden in verschillende mariene instituten over de hele wereld en wordt gebruikt om geconserveerde zoöplanktonmonsters te scannen om digitale beelden met hoge resolutie van het hele monster te verkrijgen. Het huidige protocol past het gebruik van dit instrument aan om het spectrum van de grootte van de macro-ongewervelde gemeenschap in rivieren op een snelle automatische manier te schatten zonder te investeren in het creëren van een nieuw apparaat.
Het protocol bestaat uit het scannen van een monster en het verwerken van de hele afbeelding om automatisch afzonderlijke afbeeldingen (d.w.z. vignetten) van de objecten in het voorbeeld te verkrijgen. Verschillende metingen van vorm, grootte en grijsniveau kenmerken elk object en maken de automatische classificatie van de objecten in categorieën mogelijk, die vervolgens door een expert worden gevalideerd. De individuele grootte van elk organisme wordt berekend met behulp van het ellipsoïdale biovolume (mm3), dat is afgeleid van het gebied van het organisme gemeten in pixels. Dit maakt het mogelijk om het groottespectrum van het monster op een snelle manier te verkrijgen. Voor zover we weten, is dit scanbeeldvormingssysteem alleen gebruikt om mesozoöplanktonmonsters te verwerken, maar het apparaat kan mogelijk werken met zoetwater benthische macro-ongewervelde dieren.
Het algemene doel van deze studie is dan ook om een methode te introduceren om snel de individuele grootte van geconserveerde riviermacro ongewervelde dieren te verkrijgen door een bestaand protocol aan te passen dat eerder werd gebruikt met marien mesozoöplankton 27,32,33. De procedure bestaat uit het gebruik van een semi-automatische aanpak die werkt met een scanapparaat om watermonsters te scannen en drie open software om de gescande afbeeldingen te verwerken. Een aangepast protocol om gedigitaliseerde riviermacro-ongewervelde dieren te scannen, detecteren en identificeren om automatisch de structuur van de gemeenschapsgrootte en gerelateerde groottestatistieken te verkrijgen, wordt hierin gepresenteerd. De beoordeling van de procedure en richtlijnen om de efficiëntie te verbeteren, wordt ook gepresenteerd op basis van 42 gescande afbeeldingen van riviermacro-ongewervelde monsters verzameld uit drie stroomgebieden op het noordoostelijke (NE) Iberisch schiereiland (Ter, Segre-Ebre en Besòs).
De monsters werden verzameld op 100 m riviertrajecten volgens het protocol voor veldbemonstering en laboratoriumanalyse van benthische riviermabrieren in doorwaadbare rivieren van de Spaanse regering34. De monsters werden verzameld met een surber sampler (frame: 0,3 m x 0,3 m, mesh: 250 μm) na een multi-habitat onderzoek. In het laboratorium werden de monsters gereinigd en gezeefd door een maas van 5 mm en een maas van 500 μm om twee submonsters te verkrijgen: een grove substeekproef (5 mm maas) en een fijne substeekproef (500 μm mesh), die werden opgeslagen in afzonderlijke injectieflacons en bewaard in 70% ethanol. Het scheiden van het monster in twee groottefracties zorgt voor een betere schatting van de structuur van de grootte van de gemeenschap, omdat grote organismen zeldzamer en minder zijn dan de kleine organismen. Anders heeft het gescande monster een bevooroordeelde weergave van de grote fractie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het hier beschreven protocol is gebaseerd op het systeem ontwikkeld door Gorsky et al.27 voor marien mesozoöplankton. Een specifieke beschrijving van de stappen van de scanner (ZooSCAN), scansoftware (VueScan 9x64 [9.5.09]), beeldverwerkingssoftware (Zooprocess, ImageJ) en automatische identificatiesoftware (Plankton Identifier) is te vinden in eerdere referenties32,33. Om de grootte van de benthische macro-ongewervelde dieren ten opzichte van het mesozooplankton het beste aan te passen, wijzigt u, zodra het project is gemaakt volgens het oorspronkelijke protocol 32,33, de parameter van de minimale grootte (minsizeesd_mm) in 0,3 mm en de parameter van de maximale grootte (maxsizeesd_mm) in 100 mm in het configuratiebestand. Om het protocol te helpen volgen, wordt dit samengevat in een werkdiagram (figuur 1). Het gemaakte project wordt opgeslagen in de map C van de computer en is geordend in de volgende mappen: PID_process, Zooscan_back, Zooscan_check, Zooscan_config, Zooscan_meta, Zooscan_results en Zooscan_scan. Elke map bestaat uit verschillende submappen die de verschillende softwaretoepassingen gebruiken in de volgende stappen van het protocol.
1. Verwerving van digitale beelden voor macro-ongewervelde monsters
- De lege ruimte scannen en verwerken
OPMERKING: Maak dagelijks twee lege afbeeldingen voordat u gaat scannen om de achtergrondscans te extraheren terwijl u de gescande afbeeldingen op dezelfde dag verwerkt.- Schakel de scanner in en schakel het licht in de dubbele positie in om wit licht van boven en van onderen te projecteren.
OPMERKING: Bij het scannen van mesozoöplanktonmonsters wordt de opwaartse lichtrichting gebruikt, maar omdat macro-ongewervelde dieren ondoorzichtiger zijn, wordt aanbevolen om het licht in een dubbele positie te schakelen. - Reinig en spoel de scanlade af met kraanwater.
- Giet 110 ml kraanwater dat bij kamertemperatuur (RT) is opgeslagen in de scanlade totdat het glas is afgedekt. Plaats het grote frame (24,5 cm x 15,8 cm) op de scanlade in de juiste positie (met de hoek linksboven in de scanlade) en vul het met kraanwater totdat de stap van het frame is bedekt om een meniscuseffect te voorkomen, waardoor de gescande afbeelding zou veranderen. Sluit het deksel van de scanner.
OPMERKING: Gebruik water bij RT om condensatie en bellenvorming te voorkomen. Reinig het frame zonder vlekken of druppels om lichtreflectie te voorkomen. - Ga naar de beeldverwerkingssoftware, selecteer het werkproject en klik op Achtergrondafbeelding scannen (converteren).
- Ga naar de scansoftware en klik op Preview. Zorg ervoor dat u een voorbeeld van de gescande afbeelding bekijkt, controleer of er geen lijnen of vlekken zijn en wacht ten minste 30 s voordat u een nieuwe scan start. Klik op Scannen en druk op OK in het instructievenster vóór de tweede scan om de gegevens van de scansoftware naar de beeldverwerkingssoftware te verzenden.
OPMERKING: Scan twee keer om de twee achtergrondscans te verkrijgen waaruit de lege scan bestaat. Deze stap wordt eenmaal per dag uitgevoerd voordat de voorbeeldverwerking wordt gestart en de afbeeldingen worden opgeslagen in de map Zooscan_back. - Sluit de scansoftware nadat u de scan hebt voltooid.
- Schakel de scanner in en schakel het licht in de dubbele positie in om wit licht van boven en van onderen te projecteren.
- Monstervoorbereiding en scannen
LET OP: Ethanol is een brandbare vloeistof en kan ernstige oogbeschadiging/irritatie veroorzaken.- Vul de voorbeeldmetagegevens in. Ga naar de beeldverwerkingssoftware en selecteer Voorbeeldmetagegevens invullen. Voer de voorbeeldidentiteit in, klik op OK en vul de metagegevens in.
OPMERKING: Het metabestand is specifiek gemaakt voor mesozoöplanktonmonsters, dus het past niet in de benthische macro-ongewervelde bemonsteringsmethodologie, maar alle velden van het bestand moeten vóór de scan worden ingevuld, anders verschijnt er een foutvlag. - Giet 110 ml 70% ethanol in de scanlade totdat het glas is afgedekt en plaats het grote frame (24,5 cm x 15,8 cm) met de hoek linksboven in de scanlade.
OPMERKING: Werk met ethanol in plaats van water, omdat de macro-ongewervelde dieren worden bewaard in ethanol. In water drijven ze en drijven ze in de scanlade, waardoor een scherp beeld en dus betrouwbare maatmetingen worden voorkomen. Ethanol moet bij RT worden bewaard om condensatie en bubbelvorming te voorkomen. - Giet het monster van de macro-ongewervelde dieren in de scanlade met de randen van het frame en bedek de framestap indien nodig met meer ethanol.
OPMERKING: Voeg niet te veel ethanol toe om te voorkomen dat de organismen drijven en drijven. - Homogeniseer het monster in het hele framegebied, plaats de grootste individuen in het midden van de lade voor een goede beeldverwerking en laat de zwevende organismen zinken met een houten naald.
OPMERKING: Als een substeekproef numeriek meer dan 1.000 personen bevat, verdeelt u de substeekproef in twee of meer fracties om het aanraken van organismen in de gescande afbeelding te minimaliseren en scant u de fracties afzonderlijk. - Scheid de aanrakende organismen en de organismen die de frameranden aanraken met behulp van de houten naald.
OPMERKING: Deze stap vereist 5-20 minuten. Aanrakende organismen worden door de software als een enkel object beschouwd; in die gevallen komen de berekende individuele grootten dus niet overeen met werkelijke afzonderlijke organismen en kunnen ze de schatting van de structuur van de gemeenschapsgrootte vertekenen. Er is de mogelijkheid om de afbeelding te bewerken met de beeldverwerkingssoftware om ze te scheiden, maar deze extra stap omvat ten minste 1,5 uur herverwerking; handmatige scheiding wordt dus ten zeerste aanbevolen. - Om het monster te scannen, sluit u het scannerdeksel, gaat u naar de beeldverwerkingssoftware, selecteert u het werkproject en klikt u op SCAN Sample met Zooscan (For Archive, No Process).
- Selecteer het voorbeeld en volg de instructies.
- Ga naar de scansoftware en klik op Preview. Zorg ervoor dat u een voorbeeld van de gescande afbeelding bekijkt, controleer of er geen lijnen of vlekken zijn en wacht ten minste 30 s voordat u een nieuwe scan start.
- Klik na ten minste 30 s op de knop Scannen in de scansoftware.
OPMERKING: Druk op OK in de beeldverwerkingssoftware nadat u in de scansoftware op Scannen hebt gedrukt. Druk niet op een toets op het toetsenbord van de computer en vermijd trillingen van de scan tijdens het scannen. Drie bestanden worden gegenereerd in de map Zooscan_scan > _raw : (i) een gelabelde afbeeldingsbestandsindeling (.tif) (16-bits); ii) een standaardtekstdocument met de naam LOG (.txt) waarin informatie over de scanparameters wordt vastgelegd; en iii) een standaardtekstdocument met de naam META (.txt) met informatie over de bemonsteringsmethoden. - Controleer of de onbewerkte scan correct is.
OPMERKING: Als de scan lichtstrepen of andere zichtbare problemen heeft, kunt u overwegen de scan te herhalen om problemen in de volgende stappen te voorkomen.
- Vul de voorbeeldmetagegevens in. Ga naar de beeldverwerkingssoftware en selecteer Voorbeeldmetagegevens invullen. Voer de voorbeeldidentiteit in, klik op OK en vul de metagegevens in.
- Voorbeeld herstel
- Verwijder het frame en spoel het boven de scanlade met een knijpfles gevuld met 70% ethanol om eventuele aangesloten macro-ongewervelde dieren te herstellen.
- Til het bovenste deel van de scanner op om alle organismen en ethanol uit de lade te halen door de scantrechter in een bekerglas. Terwijl het bovenste deel van de scanner nog steeds is opgetild, spoelt u de lade af met de knijpfles om eventuele resterende organismen te vegen.
- Laat de monsters en ethanol van het bekerglas door een maas van 500 μm lopen om de ongewervelde dieren in het gaas te houden en bewaar ze terug in een injectieflacon met 70% ethanol.
- Zodra alle monsters in de injectieflacon zijn teruggevonden, reinigt u de lade met kraanwater.
OPMERKING: Was de lade met kraanwater tussen de monsters om de neerslag van ethanol te minimaliseren, wat de beeldverwerking verandert. Spoel het frame af met leidingwater om mogelijke schade in verband met het gebruik van ethanol te voorkomen. Maak aan het einde van de dag de lade schoon met kraanwater en droog deze voorzichtig met papier om krassen te voorkomen.
- Beeldverwerking
- Ga naar de beeldverwerkingssoftware en selecteer CONVERT &PROCESS Images and Organisms in Batch Mode en vervolgens Convert AND Process Image AND Particles (Image in RAW Folder). Behoud de standaardinstellingen en klik op OK. NORMAL END verschijnt aan het einde van het proces.
OPMERKING: Een PID-bestand en de vignetten die overeenkomen met alle gedetecteerde objecten in de gescande afbeelding (in een Joint Photographic Group-bestand [.jpg]) worden gemaakt in de map Zooscan_scan > _work. Een PID-bestand is een enkel bestand dat alle metagegevens (metabestand), de technische gegevens die aan het logboekbestand zijn gekoppeld en een tabel met 36 gemeten variabelen van alle objecten die in de afbeelding zijn gedetecteerd, opslaat. De gemeten variabelen komen overeen met verschillende schattingen van grijsniveau, fractaldimensie, vorm en grootte. De variabelen die kunnen worden gebruikt voor het schatten van de grootte zijn de oppervlakte en de grote en kleine assen van een ellips met een gelijk gebied aan het object (zie paragraaf 3 van het protocol). De verwerkingstijd is afhankelijk van de beelddichtheid en de computerkenmerken en kan tussen monsters worden gestart tijdens het herstellen en voorbereiden van het volgende monster. Anders wordt aanbevolen om de verwerking van de monsters die elke dag in batchmodus worden gescand 's nachts te starten en de volgende ochtend te controleren op de juiste beeldverwerking. - Controleer of de achtergrond in de verwerkte afbeelding op de juiste manier wordt afgetrokken van de voorbeeldafbeelding met behulp van de beeldverwerkingssoftware of door de maskerafbeeldingen (beëindigd in msk1.gif) in Zooscan_scan > _work te controleren. Als de achtergrond verzadigde gebieden of veel stippen bevat, kunt u overwegen de scan te herhalen om afbeeldingen van hoge kwaliteit te garanderen.
OPMERKING: Om verzadigde gebieden op de achtergrond te vermijden, moet de scanlade na elke scan met ethanol worden gespoeld met kraanwater. Het is ook belangrijk om (1) het aantal gescande personen te verminderen (door het monster te fractioneren en in verschillende plooien te scannen); (2) ervoor zorgen dat grote organismen in het midden van de scanlade worden geplaatst; (3) schone, gefilterde ethanol gebruiken; (4) vuilheid op de monsters te verminderen; (5) ervoor te zorgen dat het volume ethanol voor het scannen toereikend is; en (6) ervoor zorgen dat de vertraging tussen het voorbeeld van het monster en de scan ten minste 30 s bedraagt.
- Ga naar de beeldverwerkingssoftware en selecteer CONVERT &PROCESS Images and Organisms in Batch Mode en vervolgens Convert AND Process Image AND Particles (Image in RAW Folder). Behoud de standaardinstellingen en klik op OK. NORMAL END verschijnt aan het einde van het proces.
- Scheiding van aanrakende organismen
OPMERKING: Wanneer er meerdere vignetten met aanrakende organismen zijn, is het noodzakelijk om de beelden van de aanrakende organismen te scheiden van andere organismen en / of van vezels / puin om een goede schatting van de gemeenschapsgroottestructuur te garanderen.- Ga naar de beeldverwerkingssoftware om de vignetten met meerdere objecten te detecteren. Selecteer SCHEIDING met vignetten en druk op OK. Houd in het configuratieselectievenster de standaardinstellingen aan en klik op OK.
- Behoud in het venster SCHEIDING van VIGNETTEN de standaardinstellingen, selecteer bovendien Contouren toevoegen aan vignetten en selecteer vervolgens het voorbeeld dat u wilt bewerken.
- Scheid de aanrakende organismen in elk vignet dat opduikt door een lijn te tekenen met de muis (druk op de rolknop om te tekenen). Zodra de scheiding in een vignet is voltooid, klikt u op de X-knop in de rechterbovenhoek van het venster en drukt u op JA om de volgende te verwerken. Druk op NEE om de wijzigingen te beëindigen en op te slaan. Aan het einde van het proces verschijnt NORMAL END als alles correct is.
- Na de scheiding wordt de afbeelding opnieuw verwerkt om de bijgewerkte objectgegevens te verkrijgen. Ga naar de beeldverwerkingssoftware, klik op PROCESS (Geconverteerd) Image (Process One) en selecteer Process Again Particles from Processed Images in WORK Sub-Folders. Selecteer het voorbeeld en bewaar in het venster Single Image Process de standaardinstellingen, vink Werk met scheidingsmasker (CREATE-MODIFY-INCLUDE) aan en klik vervolgens op OK. Aan het einde van het proces verschijnt NORMAL END als alles correct is.
- Druk in het venster Scheidingsbesturingselement op OK om de afbeelding met de contouren op te slaan vóór de verwerking. als er een eerdere afbeelding bestaat, wordt deze vervangen.
- Selecteer indien nodig bewerken in het venster Scheidingsbeheermasker om met de muis scheidingslijnen aan het masker toe te voegen om aanrakende organismen te scheiden die nog niet eerder in de stap scheiding zijn verschenen met behulp van vignetten. Wanneer u klaar bent, beëindigt u het proces en selecteert u in het venster Scheidingsmaskerbeheer JA om het masker te accepteren. Aan het einde van het proces verschijnt NORMAL END als alles correct is.
OPMERKING: Het opnieuw verwerken van een monster met een scheidingsmasker is tijdrovend (dit kan meer dan 1,5 uur per monster duren). Het verdient de voorkeur om de vereiste tijd in stap 1.2.5 te besteden om deze extra stap te voorkomen.
2. Automatische herkenning van de objecten
OPMERKING: Maak een leerset om automatisch de identiteit van de gedetecteerde objecten te voorspellen, waardoor de organismen worden gescheiden van het puin in het monster.
- Het maken van leersets
- Kopieer de afbeeldingen en de PID-bestanden die zijn gekoppeld aan de afbeeldingen die worden gebruikt om de categorieën van de leerset te maken van Zooscan_scan > _work naar PID_process > Unsorted_vignettes_pid.
OPMERKING: Selecteer een subset van monsters met een hoge taxadiversiteit en verschillende bemonsteringslocaties en/of bemonsteringsseizoenen om een maximale representativiteit van de organismen in de monsters te garanderen. - Maak in de map PID_process > Learning-set een submap met de naam van de nieuwe leerset (d.w.z. yyyymmdd_raw_LS) en maak daarin de submappen die overeenkomen met elke categorie van de leerset (d.w.z. macro-ongewervelde dieren, puin, andere ongewervelde dieren).
OPMERKING: Om efficiënt de gemeenschapsgroottestructuur van riviermacro-ongewervelde monsters te verkrijgen, wordt het aanbevolen om een leerset te gebruiken op basis van slechts drie categorieën: macro-ongewervelde dieren, andere ongewervelde dieren en puin. Deze leerset scheidt in feite de vignetten van objecten die overeenkomen met organismen van die welke overeenkomen met puin (bijv. Vezels, deeltjes of draadalgen). - Ga naar de beeldverwerkingssoftware (alleen geavanceerde modus) en kies EXTRACT-vignetten voor PLANKTON IDENTIFIER (ongesorteerde vignetten voor training). Behoud de standaardopties en schakel het selectievakje Contouren toevoegen in .
- Ga naar de automatische identificatiesoftware, klik op Leren, selecteer uit PID_process > Learning_set de gemaakte submap voor de nieuwe leerset (stap 2.1.2) en druk op OK.
- Selecteer in het linkergedeelte (Ongesorteerde duimen) van het geopende venster de map Ongesorteerde vignettes_pid. Selecteer de vignetten en sleep ze met de muis van de ongesorteerde duimen naar de map van de bijbehorende categorie in de rechtersectie, Gesorteerde duimen, om elk object in de gedefinieerde categorieën in te delen. De verplaatste vignetten worden gemarkeerd met een rode X.
OPMERKING: Definieer de categorieën handmatig door submappen te maken in de map met gesorteerde duimen of maak ze door op het mappenpictogram in de software te klikken. Verplaats niet meer dan 50 vignetten tegelijk. - Zodra alle categorieën zijn voltooid met de geselecteerde objecten (ongeveer 300 objecten per categorie), klikt u op Leerbestand maken en slaat u het op met de gewenste naam.
OPMERKING: De leerset wordt opgeslagen als een .pid-bestand in de map PID_process > Learning-set van het project. Het wordt aanbevolen om verschillende leersets te maken en te testen met verschillende niveaus van categorieën (van grove tot fijne vormen) en met een verschillende balans van het aantal objecten binnen elke categorie. Begin met een grove leerset met een laag aantal categorieën en minstens 50 objecten per categorie, en verhoog vervolgens het aantal objecten in elke categorie en/of maak fijnere leersets. Een categorie moet representatief zijn voor de variabiliteit ervan in de reeks monsters.
- Kopieer de afbeeldingen en de PID-bestanden die zijn gekoppeld aan de afbeeldingen die worden gebruikt om de categorieën van de leerset te maken van Zooscan_scan > _work naar PID_process > Unsorted_vignettes_pid.
- Evaluatie van de leerset
OPMERKING: Voer kruisvalidatie uit met twee vouwen en vijf onderzoeken met behulp van de Random Forest-methode met de automatische identificatiesoftware om een verwarringsmatrix van de resulterende classificatie van de objecten te verkrijgen.- Ga naar de automatische classificatiesoftware en klik op Data-analyse.
- Selecteer in Leerbestand selecteren het gemaakte leersetbestand in PID_process > Learning-set.
- Kies in Selecteer een methode de methode Random Forest voor kruisvalidatie . Schakel in Oorspronkelijke variabelen de positievariabelen (X, Y, XM, YM, BX, BY en Height) uit. Vink in Aangepaste variabelen alleen ESD aan.
OPMERKING: Deze methode gebruikt een willekeurig deel van de leerset om het andere deel te herkennen (twee vouwen), en dit wordt vijf keer herhaald om ervoor te zorgen dat het statistisch robuust is. - Klik op Analyse starten en sla de resultaten op zoals Analysis_name.txt in de map PID_process > Voorspelling. Wanneer de analyse met succes is voltooid, sluit u de gegevensanalyse af.
- Ga naar de map PID_process > Voorspelling en klik op het kruisvalidatiebestand. Er verschijnt een venster met de verwarringsmatrix van de ware classificatie (rijen) versus de automatische classificatie (kolommen).
OPMERKING: De terugroepactie is het percentage organismen dat tot een groep behoort dat automatisch goed werd herkend, terwijl 1-precisie het percentage organismen is dat door het algoritme is geclassificeerd als een groep die niet wordt herkend (besmetting in een groep). De terugroepactie moet hoger zijn dan 70% en de verontreiniging (1-precisie) moet lager zijn dan 20%. - Herhaal stap 2.1-2.5 als er meerdere leersets zijn gemaakt en de terugroepactie en 1-precisie van elke set moeten worden verkregen.
OPMERKING: Als er meerdere leersets zijn gemaakt, kies dan degene met de grootste herinnering (goede herkenning) en precisie (lage verontreiniging) van de groep van belang (d.w.z. macro-ongewervelde dieren) om de automatische voorspelling van een reeks monsters in de volgende stap te testen.
- Voorspelling van de identificatie van macro-ongewervelde dieren
OPMERKING: Gebruik de geselecteerde leerset om de identiteit van alle objecten in een subset van voorbeelden te voorspellen met behulp van de automatische identificatiesoftware met een willekeurig forestalgoritme.- Ga naar de automatische identificatiesoftware en klik op Data-analyse.
- Selecteer in Leerbestand selecteren het leersetbestand uit PID_process > Learning-set die moet worden gebruikt voor de voorspelling.
- Selecteer in Voorbeeldbestand(en) selecteren uit de map PID_results de voorbeelden (PID-bestanden) die worden voorspeld.
OPMERKING: Verwerk maximaal 20 .pid-bestanden tegelijkertijd om fouten met betrekking tot geheugenproblemen te voorkomen. Als er te veel .pid-bestanden tegelijkertijd worden verwerkt, wordt het proces correct weergegeven, maar wordt het mogelijk niet goed verwerkt en kan er een fout optreden in de volgende stappen bij het verwerken met de beeldverwerkingssoftware. - Kies in Selecteer een methode de methode Willekeurig forest . Schakel het selectievakje Gedetailleerde resultaten opslaan voor elk voorbeeld in. Schakel in Oorspronkelijke variabelen het selectievakje uit de positievariabelen (X, Y, XM, YM, BX, BY en Height). Vink in Aangepaste variabelen alleen ESD aan.
- Klik op Analyse starten en sla de resultaten op zoals Analysis_name.txt in de map PID_process > Voorspelling.
- Handmatige validatie
OPMERKING: Een expert valideert handmatig de voorspelling uit de vorige stap om verkeerd geclassificeerde objecten opnieuw te classificeren in de juiste categorie.- Kopieer de Analysis_sample_dat1.txt bestanden die moeten worden gevalideerd vanuit de map PID_process > Prediction naar de map PID_process > Pid_results.
- Ga naar de beeldverwerkingssoftware en selecteer EXTRACT Vignetten in mappen volgens VOORSPELLING of VALIDATIE. Selecteer vervolgens Predicted-bestanden gebruiken uit de map "pid_results". Behoud de standaardinstellingen en druk op OK.
- De software maakt een map genaamd sample_yyyymmdd_hhmm_to_validate met de voorspelde objecten in de map PID_process > gesorteerde vignetten.
- Ga naar de map PID_process > gesorteerde vignetten en kopieer de map sample_yyyymmdd_ hhmm_to_validate. Vervang de mapnaam _to valideren door _validated.
- Als u de automatische classificatie handmatig wilt valideren, opent u de map sample_yyyymmdd_ hhmm_validated en bekijkt u alle vignetten van elke submap (categorie) om te bepalen of er verkeerd geclassificeerde objecten zijn. Wanneer een object verkeerd is geclassificeerd, sleept u het vignet met de muis naar de juiste map (categorie).
- Ga naar de beeldverwerkingssoftware en selecteer LOAD Identifications uit Gesorteerde vignetten. Behoud de standaardinstellingen en selecteer yyyymmdd_hhmm_name_validated die moeten worden verwerkt.
- Ga naar PID_process > Pid_results > Dat1_validated, waar een bestand met de naam Id_from_sorted_vignettes_yyyymmdd_hhmm.txt en een .txt-bestand voor elk van de gevalideerde voorbeelden (sample_tot_1_dat1.txt) zijn gemaakt.
OPMERKING: Deze .txt bestanden bevatten een nieuwe kolom die de voorspelling presenteert, genaamd pred_valid_Id_yyyymmdd_hhmm, die de expertclassificatie van elk object specificeert (d.w.z. de gevalideerde classificatie). Nieuwe categorieën (bijv. fijnere taxonomische categorieën) kunnen op dit punt, tijdens de validatie, worden gemaakt. Bewaar echter de naam van de oorspronkelijke categorie in de nieuwe naam (bijvoorbeeld macroinvertebrate_chironomidae). Dit maakt het mogelijk om de oorspronkelijke categorie te traceren bij het berekenen van de terugroepactie en precisie en om eenvoudig alle macro-ongewervelde dieren te groeperen om de parameters van de gemeenschapsgroottestructuur te berekenen (d.w.z. het groottespectrum en de groottediversiteit). Het tekstbestand bevat de gegevens die aan elk object zijn gekoppeld, inclusief de kleine en grote assen die worden gebruikt om het ellipsoïdale volume van elk organisme te verkrijgen als een maat voor de individuele lichaamsgrootte. Bovendien bevatten de laatste twee kolommen van de tabel de voorspelde en gevalideerde categorieën van elk object (rij), waarmee per categorie de terugroeping en precisie van de leerverzameling op de subset van monsters kan worden berekend.
Figuur 1: Werkdiagram dat sectie 1 en sectie 2 van het protocol vertegenwoordigt. De tijden zijn illustratief en kunnen veranderen afhankelijk van de computer, de overvloed aan te verwerken vignetten en het aantal categorieën van de leerset. Dit geval komt overeen met de validatie van een leerset van drie categorieën op een set van 42 subsamples (in totaal 47.473 vignetten). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Het berekenen van de individuele grootteverdeling, groottespectra en maatstaven
OPMERKING: De berekeningen die in deze sectie worden genoemd, zijn uitgevoerd met Behulp van Matlab (zie script als Aanvullend bestand 1).
- Individuele maatverdeling
- De laatste kolom van het Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt bestand bevat de gevalideerde classificatie van de objecten. Selecteer alleen de objecten die zijn geclassificeerd als macro-ongewervelde dieren om hun individuele grootteverdeling in de steekproef weer te geven.
OPMERKING: Individuele lichaamsgrootte komt overeen met het ellipsoïdale volume van de macro-ongewervelde organismen. Het systeem biedt metingen in pixels. - Voeg de vectoren samen met de groottemetingen van beide scans, omdat elke fractie een andere subsampling exponent heeft. Corrigeer vóór de aaneenschakeling voor de fractionering door de groottevectoren net zo vaak te repliceren als de overeenkomstige substeekproef is gefractioneerd.
OPMERKING: Deze stap is nodig als een scan overeenkomt met een fractie van een monster (d.w.z. grof of fijn). - Bereken het ellipsoïdale volume van de grote (M) en kleine (m) assen van prolaatellipsoïden met dezelfde pixelgebieden als de organismen. Voordat u het ellipsoïdale volume berekent, converteert u de grote (M) en kleine (m) assen van pixels naar millimeters (mm) met de volgende conversiefactor (cf):
1 pixel = 2.400 dpi
1 inch = 25,4 mm
cf = 25,4/2400
Het ellipsoïdale volume (ellipVol met eenheden in mm3) komt overeen met:
- Geef de kansdichtheidsfunctie van de individuele grootteverdeling op de log2-schaal weer.
- De laatste kolom van het Id_from_sorted_vignettes_YYYYMMDD_HHHH.txt bestand bevat de gevalideerde classificatie van de objecten. Selecteer alleen de objecten die zijn geclassificeerd als macro-ongewervelde dieren om hun individuele grootteverdeling in de steekproef weer te geven.
- Diversiteit in grootte
- Bereken de groottediversiteit (Sd) volgens Quintana et al. (2008)8, zoals in García-Comas et al. (2016)35:
waarbij px(x) de kansdichtheidsfunctie van grootte x is en x log2 (ellipVol) vertegenwoordigt. Deze maat is dus de Shannon diversiteitsindex aangepast aan een continue meting, zoals de individuele grootteverdeling in een gemeenschap.
- Bereken de groottediversiteit (Sd) volgens Quintana et al. (2008)8, zoals in García-Comas et al. (2016)35:
- Genormaliseerd biovolume grootte spectrum (NBSS)
- Definieer de grootteklassen van het NBSS, stel de ondergrens van het spectrum vast als het 0,01 kwantiel van de macro-ongewervelde grootteverdeling in de monsters en creëer grootteklassen met een geometrische schaal van base 2 totdat het grootste organisme in de monsters is opgenomen.
OPMERKING: De breedte van de grootteklasse neemt toe met de grootte om rekening te houden met de grotere variabiliteit die gepaard gaat met grotere maten. De NBSS van de hier geanalyseerde macro-ongewervelde gemeenschappen had 14 grootteklassen (tabel 1). - Verkrijg het genormaliseerde biovolume door het totale biovolume in elke grootteklasse te delen door de breedte van de grootteklasse.
- Definieer de grootteklassen van het NBSS, stel de ondergrens van het spectrum vast als het 0,01 kwantiel van de macro-ongewervelde grootteverdeling in de monsters en creëer grootteklassen met een geometrische schaal van base 2 totdat het grootste organisme in de monsters is opgenomen.
- Grootte spectrum helling
- Bereken de lineaire helling van de NBSS.
OPMERKING: De helling (μ) wordt berekend op basis van de relatie tussen log2 (grootteklasse middenpunt) en de log2 (genormaliseerde biomassa) in de grootteklassen groter dan de modus, waarbij lege waarden (in deze studie de grootteklassen van 3 tot 14) worden genegeerd.
- Bereken de lineaire helling van de NBSS.
| Limieten voor grootteklassen (mm3) | Grootteklasse middenpunt (mm3) |
| 0,1236 | 0,1855 |
| 0,2473 | 0,3709 |
| 0,4946 | 0,7418 |
| 0,9891 | 1,4837 |
| 1,9783 | 1,4837 |
| 3,9560 | 5,9348 |
| 7,9131 | 11,8696 |
| 15,8261 | 23,7392 |
| 31,6522 | 47,4783 |
| 63,3044 | 94,9567 |
| 126,6089 | 189,9133 |
| 253,2178 | 379,8267 |
| 506,4300 | 7597,7000 |
| 1012,9000 | 15193,0000 |
| 2025,7000 |
Tabel 1: Grootteklassen van het genormaliseerde biomassagroottespectrum (NBSS). De tabel toont ook de limieten van 15 grootteklassen en de grootteklasse middenpunten van de organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verwerving van digitale beelden van macro-ongewervelde monsters
Scannuances: Ethanolafzetting in de scanlade
Tijdens het testen van het systeem op macro-ongewervelde dieren waren verschillende scans van slechte kwaliteit. Een donker verzadigd gebied op de achtergrond verhinderde een normale verwerking van het beeld en de meting van de individuele groottes van de macro-ongewervelde dieren (figuur 2). Er zijn verschillende redenen gegeven voor het verschijnen van verzadigde gebieden op de achtergrond of sterk gepixelde afbeeldingen: (1) de aanwezigheid van te veel organismen op de scanlade; 2) de aanwezigheid van vuiligheid in de monsters; (3) een onvoldoende vertraging tussen het voorbeeld van het monster en de scan ervan; of (4) bij de beeldverwerking een achtergrondafbeelding van slechte kwaliteit gebruiken vanwege condensatie, vuilheid of slechte waterkwaliteit33. In macro-ongewervelde gemeenschapsmonsters veroorzaakt het gebruik van ethanol in plaats van water neerslag op de tray, die een donkere schaduw vormt als deze niet goed wordt gespoeld met water tussen de scans door. Dit is van vitaal belang om scherpe beelden te verkrijgen en om eventuele gerelateerde corrosie van het glas van de scanlade te minimaliseren.
Scannuances: puinconcentratie
Uit de analyse van een subset van 47.473 vignetten kwam een hoog percentage (86,1%) overeen met puin, waaronder afval, vezels of lichaamsdelen (zoals benen of kieuwen), of scanartefacten (figuur 3A-E). Ongewervelde organismen kwamen overeen met de resterende 13,9% van de gedetecteerde objecten (figuur 3F-L). Dus ondanks de eerdere zorgvuldige scheiding van organismen van organisch materiaal in het laboratorium, bleef er nog steeds veel klein puin in de injectieflacon achter.
Nuances scannen: objecten aanraken
De significante aanwezigheid van puin verbetert het aanraken tussen organismen, en daarom het creëren van vignetten met aggregaten die meerdere aanrakende organismen en organismen bevatten die aan deeltjes of vezels zijn bevestigd (figuur 4A-C). Deze vignetten zijn een bron van vertekening bij het bepalen van de vorm van de individuele groottestructuur. In een set van vijf monsters (11 submonsters), van alle vignetten met macro-ongewervelde dieren, kwam 10% overeen met groepen met aanrakende organismen of organismen die deeltjes of vezels aanraken. Die vignetten werden bewerkt met het beeldverwerkingsprogramma om de aanrakende organismen en de organismen met deeltjes eraan te scheiden. Het opnieuw verwerken van de monsters met het scheidingsmasker omvatte het creëren van nieuwe vignetten met de nieuw gescheiden objecten, die werden gevalideerd om hun juiste classificatie te garanderen.
Automatische herkenning van de objecten
Resultaten van de leerset
Een leerset is een reeks vignetten van objecten die door een expert in verschillende categorieën zijn ingedeeld en worden gebruikt in een begeleid leermodel, en dit kan ook een trainingsset27 worden genoemd. Het is mogelijk om met een bestaande leerset te werken, de bestaande leerset bij te werken met nieuwe vignetten en/of categorieën, of een nieuwe leerset te maken voor een specifiek project.
Om de beste leerset te bepalen om snel de macro-ongewervelde groottestructuur te verkrijgen, werden verschillende leersets gemaakt en getest door middel van kruisvalidatie met het Random Forest-algoritme. De resulterende verwarringsmatrix toont de ware classificatie (rijen) versus de automatische classificatie (kolommen). De terugroepactie is het percentage organismen dat tot een categorie behoort dat automatisch goed is ingedeeld, terwijl de 1-precisie het percentage organismen is dat door het algoritme verkeerd is geclassificeerd als behorend tot een categorie (besmetting in een categorie)33. Als vuistregel geldt dat de terugroepactie hoger moet zijn dan 70% en de contaminatie (1-precisie) lager moet zijn dan 20% om een categorie in de leerset te houden. De leerset met de grootste recall en precisie voor macro-ongewervelde dieren wordt vervolgens verder gevalideerd met een subset van monsters om de werkelijke nauwkeurigheid in macro-ongewervelde identificatie te bepalen.
Drie soorten ataxische leersets (ruw, intermediair en fijn) met categorieën op basis van de morfologische kenmerken van de objecten werden getest. De ruwe leerset omvatte drie categorieën: macro-ongewervelde dieren, andere ongewervelde dieren (microschaaldieren) en puin (vezels, deeltjes en artefacten zoals glasbeitsen). De intermediaire leerset omvatte 16 categorieën: 5 voor macro-ongewervelde dieren, 3 voor andere ongewervelde dieren en 8 voor puin. De fijne leerset omvatte nog 4 categorieën macro-ongewervelde dieren, met in totaal 20 categorieën (tabel 2).
Naast het definiëren van de categorieën is ook het effect van het aantal vignetten per categorie getest. Elke leerset werd afzonderlijk getest met behulp van 50 vignetten, 100 vignetten en 300 vignetten in elke categorie (en 500 vignetten voor de onbewerkte leerset met drie categorieën). Alle categorieën waren in aantal gebalanceerd, behalve "Ostracoda", "lange ronde macro-ongewervelde dieren" en "ronde schaal macro-ongewervelde dieren", die minder individuen in de 100 vignet- en 300 vignetleersets omvatten omdat niet genoeg organismen van deze categorieën werden gedetecteerd in de gescande afbeeldingen.
De recall en precisie voor macro-ongewervelde dieren (alle macro-bij-wervelcategorieën samen) en organismen (de macro-ongewervelde en andere ongewervelde categorieën samen) werden beschouwd als de selectie van de beste leerset door kruisvalidatie (zie de tabellen in aanvullend dossier 2). De beste leerset was de ruwe leerset met drie categorieën (macro-ongewervelde dieren, andere ongewervelde dieren en puin), met 300 objecten in elke categorie (tabel 2). De raw learning set werd vervolgens gebruikt om de automatische classificatie van de objecten in de subset van gescande samples te valideren.
| Leerset | Aantal categorieën | Afbeeldingen per categorie | Terugroep organismen | Terugroepen van ongewervelde macro-dieren | 1-precisie organismen | Macro-ongewervelde dieren met 1 precisie |
| Rauw | 3 | 50 | 0.97 | 0.84 | 0.12 | 0.24 |
| 100 | 0.96 | 0.87 | 0.06 | 0.17 | ||
| 300 | 0.95 | 0.91 | 0.09 | 0.15 | ||
| 500 | 0.93 | 0.88 | 0.13 | 0.2 | ||
| Gemiddeld | 16 | 50 | 0.83 | 0.77 | 0.17 | 0.24 |
| 100 | 0.84 | 0.79 | 0.15 | 0.21 | ||
| 300 | 0.87 | 0.84 | 0.14 | 0.18 | ||
| Boete | 20 | 50 | 0.89 | 0.86 | 0.14 | 0.18 |
| 100 | 0.9 | 0.87 | 0.11 | 0.14 | ||
| 300 | 0.9 | 0.86 | 0.13 | 0.14 |
Tabel 2: Leersets gemaakt en getest (onbewerkt, gemiddeld en fijn) met de categorieën binnen elke categorie en het aantal objecten per categorie. Recall en 1-precisie van de gemaakte leersets. Categorieën van de Raw-leerset: Macro-ongewervelde dieren (1), Andere ongewervelde dieren (2), Puin (3). Categorieën van de Medium learning set: Lange macro ongewervelde dieren (1), Lange gladde macro-ongewervelde dieren (2), Lange stekelige macro-ongewervelde dieren (3), Ronde macro-ongewervelde dieren (4), Ronde schaal macro-ongewervelde dieren (5), Cladocera (6), Roeipootkreeftjes (7), Ostracoda (8), Aggregaten (9), Vezels (10), Hoofden (11), Benen (12), Vlekken (13), Donkere vlekken (14), Lichtgrijze vlekken (15), Ronde vlekken (16). categorieën van de fijne leerset: Lange macro-ongewervelde dieren (1), Lange gladde macro-ongewervelde dieren (2), Lange gladde donkere macro-ongewervelde dieren (3), Lange ronde macro-ongewervelde dieren (4), Lange stekelige macro-ongewervelde dieren (5), Ronde macro-ongewervelde macro-dieren (6), Macro-ongewervelde dieren met ronde schaal (7), Ronde donkere macro-ongewervelde dieren (8), Macro-ongewervelde omhulsels (9), Cladocera (10), Copepoda (11), Ostracoda (12), Aggregaten (13), Vezels (14), Hoofden (15), Benen (16), Vlekken (17), Donkere vlekken (18), lichtgrijze vlekken (19), Ronde vlekken (20).
Validatie van automatische herkenning met de beste leerset
De objecten in een subset van 42 fijne en grove subsamples werden automatisch geclassificeerd door de geselecteerde leerset met het Random Forest-algoritme. Na handmatige validatie was de terugroepactie voor alle categorieën hoog (gemiddeld 0,94 voor macro-ongewervelde dieren, 0,95 voor andere ongewervelde dieren en 0,92 voor puin), terwijl de verontreiniging (1-precisie) vrij laag was, behalve voor andere ongewervelde dieren (0,25 voor macro-ongewervelde dieren, 0,84 voor andere macro-ongewervelde dieren en 0,01 voor puin) (figuur 5 ). Andere ongewervelde dieren (microschaaldieren) waren zeldzaam in de monsters (aanwezig in 17 van de 42 submonsters); de vergelijking was dus niet robuust. Bovendien werd deze categorie sterk beïnvloed door de verontreiniging vanwege de gelijkenis in vorm en grijsniveaus met andere objecten.
De vergelijking van automatische versus gevalideerde macro-ongewervelde abundantie toonde aan dat deze sterk gecorreleerd waren (Pearson's r = 0,92, p-waarde < 0,0001, n = 24 voor grove subsamples; Pearson's r = 0,98, p-waarde < 0,0001, n = 18 voor fijne submonsters), met een lichte overschatting door de automatische prestaties als gevolg van verontreiniging door puin (hellingen < 1) (figuur 6). Met betrekking tot de vergelijking van het gemiddelde ellipsoïdale volume was de correlatie ook hoog (Pearson's r = 0,96, p-waarde < 0,0001, n = 24 voor grove monsters; Pearson's r = 0,99, p-waarde < 0,0001, n = 18 voor fijne monsters), en de grootte spectrum helling was dicht bij −1 (figuur 6). Het verschil in de hellingen tussen de fijne en grove fracties weerspiegelt het grotere effect van misclassificatie in de grote groottefracties, wat verband houdt met hun lage aantal organismen.
De kansdichtheidsfuncties van de individuele grootteverdelingen van de automatische voorspelling kwamen sterk overeen met de gevalideerde voorspellingen voor de fijne deelmonsters, evenals voor de grove deelmonsters. Er waren echter enkele uitzonderingen voor de grove submonsters die verband hielden met het aantal organismen en dus een groter effect van verkeerde classificatie in die gevallen, zoals eerder benadrukt (figuur 7).
Effect van het aanraken van organismen op de individuele grootteverdelingen, groottespectra en maatstaven
Een vergelijking van de grootteverdelingen verkregen vóór en na de scheiding van de aanrakende organismen en vóór de validatie in een subset van vijf geselecteerde monsters werd uitgevoerd om het effect van het aanraken van objecten te beoordelen. Om de grootteverdelingen te vergelijken, werden de grove en fijne subsamples gecombineerd, afhankelijk van hun fractionering, om een steekproef te reconstrueren die de macro-ongewervelde gemeenschap vertegenwoordigt. In drie steekproeven nam de abundantie na validatie toe (>500 individuen) (figuur 8A). Ondanks deze toename komt het gemiddelde ellipsoïdale volume zeer dicht aan bij het volume berekend in de gevalideerde monsters (figuur 8B).
De grootteverdelingen van de gecorrigeerde monsters (na de scheiding van aanrakende organismen) verschilden enigszins van de gevalideerde. De aanwezigheid van meerdere objecten had dus een kleine invloed op de grootteverdelingen in die monsters (figuur 9A-E). Dienovereenkomstig correleerde de groottediversiteit berekend op basis van de gecorrigeerde steekproeven sterk met de groottediversiteit van de gevalideerde (Pearson's r = 0,94, p-waarde = 0,017, n = 5) (figuur 9F).
Theoretisch heeft het genormaliseerde biovolumegroottespectrum (NBSS) van een gemeenschap met verschillende trofische niveaus een groottespectrumhelling in de log2-schaal die -1 nadert in steady state-omstandigheden4. De NBSS in natuurlijke gemeenschappen heeft vaak een hobbel in plaats van een lineaire verdeling, en dit wordt meestal toegeschreven aan de steekproefbias van de kleinste grootteklassen36. In de huidige studie was de derde grootteklasse de meest voorkomende in de NBSS.
De NBSS'en waren vrij gelijkaardig tussen de stappen van het protocol (figuur 10A-C), met uitzondering van enkele grootteklassen in een paar spectra (figuur 10D-E). Dienovereenkomstig correleerde de groottespectrumhelling berekend op basis van de gecorrigeerde monsters sterk met de helling op basis van de gevalideerde (Pearson's r = 0,99, p-waarde ≤ 0,0001, n = 5) (figuur 10F).
Figuur 2: Voorbeelden van gescande afbeeldingen met verschillende kwaliteiten voor en na verwerking. (A,B) Onbewerkt beeld (links) en bewerkte afbeelding (rechts) van een fijne substeekproef met goede scankwaliteit; (C,D) Onbewerkte afbeelding (links) en bewerkte afbeelding (rechts) van een fijne substeekproef met slechte scankwaliteit (donkere achtergrond en gesneden afbeelding aan de linkerkant); (E,F) onbewerkte afbeelding (links) en bewerkte afbeelding (rechts) van een fijne substeekproef met slechte scankwaliteit (zeer gepixelde donkere achtergrond). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Contourvignetten die verschillende objecten vertegenwoordigen die aanwezig zijn in de monsters. (A-E) Puin (vezel, ronde vlek, macro-ongewervelde poot, vlekken en organisch puin); (F-I) macro-ongewervelde dieren (Coleoptera, Diptera, Plecoptera en Trichoptera) en (J-L) andere ongewervelde dieren (Cladocera, Copepoda en Ostracoda). Schaalstaven geven 1 mm gma = 1,1 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeelden van vignetten die meerdere objecten bevatten. (A) Een macro-ongewerveld (Hydracarina) bevestigd aan een vezel; B) meerdere organismen (Caenidae) geaggregeerd door een vezel; en (C) twee aanrakende macro-ongewervelde dieren (Chironomidae en Caenidae). Schaalstaven geven 1 mm gma = 1,1 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Boxplots van recall en contaminatie (1-precisie). De boxplots voor de drie categorieën macro-ongewervelde dieren, andere ongewervelde dieren en puin (300 vignetten per categorie) van de geselecteerde leerset gevalideerd op een subset van monsters (n = 42). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Vergelijking tussen de abundantie en de gemiddelde ellipsoïdale volumeschattingen in automatische versus gevalideerde classificatie. (A) Abundantieschattingen in de subsamples (n = 42) en (B) gemiddelde ellipsoïdale volumeschattingen in de subsamples (n = 42). De donkere stippen komen overeen met de grove submonsters (>0,5 cm gaas); de grijze stippen komen overeen met de fijne submonsters (>500 μm gaas). De stippellijn vertegenwoordigt de 1:1-relatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Waarschijnlijkheidsdichtheidsfuncties die de relatieve bijdrage (y-as) van de individuele grootte in de logschaal (x-as) vertegenwoordigen voor vergelijking tussen automatische schattingen en tussen gevalideerde schattingen. (A,B) Automatische en gevalideerde schattingen voor grove deelmonsters (n = 18), (C,D) Automatische en gevalideerde schattingen voor fijne subsamples (n = 24). (A,C) Vergelijking tussen automatische schattingen en (B,D) vergelijking tussen gevalideerde schattingen. Kleuren vertegenwoordigen elke substeekproef om de spectra te helpen onderscheiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Vergelijking tussen de abundantie en de gemiddelde ellipsoïdale volumeschattingen in gevalideerde submonsters versus subsamples gevalideerd na de scheiding van aanrakende objecten uit geselecteerde natuurlijke monsters (fijne en grove submonsters samen). (A) Abundantieschattingen door steekproefkader (n = 5) en (B) gemiddelde ellipsoïdale volumeschattingen (n = 5). De stippellijn vertegenwoordigt de 1:1-relatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Waarschijnlijkheidsdichtheidsfuncties die de relatieve bijdrage (y-as) van de individuele grootte in de log2-schaal (x-as) vertegenwoordigen voor de automatische voorspelling, gevalideerde voorspelling en gevalideerde voorspelling met hun respectieve groottediversiteitswaarden (Sd). (A-E) Waarschijnlijkheidsdichtheidsfuncties voor geselecteerde natuurlijke monsters (fijne en grove submonsters samen) (n = 5); de rode lijn komt overeen met de automatische voorspelling, de blauwe lijn komt overeen met de gevalideerde voorspelling en de groene lijn komt overeen met de gecorrigeerde monsters (gevalideerd na de scheiding van aanrakende objecten). (F) Vergelijking van gevalideerde versus gecorrigeerde schattingen van de omvangsdiversiteit; de stippellijn komt overeen met de 1:1-relatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Genormaliseerde spectra van de biovolumegrootte (NBSS) en vergelijking van NBSS-hellingen (μ) tussen behandelingen. (A-E) NBSS vertegenwoordigt de relatie tussen de middelste waarde van elke grootteklasse in de logschaal (x-as) versus het genormaliseerde biovolume per scanframe (y-as) van de vijf geselecteerde monsters voor de automatische (rode kruisen), gevalideerde (blauwe driehoeken) en gecorrigeerde (groene cirkels) voorspellingen met hun respectieve groottespectrum hellingen (μ) berekend in de grootteklassen vanaf de modale grootteklasse en hoger (de derde grootteklasse wordt aangegeven door de verticale stippellijn). (F) Vergelijking van de hellingen berekend op de gevalideerde monsters met de gecorrigeerde (na de scheiding van aanrakende objecten). De stippellijn komt overeen met de 1:1 relatie, r2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Matlab-script om de berekeningen uit te voeren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Kruisvalidatie, terugroepactie en 1-precisie van de gemaakte leersets. (A) Raw learning set met 3 categorieën en 50 vignetten per categorie; B) raw learning set met 3 categorieën en 100 vignetten per categorie; C) ruwe leerset met 3 categorieën en 300 vignetten per categorie; D) ruwe leerset met 3 categorieën en 500 vignetten per categorie; E) ruwe leerset met 5 categorieën en 50 vignetten per categorie; F) raw learning set met 5 categorieën en 100 vignetten per categorie; G) raw learning set met 5 categorieën en 300 vignetten per categorie; h) intermediaire leerset met 16 categorieën en 50 vignetten per categorie; i) intermediaire leerset met 16 categorieën en 100 vignetten per categorie; J) intermediaire leerset met 16 categorieën en 300 vignetten per categorie; (K) fijne leerset met 20 categorieën en 50 vignetten per categorie; (L) fijne leerset met 20 categorieën en 100 vignetten per categorie; en (M) fijne leerset met 20 categorieën en 300 vignetten per categorie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De aanpassing van de methodologie beschreven door Gorsky et al. 2010 voor riviermacro-ongewervelde dieren maakt een hoge classificatienauwkeurigheid mogelijk bij het schatten van de structuur van de gemeenschapsgrootte in zoetwatermabrieren. De resultaten suggereren dat het protocol de tijd voor het schatten van de individuele groottestructuur in een steekproef kan verkorten tot ongeveer 1 uur. Het voorgestelde protocol is dus bedoeld om het routinematige gebruik van macro-ongewervelde groottespectra te bevorderen als een snelle en integratieve bio-indicator om de impact van verstoringen in zoetwaterecosystemen te beoordelen. Het macro-ongewervelde groottespectrum is al gebruikt als een succesvolle index om de ecologische toestand van kustlagunes te evalueren22. Met de ontwikkeling van het protocol kunnen intensieve onderzoeken naar ongewervelde dieren worden uitgevoerd om veldmonitoringcampagnes mogelijk te maken die grote ruimtelijke en temporele schalen bestrijken.
Aangezien het doel van dit protocol is om de individuele grootteverdeling van de bemonsterde gemeenschap op een snelle manier te verkrijgen, waarbij de taxonomie buiten beschouwing wordt gelaten, wordt het aanbevolen om een eenvoudige leerset te maken zoals hier voorgesteld. Tests van fijnere leersets, met een groter aantal categorieën, geven een lagere recall en precisie voor macro-ongewervelde dieren als geheel (tabel 2), en de validatiestap is tijdrovender.
De automatische voorspelling kwam sterk overeen met de gevalideerde voorspelling van 42 natuurlijke submonsters van verschillende bemonsteringslocaties, wat suggereert dat de methode in de automatische modus geschikt is voor het tellen en meten van de macro-ongewervelde dieren in natuurlijke monsters (figuur 6). Bovendien suggereert de gelijkenis in de NBSS'en tussen de automatische en gevalideerde voorspellingen en de hoge fit met het lineaire theoretische model dat de automatische modus een veelbelovende methode is voor het uitvoeren van theoretische ecologische studies (figuur 10).
Tijdens de aanpassing van dit protocol werden verschillende problemen aangetroffen en deze werden op verschillende manieren opgelost of geminimaliseerd. Een probleem om rekening mee te houden bij het scannen van macro-ongewervelde monsters is het verschijnen van donkere verzadigde gebieden. Het is dus belangrijk om de verwerkte, gescande afbeeldingen zo snel mogelijk te controleren om dit probleem te detecteren en de scan indien nodig te herhalen. Dit probleem is ook gevonden bij het scannen van plankton33, maar het wordt verhoogd door het gebruik van ethanol in plaats van kraanwater. Het wordt niet aanbevolen om kraanwater te gebruiken, omdat de organismen die in 70% ethanol worden bewaard, op het oppervlak zullen drijven. Hoewel het apparaat is ontworpen om verdunde ethanol (5%) te weerstaan, worden de ongewervelde monsters bewaard met 70% ethanol. Werken met lagere concentraties ethanol wordt ook niet aanbevolen, omdat de organismen kunnen worden beschadigd door rehydratatie- en dehydratatieprocessen37. De voorgestelde oplossing, die ten zeerste wordt aanbevolen, is om de scanlade meerdere keren met vers water te spoelen na elke scan uitgevoerd met ethanol. Dit voorkomt de opeenhoping van neerslag die de achtergrond van het beeld kan veranderen en beschermt het glas van de scanlade tegen corrosie.
Een ander gedetecteerd probleem is de aanwezigheid van vignetten met meerdere organismen, die het groottespectrum kunnen veranderen vanwege de onderschatting van individuen van bepaalde groottes. Wanneer het aantal vignetten met meerdere objecten laag is (<10%), zoals in dit onderzoek, heeft de aanwezigheid van meerdere objecten een kleine invloed op de grootteverdelingen en NBSS'en in die monsters (figuur 9 en figuur 10). Dit geeft aan dat, om een representatieve groottestructuur van de macro-ongewervelde gemeenschap te verkrijgen, het niet nodig is om tijd te investeren in stap 1.5 van het protocol (de scheiding van aanrakende organismen), waarvoor de beeldverwerking ongeveer 1,5 uur duurt. In plaats daarvan wordt het ten zeerste aanbevolen om tijd te nemen in stap 2.5 van het protocol (het scheiden van aanrakende organismen of aggregaten met behulp van een houten naald), wat veel minder tijdrovend is (maximaal 30 minuten) en zorgt voor een goede schatting van de grootteverdelingen in automatische modus30. Een optie om het aantal aanrakende organismen te verminderen is om met minder organismen per scan te werken, maar er moet rekening worden gehouden met de tijd die wordt geïnvesteerd in het scannen van één monster in een groot aantal fracties en de mogelijkheid van aggregatie van organismen. Een andere oplossing zou zijn om alleen een substeekproef te behouden die het mogelijk zou maken om een representatief groottespectrum te berekenen bij het sorteren van de organismen in het laboratorium in plaats van alle bemonsterde organismen te behouden, zoals in dit werk wordt gedaan. De vermindering van het aantal organismen per monster zou de kans op het aanraken van organismen verminderen. Bovendien, wanneer minder individuen worden opgeslagen, bevat het monster minder puin, wat de scheiding vergemakkelijkt, vooral als vezels kunnen worden vermeden.
De waargenomen beperking van de automatische classificatiemethode houdt verband met de lage aanwezigheid van microschaaldieren (categorie: andere macro-ongewervelde dieren) in de gebruikte monsters. Het gebrek aan representatie van microschaaldieren kan hun juiste classificatie beïnvloeden en de precisie van de automatische voorspelling voor deze categorie beperken. Niettemin vertonen de andere categorieën, puin en macro-ongewervelde dieren, die het hoofddoel van dit werk zijn, een hoge recall en precisie. Alternatieven voor het gebruik van dit scannerapparaat zouden zijn om een gemeenschappelijke scanner aan te passen om waterframes vast te houden, open-source codes voor monsterverwerking en machine learning te promoten zoals hier, en codes te schrijven voor het meten van organismen onder de microscoop met een camera of door flux met een set camera's. Dit is meerdere malen gedaan 23,24,25,26,38,39,40, maar de methode die wij voorstellen regelt de scanparametrisatie om vergelijkbare grootteschattingen te verkrijgen, wat moeilijk te controleren is met de andere systemen. Bovendien zijn het voorgestelde protocol en het scanapparaat klaar voor gebruik, open-source en al gevestigd in de mariene mesozooplanktongemeenschap. Over het algemeen toont de aanpassing van dit protocol een veelbelovende manier om deze automatische beeldvormingsmethode te gebruiken om de groottestructuur van zoetwatermabrieren efficiënt te verkrijgen en het potentieel van groottemetingen voor zoetwaterbioassessment te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentiële tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van Wetenschap, Innovatie en Universiteiten (subsidienummer RTI2018-095363-B-I00). We bedanken de CERM-UVic-UCC-leden Èlia Bretxa, Anna Costarrosa, Laia Jiménez, María Isabel González, Marta Jutglar, Francesc Llach en Núria Sellarès voor hun werk in macro-ongewervelde veldbemonstering en laboratoriumsortering en David Albesa voor hun medewerking aan het scannen van monsters. Tot slot bedanken we Josep Maria Gili en het Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC) voor het gebruik van de laboratoriumfaciliteiten en het scannerapparaat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beaker | Labbox | Other containers could be used | |
| Dionized water | Icopresa | 8420239600123 | To dilute the ethanol |
| Funnel | Vitlab | 41094 | |
| Glass vials 8 ml | Labbox | SVSN-C10-195 | 1 vial/subsample |
| ImageJ Software | Free access | Version 4.41o/ Image processing software | |
| Large frame | Hydroptic | Provided by ZooScan | 24.5 cm x 15.8 cm |
| Monalcol 96 (Ethanol 96) | Montplet | 1050JE001 | |
| Plankton Identifier Software | Free access | Version 1.2.6/ Automatic identification software | |
| Sieve | Cisa | 26852.2 | Nominal aperture 500µ and nominal aperture 0,5 cm |
| Tweezers | Bondline | B5SA | Stainless, anti-magnetic, anti-acid |
| VueScan 9 x 64 (9.5.09) Software | Hydroptic | Version 9.0.51/ Sacn software | |
| Wooden needle | Any plastic or wood needle can be used | ||
| Zooprocess Software | Free access | Version 7.14/Image processing software | |
| ZooScan | Hydroptic | 54 | Version III/ Scanner |
References
- Birk, S., et al. Three hundred ways to assess Europe's surface waters: An almost complete overview of biological methods to implement the Water Framework Directive. Ecological Indicators. 18, 31-41 (2012).
- Basset, A., Sangiorgio, F., Pinna, M. Monitoring with benthic macroinvertebrates: advantages and disadvantages of body size descriptors. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 14, S43-S58 (2004).
- Reyjol, Y., et al. Assessing the ecological status in the context of the European Water Framework Directive: Where do we go now. Science of the Total Environment. 497-498, 332-344 (2014).
- Brown, J. H., Gillooly, J. F., Allen, A. P., Savage, V. M., West, G. B. Toward a metabolic theory of ecology. Ecology. 85 (7), 1771-1789 (2004).
- Woodward, G., et al.
- Sprules, W. G., Barth, L. E. Surfing the biomass size spectrum: Some remarks on history, theory, and application. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (4), 477-495 (2016).
- White, E. P., Ernest, S. K. M., Kerkhoff, A. J., Enquist, B. J. Relationships between body size and abundance in ecology. Trends in Ecology & Evolution. 22 (6), 323-330 (2007).
- Quintana, X. D., et al. A nonparametric method for the measurement of size diversity with emphasis on data standardization. Limnology and Oceanography - Methods. 6 (1), 75-86 (2008).
- Blanchard, J. L., Heneghan, R. F., Everett, J. D., Trebilco, R., Richardson, A. J. From bacteria to whales: Using functional size spectra to model marine ecosystems. Trends in Ecology & Evolution. 32 (3), 174-186 (2017).
- Petchey, O. L., Belgrano, A. Body-size distributions and size-spectra: Universal indicators of ecological status. Biology Letters. 6 (4), 434-437 (2010).
- Emmrich, M., et al. Geographical patterns in the body-size structure of European lake fish assemblages along abiotic and biotic gradients. Journal of Biogeography. 41 (12), 2221-2233 (2014).
- Arranz, I., Brucet, S., Bartrons, M., García-Comas, C., Benejam, L. Fish size spectra are affected by nutrient concentration and relative abundance of non-native species across streams on the NE Iberian Peninsula. Science of the Total Environment. 795, 148792 (2021).
- Vila-Martínez, N., Caiola, N., Ibáñez, C., Benejam, L. l, Brucet, S. Normalized abundance spectra of the fish community reflect hydropeaking on a Mediterranean large river. Ecological Indicators. 97, 280-289 (2019).
- Benejam, L. l, Tobes, I., Brucet, S., Miranda, R. Size spectra and other size-related variables of river fish communities: systematic changes along the altitudinal gradient on pristine Andean streams. Ecological Indicators. 90, 366-378 (2018).
- Sutton, I. A., Jones, N. E. Measures of fish community size structure as indicators for stream monitoring programs. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 77 (5), 824-835 (2019).
- Murry, B. A., Farrell, J. M. Resistance of the size structure of the fish community to ecological perturbations in a large river ecosystem. Freshwater Biology. 59, 155-167 (2014).
- Townsend, C. R., Thompson, R. M. Body size in streams: Macroinvertebrate community size composition along natural and human-induced environmental gradients. In Body Size: The Structure and Function of Aquatic Ecosystems. Hildrew, A. G., Raffaelli, D. G., Edmonds-Brown, R. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
- Gjoni, V., et al. Patterns of functional diversity of macroinvertebrates across three aquatic ecosystem types, NE Mediterranean. Mediterranean Marine Science. 20 (4), 703-717 (2019).
- Pomeranz, J. P. F., Warburton, H. J., Harding, J. S. Anthropogenic mining alters macroinvertebrate size spectra in streams. Freshwater Biology. 64 (1), 81-92 (2019).
- García-Girón, J., et al. Anthropogenic land-use impacts on the size structure of macroinvertebrate assemblages are jointly modulated by local conditions and spatial processes. Environmental Research. 204, 112055 (2022).
- Demi, L. M., Benstead, J. P., Rosemond, A. D., Maerz, J. C. Experimental N and P additions alter stream macroinvertebrate community composition via taxon-level responses to shifts in detrital resource stoichiometry. Functional Ecology. 33 (5), 855-867 (2019).
- Basset, A., et al. A benthic macroinvertebrate size spectra index for implementing the Water Framework Directive in coastal lagoons in Mediterranean and Black Sea ecoregions. Ecological Indicators. 12 (1), 72-83 (2012).
- Ärje, J., et al. Automatic image-based identification and biomass estimation of invertebrates. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 922-931 (2020).
- Raitoharju, J., et al. Benchmark database for fine-grained image classification of benthic macroinvertebrates. Image and Vision Computing. 78, 73-83 (2018).
- Lytle, D. A., et al. Automated processing and identification of benthic invertebrate samples. Journal of the North American Benthological Society. 29 (3), 867-874 (2010).
- Serna, J. P., Fernández, D. S., Vélez, F. J., Aguirre, N. J. An image processing method for recognition of four aquatic macroinvertebrates genera in freshwater environments in the Andean region of Colombia. Environmental Monitoring and Assessment. 192, 617 (2020).
- Gorsky, G., et al. Digital zooplankton image analysis using the ZooScan integrated system. Journal of Plankton Research. 32 (3), 285-303 (2010).
- Marcolin, C. R., Schultes, S., Jackson, G. A., Lopes, R. M. Plankton and seston size spectra estimated by the LOPC and ZooScan in the Abrolhos Bank ecosystem (SE Atlantic). Continental Shelf Research. 70, 74-87 (2013).
- Silva, N., Marcolin, C. R., Schwamborn, R. Using image analysis to assess the contributions of plankton and particles to tropical coastal ecosystems. Estuarine, Coast and Shelf Science. 219, 252-261 (2019).
- Vandromme, P., et al. Assessing biases in computing size spectra of automatically classified zooplankton from imaging systems: A case study with the ZooScan integrated system. Methods in Oceanography. 1-2, 3-21 (2012).
- Naito, A., et al. Surface zooplankton size and taxonomic composition in Bowdoin Fjord, north-western Greenland: A comparison of ZooScan, OPC and microscopic analyses. Polar Science. 19, 120-129 (2019).
- García-Comas, C., Picheral, E. Zooprocess/Plankton Identifier protocol for computer assisted zooplankton sorting. , Available from: https://manualzz.com/doc/43116355/zooprocess—plankton-identifier-protocol-for (2013).
- Picheral, E. ZooSCAN: Manual to scan and process samples. Quantitative Imaging Platform of Villefranche sur Mer (PlQv). , Available from: http://www.hydroptic.com/assets/uploads/files/documentations/ae4e0-zooscan_user_manual.pdf (2020).
- Protocolo de muestreo y laboratorio de fauna bentónica de invertebrados en ríos vadeables. CÓDIGO: ML-Rv-I-2013. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. , Available from: https://www.miteco.gob.es/es/agua/temas/estado-y-calidad-de-las-aguas/ML-Rv-I-2013_Muestreo%20y%20laboratorio_Fauna%20bent%C3%B3nica%20de%20de%20invertebrado_%20R%C3%Ados%20vadeables_24_05_2013_tcm30-175284.pdf (2013).
- García-Comas, C., et al. Prey size diversity hinders biomass trophic transfer and predator size diversity promotes it in planktonic communities. Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 283 (1824), 20152129 (2016).
- García-Comas, C., et al. Mesozooplankton size structure in response to environmental conditions in the East China Sea: How much does size spectra theory fit empirical data of a dynamic coastal area. Progress in Oceanography. 121, 141-157 (2014).
- Marquina, D., Buczek, M., Ronquist, F., Lukasik, P. The effect of ethanol concentration on the morphological and molecular preservation of insects for biodiversity studies. PeerJ. 9, 10799 (2021).
- Bell, J. L., Hopcroft, R. R. Assessment of ZooImage as a tool for the classification of zooplankton. Journal of Plankton Research. 30 (12), 1351-1367 (2008).
- Colas, F., et al. The ZooCAM, a new in-flow imaging system for fast onboard counting, sizing and classification of fish eggs and metazooplankton. Progress in Oceanography. 166, 54-65 (2018).
- Bachiller, E., Fernandes, J. A., Irigoien, X. Improving semiautomated zooplankton classification using an internal control and different imaging devices. Limnology and Oceanography Methods. 10 (1), 1-9 (2012).
