Methodenartikel

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

DOI:

10.3791/64382

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10. Februar 2023

 , 
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)

Zusammenfassung

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Typ-Drei-Sekretionssysteme (T3SSs) ermöglichen es gramnegativen Bakterien, eine Batterie von Effektorproteinen direkt in das Zytosol eukaryotischer Wirtszellen zu injizieren. Beim Eintritt modulieren die injizierten Effektorproteine kooperativ eukaryotische Signalwege und programmieren zelluläre Funktionen um, was das Eindringen und Überleben von Bakterien ermöglicht. Die Beobachtung und Lokalisierung dieser sezernierten Effektorproteine im Kontext von Infektionen liefert einen Fußabdruck für die Definition der dynamischen Schnittstelle von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Markierung und Bildgebung bakterieller Proteine in Wirtszellen ohne Störung ihrer Struktur/Funktion ist jedoch technisch anspruchsvoll.

Die Konstruktion fluoreszierender Fusionsproteine löst dieses Problem nicht, da die Fusionsproteine den sekretorischen Apparat blockieren und somit nicht sezerniert werden. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir kürzlich eine Methode zur ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung von bakteriell sezernierten Effektoren sowie anderen schwer zu markierenden Proteinen unter Verwendung der genetischen Code-Expansion (GCE) eingesetzt. Diese Arbeit bietet ein vollständiges Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mit GCE-Ortsspezifischkeit, gefolgt von Anweisungen zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM)

Neuere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Einbau von nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAAs) über GCE, gefolgt von bioorthogonaler Markierung mit tetrazinhaltigen Farbstoffen, eine praktikable Technik zur selektiven Markierung und Visualisierung von bakteriell sezernierten Proteinen und anschließender Bildanalyse im Wirt ist. Das Ziel dieses Artikels ist es, ein einfaches und klares Protokoll bereitzustellen, das von Forschern verwendet werden kann, die daran interessiert sind, hochauflösende Bildgebung mit GCE durchzuführen, um verschiedene biologische Prozesse in Bakterien und Viren sowie Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen.

Einleitung

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Bakterielle Infektionen gelten seit langem als ernsthafte Gefahr für die menschliche Gesundheit. Krankheitserreger nutzen hochentwickelte, extrem leistungsfähige und komplizierte Abwehrsysteme sowie eine Vielzahl von bakteriellen Virulenzfaktoren (sogenannte Effektorproteine), um der Immunantwort des Wirts zu entgehen und Infektionen zu verursachen 1,2. Die molekularen Mechanismen, die diesen Systemen zugrunde liegen, und die Rolle einzelner Effektorproteine sind jedoch noch weitgehend unbekannt, da es an geeigneten Ansätzen mangelt, um die entscheidenden Proteinkomponenten und Effektoren in Wirtszellen währen....

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Protokoll

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1. Plasmid-Konstruktion

  1. Klonen Sie das Gen, das das POI exprimiert, in ein Expressionsplasmid (z. B. pET28a-sseJ 10TAG), das das POI in E. coli BL21 (DE3) exprimiert. Dieser Schritt erleichtert die Feststellung, ob die Mutanten funktionsfähig sind.
  2. Für die Visualisierung von Salmonella-sezernierten Effektoren in Wirtszellen wird ein Expressionsplasmid (pWSK29-sseJ-HA) konstruiert, das das Ziel-POI-SseJ unter der Kontrolle seines nativen Promotors exprimiert, wie in früheren Berichten beschrieben 7,12,24.....

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Ergebnisse

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Dieses Protokollpapier beschreibt eine GCE-basierte Methode zur ortsspezifischen Fluoreszenzmarkierung und Visualisierung von Salmonella-sezernierten Effektoren, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die chemische Struktur der ncAA-tragenden trans-Cycloocten-Bioorthogonalgruppe (TCO) und des Fluoreszenzfarbstoffs ist in Abbildung 1A dargestellt. Die SseJ-Markierung wurde durch genetischen Einbau von bioorthogonalen ncAAs an ei.......

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Diskussion

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Der hier beschriebene Ansatz wurde verwendet, um die genaue Position von Effektorproteinen zu verfolgen, die nach der Infektion vom bakteriellen T3SS in die Wirtszelle injiziert werden. T3SSs werden von intrazellulären Krankheitserregern wie Salmonellen, Shigellen und Yersinien eingesetzt, um Virulenzkomponenten in den Wirt zu transportieren. Die Entwicklung von hochauflösenden Bildgebungstechnologien hat es möglich gemacht, Virulenzfaktoren mit einer bisher unvorstellbaren Auflösung sichtbar z.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Anschubfinanzierungen der University of Texas Medical Branch, Galveston, TX, und einen Texas STAR Award an L.J.K. Wir danken Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Deutschland) für das Plasmid pEVOL-PylRS-AF. Die Bilder in Abbildung 1 wurden mit BioRender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x Tris/Glycin SDS LaufpufferBIO-RAD1610732
AmmoniumchloridFischer ScientificA661-500
AmmoniumsulfatFischer ScientificBP212R-1
Ampicillin NatriumSigma-AldrichA01665 g
Antibiotikum-Antimykotikum (100x)ThermiFischer Scientific15240096
ArabinoseSigma-AldrichA3256500 g
Avanti J-26XP (Hochleistungszentrifuge)Beckman Coulter
Bacto-AgarBD Diagnostics, Franklin Lakes, USA214010
BDP-FL-TetrazinLumiprobe (USA)2.14E+02
β-MercaptoethanolMillipore444203250 mL
BromphenolblauSigma-AldrichB8026
BSASigma-AldrichA4503500 g
KaseinSigma-AldrichC8654
KatalaseSigma-AldrichC9322
ChloramphenicolSigma-AldrichC1919
Click Aminosäure / trans-Cyclooct-2-de – L - Lysin (TCO*A)SiChem GmbHSC-8008Größe: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)InvitrogenH3570
DeNovix DS-11+ SpektralphotometerDeNovix
DMEM*Corning10-013-CV* Zur Aufrechterhaltung von HeLa Cell
DMEM**Gibco11965-092**Zur Behandlung von bakteriellen Infektionen in Gegenwart von ncAA, siehe Abschnitt 5.4.
DMSOSigma-AldrichD8418250 g
Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluoro555 SekundärantikörperInvitrogenA-31572
DPBS, 1xCorning21-031-CV
E. coli Stamm BL21 (DE3)Novagen (Madison, WI)
EMCCD KameraAndoriXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1,5 mL (PCR clean)Eppendorf, Hamburg, Deutschland30123.328
Fötales Rinderserum (FBS)Fischer10082147
Fisherbrand Spritzenvorsatzfilter - steril (PVDF 0,22 µ m)Fischer Scientific97203Packung mit 100
Gene Pulser Xcell ElektroporatorBIO-RAD1652660
GentamycinSigma-AldrichG127210 mL
Gibco L-Glutamin (200 mM), 100xFischer Scientific25-030-081
GlukoseoxidaseSigma-AldrichG7141-50KU
GlycerinFischer ScientificBF229-4
HeLa-ZellenATTCCCL-2
HEPES BufferCorning25-060-C1100 mL
SalzsäureFischer ScientificA144-212
ImageJBildverarbeitung und -analyse:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlueExpedeonISB1LFarbstoff auf Coomassie-Basis
Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)Sigma-AldrichI5502
Janelia Fluoro 646-tetrazin,Tocris Bioscience7279
Kanamycin,Sigma-Aldrich606155 g
LB BouillonBD, Difco244620500 g
LysozymSigma-AldrichL6876
μ Manager (v. 1.4.2)https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MESSigma-AldrichM3671250 g
MikropulserküvetteBIO-RAD165-20860,2 cm Elektrodenabstand, Packung à 50
Nikon N-STORMNikon Instruments Inc.https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask ZellkulturflaschenThermiFischer Scientific156499
Omnipur CasaminosäureCalbiochem2240500 g
Paraformaldehhyde (PFA)Elektronenmikroskopie Wissenschaften 15710
PBS (10x)Roche11666789001
Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x)GenDEPOT CA005-010100 mL
pEVOL-PylRS-AFZur Plasmidkonstruktion und -karte siehe folgende Referenzen
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-Prep KitQiagen27106
Plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.
Plasmid pWSK29-sseJ-HARef.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                                                                                    Vektorkarte von PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127Millipore540025Proteinqualität, 10% ige Lösung
Kaliumphosphat monobasischFischerScientific P285-500
KaliumsulfatAcros Organisches424220250
Proteasehemmer Cocktail Set I - CalbiochemSigma-Aldrich539131100x Lösung
Kaninchen-Anti-HA-PrimärantikörperSigma-AldrichH6908
S. enterica. Serovar Typhimurium 14028sRef.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
SaponinSigma-Aldrich47036-50G-F
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma-AldrichL3771
NatriumhydroxidFischer ScientificSS255-1
Natriumpyruvat (100 mM), 100xCorning25-060-C1100 mL
Sonic Dismembrator Modell 100Fischer Scientific24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X System)Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschlandhttps://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORMhttps://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT CA014-010
Tween-20Sigma-AldrichP9416100 mL
X-Well-Gewebekultur-KammerobjektträgerSARSTEDT94.6190.802
: , , , ,

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretio....

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Schlagwörter

Sekretionssystem Typ IIIstandortspezifische Markierungnicht kanonische Aminos urendSTORM MikroskopieWirt Pathogen InteraktionSalmonella Effektorenbioorthogonal Markierung

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