Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

מאמר זה מספק פרוטוקול פשוט וברור לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר הרחבת קוד גנטי (GCE) ספציפי ותמונה של לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)

Abstract

מערכות הפרשה מסוג שלוש (T3SSs) מאפשרות לחיידקים גראם-שליליים להזריק סוללה של חלבוני אפקט ישירות לתוך הציטוזול של תאי המאכסן האיקריוטיים. עם כניסתם, חלבוני ההשפעה המוזרקים מווסתים בשיתוף פעולה מסלולי איתות אאוקריוטים ומתכנתים מחדש תפקודים תאיים, מה שמאפשר כניסה והישרדות של חיידקים. ניטור ולוקליזציה של חלבוני השפעה מופרשים אלה בהקשר של זיהומים מספק טביעת רגל להגדרת הממשק הדינמי של אינטראקציות מארח-פתוגן. עם זאת, תיוג והדמיה של חלבוני חיידקים בתאים מארחים מבלי לשבש את המבנה / תפקוד שלהם הוא מאתגר מבחינה טכנית.

בניית חלבוני היתוך פלואורסצנטיים אינה פותרת בעיה זו, מכיוון שחלבוני ההיתוך תוקעים את מנגנון ההפרשה ולכן אינם מופרשים. כדי להתגבר על מכשולים אלה, השתמשנו לאחרונה בשיטה לתיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר של חיידקים המופרשים אפקטורים, כמו גם חלבונים אחרים שקשה לתייג, באמצעות הרחבת קוד גנטי (GCE). מאמר זה מספק פרוטוקול מלא שלב אחר שלב לסימון אפקטורים המופרשים בסלמונלה באמצעות אתר GCE ספציפי, ואחריו הוראות להדמיית לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM)

ממצאים אחרונים מצביעים על כך ששילוב של חומצות אמינו לא קנוניות (ncAAs) באמצעות GCE, ואחריו תיוג ביו-אורתוגונלי עם צבעים המכילים טטרזין, היא טכניקה בת קיימא לתיוג סלקטיבי והדמיה של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים וניתוח תמונה לאחר מכן בפונדקאי. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול פשוט וברור שיכול לשמש חוקרים המעוניינים לבצע הדמיה ברזולוציית על באמצעות GCE כדי לחקור תהליכים ביולוגיים שונים בחיידקים ווירוסים, כמו גם אינטראקציות מארח-פתוגן.

Introduction

זיהומים חיידקיים נחשבים זה מכבר לסכנה חמורה לבריאות האדם. פתוגנים משתמשים במערכות הגנה מפותחות, חזקות מאוד ומורכבות, כמו גם במגוון גורמי אלימות חיידקיים (המכונים חלבוני אפקטור) כדי להתחמק מתגובות החיסון של המאכסן וליצור זיהומים 1,2. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מערכות אלה ותפקידם של חלבוני השפעה בודדים עדיין אינם ידועים במידה רבה בשל המחסור בגישות מתאימות למעקב ישיר אחר רכיבי החלבון החיוניים והמשפיעים בתאים המארחים במהלך הפתוגנזה.

דוגמה אופיינית אחת היא Salmonella enterica serovar Typhimurium, אשר גורם דלקת גסטרואנטריטיס חריפה. סלמונלה טיפימוריום משתמש במערכות הפרשה מסוג שלוש (T3SS) כדי להזריק מגוון חלבונים משפיעים ישירות לתאים מארחים. ברגע שהסלמונלה נכנסת לתא המארח, היא שוכנת בתא הקשור לקרום חומצי, המכונה VACUOLE המכיל סלמונלה (SCV)3,4. ה- pH החומצי של ה- SCV מפעיל את האי T3SS המקודד לסלמונלה פתוגניות 2 (SPI-2) ומעביר מטח של 20 חלבוני השפעה או יותר על פני הממברנה החללית לתוך הציטוזול המארח 5,6,7,8. בתוך הפונדקאי, קוקטיילים מורכבים אלה של חלבוני אפקט מתמרנים באופן מתאם את מסלולי האיתות של תאי המארח, וכתוצאה מכך נוצרים מבנים צינוריים דינמיים ומורכבים ביותר המשתרעים מה- SCV לאורך מיקרוטובולים, המכונים חוטים המושרים על ידי סלמונלה (SIFs), המאפשרים לסלמונלה לשרוד ולשכפל בתוך תאי המאכסן 9,10,11.

שיטות לדמיין, לעקוב ולנטר לוקליזציה של גורמים חיידקיים, ולבחון את הסחר והאינטראקציות שלהם בתוך תאים מארחים, מספקות תובנה קריטית לגבי המנגנונים העומדים בבסיס הפתוגנזה החיידקית. תיוג ולוקליזציה של חלבוני אפקט T3SS המופרשים בסלמונלה בתוך תאי המאכסן הוכיחו את עצמם כאתגר טכנולוגי12,13; עם זאת, התפתחותם של חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית שינתה את יכולתנו לחקור ולדמיין חלבונים בתוך מערכות חיות. עם זאת, גודלם של חלבונים פלואורסצנטיים (~25-30 kDa)15 דומה לעתים קרובות או אפילו גדול מזה של החלבון המעניין (POI; למשל, 13.65 kDa עבור SsaP, 37.4 kDa עבור SifA). למעשה, סימון חלבון פלואורסצנטי של אפקטורים חוסם לעתים קרובות את הפרשת האפקט המסומן ותוקע את T3SS14.

יתר על כן, חלבונים פלואורסצנטיים הם פחות יציבים ופולטים מספר נמוך של פוטונים לפני הלבנה, מה שמגביל את השימוש בהם בטכניקות מיקרוסקופיות ברזולוציה סופר 16,17,18, במיוחד במיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבציה (PALM), STORM ומיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED). בעוד התכונות הפוטופיזיקליות של צבעים פלואורסצנטיים אורגניים עדיפות על אלה של חלבונים פלואורסצנטיים, שיטות/טכניקות כגון CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 ו-HA-Tags 24,25 דורשות תוספת חלבון או נספח פפטידי שעלול לפגוע במבנה-תפקוד של חלבון המשפיע המעניין על ידי הפרעה לשינוי או סחר לאחר תרגום. שיטה חלופית הממזערת את שינוי החלבונים הדרוש כוללת שילוב של ncAAs לתוך POI במהלך תרגום באמצעות GCE. ncAAs הם פלואורסצנטיים או ניתן להפוך פלואורסצנטי באמצעות כימיה קליק 12,13,26,27,28.

באמצעות GCE, ncAAs עם קבוצות ביו-אורתוגונליות זעירות, פונקציונליות (כגון אזיד, ציקלופרופן או קבוצת ציקלואוקטיין) יכולות להיות מוצגות כמעט בכל מקום בחלבון המטרה. באסטרטגיה זו, קודון יליד מוחלף עם קודון נדיר כגון קודון עצירה ענברי (TAG) במיקום מוגדר בגן של POI. החלבון המהונדס מתבטא לאחר מכן בתאים לצד זוג אמינואציל-tRNA סינתאז/tRNA אורתוגונלי. האתר הפעיל tRNA synthetase מתוכנן לקבל רק ncAA מסוים אחד, אשר לאחר מכן מחובר באופן קוולנטי לקצה 3' של tRNA המזהה את קודון הענבר. ה-ncAA פשוט מוכנס למדיום הגידול, אבל הוא חייב להיקלט על ידי התא ולהגיע לציטוזול שבו האמינואציל-tRNA סינטטאז (aaRS) יכול לקשר אותו ל-tRNA האורתוגונלי; לאחר מכן הוא משולב בנקודת העניין במיקום שצוין (ראה איור 1)12. לפיכך, GCE מאפשר שילוב ספציפי לאתר של שפע של קבוצות תגובתיות ביו-אורתוגונליות כגון קטון, אזיד, אלקין, ציקלואוקטיין, טרנסציקלוקטן, טטרזין, נורבונן, α, אמיד β בלתי רווי וביציקלו [6.1.0]-nonyne לתוך POI, ובכך עשוי להתגבר על המגבלות של שיטות סימון חלבונים קונבנציונליות 12,26,27,28.

מגמות חדשות בטכניקות הדמיה ברזולוציית על פתחו דרכים חדשות לחקור מבנים ביולוגיים ברמה המולקולרית. בפרט, STORM, טכניקה של מולקולה יחידה, מבוססת לוקליזציה, ברזולוציית על, הפכה לכלי רב ערך לדמיין מבנים תאיים עד ~20-30 ננומטר והוא מסוגל לחקור תהליכים ביולוגיים מולקולה אחת בכל פעם, ובכך לגלות את תפקידן של מולקולות תוך תאיות שעדיין אינן ידועות במחקרים מסורתיים ממוצעים13 . טכניקות של מולקולה בודדת וסופר-רזולוציה דורשות תג קטן עם פלואורופורים אורגניים בהירים הניתנים לצילום לקבלת הרזולוציה הטובה ביותר. לאחרונה הדגמנו כי GCE יכול לשמש לשילוב בדיקות מתאימות להדמיה ברזולוציית על12.

שתיים מהבחירות הטובות ביותר לסימון חלבונים בתאים הן bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) ו-trans-cyclooctene-lysine (TCO; מוצג באיור 1), אשר עשוי להיות מקודד גנטית באמצעות גרסה של זוג tRNA/synthetase (כאן נקרא tRNAPyl/PylRS AF), כאשר Pyl מייצג pyrrolysine, ו-AF מייצג מוטציה כפולה מתוכננת באופן רציונלי (Y306A, Y384F) שמקורה ב-Methanosarcina mazei המקודד באופן טבעי פירוליזין12, 29,30,31. באמצעות תגובת SPIEDAC (ראשי תיבות של Diels-Alder cycloaddition - Diels-Alder cycloaddition) המקודמת על ידי זן, חומצות אמינו אלה מגיבות באופן כימוסלקטי עם מצומדות טטרזין (איור 1)12,30,31. תגובות ציקלואידיות כאלה מהירות במיוחד ותואמות תאים חיים; הם עשויים גם להיות פלואורוגניים, אם פלואורופור מתאים הוא פונקציונלי עם tetrazine moiety12,26,32. מאמר זה מציג פרוטוקול אופטימלי לניטור הדינמיקה של אפקטורים חיידקיים המועברים לתאים מארחים באמצעות GCE, ולאחר מכן לוקליזציה תת-תאית של חלבונים המופרשים בתאי HeLa באמצעות dSTORM. התוצאות מצביעות על כך ששילוב של ncAA באמצעות GCE, ואחריו תגובת קליק עם צבעים נושאי טטרזין פלואורוגניים, מייצג שיטה רב-תכליתית לתיוג סלקטיבי, הדמיה של חלבונים מופרשים ולאחר מכן לוקליזציה תת-תאית בפונדקאי. עם זאת, ניתן להתאים או להחליף את כל המרכיבים והנהלים המפורטים כאן, כך שניתן יהיה להתאים את מערכת GCE לחקר שאלות ביולוגיות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בניית פלסמיד

  1. שכפל את הגן המבטא את נקודת העניין לפלסמיד ביטוי (לדוגמה, pET28a-sseJ 10TAG) המבטא את נקודת העניין ב- E. coli BL21 (DE3). צעד זה מאפשר לקבוע כי המוטנטים מתפקדים.
  2. לצורך הדמיה של אפקטים המופרשים בסלמונלה בתאים מארחים, בנו פלסמיד ביטוי (pWSK29-sseJ-HA) המבטא את נקודת העניין SseJ תחת שליטת המקדם המקורי שלו, כפי שתואר בדוחות קודמים 7,12,24. באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר, להחליף את הקודון של פנילאלנין-10 עם קודון ענבר (TAG) ב SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), הבטחת מוטיב AAT-TAG-ACT33,34.
  3. בנוסף לפלסמידים לעיל, לצורך שילוב גנטי של trans-cyclooct-2-en-L-lysine (TCO*A) לתוך POI, השתמש בביטוי נוסף plasmid (pEVOL-PylRS-AF)31 המכיל את צמד tRNA/synthetase המפותח (tRNAPyl/PylRS AF ) גנים המקודדים בפלסמיד pEVOL.
    הערה: תיאורים מפורטים של פרוטוקולי הפלסמיד והשיבוט מתוארים בדוח הקודם30,31.
  4. השתמש בערכות להכנת פלסמיד זמינות מסחרית כדי להשיג DNA פלסמיד באיכות גבוהה. עבור DNA מטוהר, היחס האופטימלי של 260/280 הוא ~ 1.8. בדוק את טוהר ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1%, במידת הצורך.

2. הכנת תרבית חיידקים

  1. השגת טרנספורמנטים כפולים כדי לבדוק שהמוטציה מתפקדת באי-קולי
    1. קח תאים מוכשרים BL21 מתוך -80 ° C והפשיר על קרח במשך כ 20-30 דקות.
    2. יש לערבב 1-5 μL של כל פלסמיד (~50 ng של pEVOL-PylRS-AF ו-pET28a-sseJ 10TAG) עם 200 μL של תאי BL21 בעלי כשירות כימית בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מערבבים את התאים המוסמכים ואת תערובת פלסמיד בעדינות; יש לדגור במשך 30 דקות על קרח.
    3. הלם חום את צינור המיקרוצנטריפוגה באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות. מחזירים את הצינורות לקרח למשך 2 דקות.
    4. הוסף 1 מ"ל של מדיום LB חם לצינור מיקרוצנטריפוגה במהירות להעביר את התערובת לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C בשייקר במהירות 250 סל"ד למשך שעה אחת. צלחת חלק או את כל התאים שעברו טרנספורמציה על צלחות אגר LB המכילות אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור את הצלחות לילה ב 37 °C (77 °F).
      הערה: בפרוטוקול זה, 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול וקנמיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל שימשו לבחירת pEVOL-PylRS-AF ו-pET28a-sseJ 10TAG, בהתאמה. בשלב הטרנספורמציה, הערך את השינוי המוצלח באמצעות בקרות שליליות וחיוביות.
  2. העברת המוטציה לסלמונלה לצורך הדמיה של אפקטורים המופרשים בסלמונלה בתאים מארחים:
    1. הוסף 2-3 μL כל אחד של pEVOL-PylRS-AF ו- pWSK29-sseJ 10TAG ל- 40-60 μL של זן סלמונלה טיפימוריום 14028s בצינור מיקרוצנטריפוגה צונן. מערבבים את התערובת בעדינות עם פיפטה.
    2. מעבירים את תערובת האלקטרופורציה לקובט צונן (מרווח אלקטרודות של 0.2 ס"מ); הגדר את הגדרות אלקטרופורציה ל 2.5 קילו וולט, 200 Ω, 25 מיקרופרנהייט. מניחים את הקובט בתוך תא האלקטרופורציה. ודא כי אלקטרודת התא עושה מגע חזק עם cuvette micro pulser.
    3. לחצו לחיצה ממושכת על כפתור הדופק עד שהוא יצפצף.
    4. מיד להוסיף 1 מ"ל של בינוני LB חם לתוך cuvette. מעבירים את כל התוכן לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. לדגור על התאים ב 37 ° C עם רעד ב 250 סל"ד במשך 1 שעות.
    5. צלחת חלק או את כל תערובת אלקטרופורציה של סלמונלה על צלחת אגר LB המכילה אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור את הצלחות לילה ב 37 °C (77 °F).
      הערה: בפרוטוקול זה, 35μg/mL chloramphenicol ו- 100 μg/mL ampicillin שימשו לבחירת pEVOL-PylRS-AFו- pWSK29-sseJ 10TAG, בהתאמה.
  3. הכנת תרבות
    1. יש לחסן מושבה אחת של סלמונלה או אי קולי ב-5 מ"ל של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. יש לגדול לילה ב-37°C, לרעוד ב-250 סל"ד.

3. ביטוי ותיוג פלואורסצנטי של חלבונים נושאי ncAA

  1. ביטוי חלבונים נושאי ncAA באי-קולי
    1. מעבירים 100 מיקרוליטר של תרבית ראשונית ל-5 מ"ל של LB בינוני (דילול 1:50) המכיל 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול וקנמיצין 50 מק"ג/מ"ל, ולאחר מכן דגירה ב-37°C עם טלטול ב-250 סל"ד עד OD600 מגיע ל-0.4–0.6.
    2. הכן 1 mM TCO*A פתרון מלאי (10 מ"ל; טבלה 1).
    3. כאשר התרביות מגיעות ל-OD600 = 0.4-0.6, החלף את מדיית ה-LB ב-LB טרי המכיל 1 mM TCO*A, 35 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול ו-50 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין.
      הערה: לחלופין, ניתן להכין פתרון TCO*A Stock כמתואר בשלב 5.4.2.
    4. יש להשרות ביטוי חלבון בנוכחות 1 mM IPTG, 0.2% ארבינוז ולנער במשך הלילה ב-34°C, 250 סל"ד. קצרו את תאי החיידקים באמצעות צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 11,000 × גרם. מוציאים את הסופרנאטנט ומקפיאים את הגלולה בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש נוסף.
    5. עבור ניסוי בקרה, חזור על אותו ניסוי אך בטא את החלבונים נושאי ncAA בהיעדר ncAA. עבור תיוג פלואורסצנטי במבחנה של חלבונים נושאי ncAA ב- E. coli, בצע את ההליך המפורט המתואר בשלב 3.3.
  2. ביטוי חלבונים נושאי ncAA בסלמונלה
    1. מעבירים 100 מיקרוליטר של תרבית ראשונית ל-5 מ"ל של LB בינוני (דילול 1:50) המכיל 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול ו-100 מק"ג/מ"ל אמפיצילין, ולאחר מכן דגירה ב-37°C עם טלטול ב-250 סל"ד עד OD600 מגיע ל-0.6.
    2. הכן מדיום N-מינימלי שונה (MgM, pH 5.6) כמתואר בטבלה 1.
    3. החלף את מדיום LB בתווך N-מינימלי שונה (MgM) בתוספת 1 mM TCO*A (טבלה 1). לגדל את החיידקים ב 34 ° C במשך 30 דקות. לאחר מכן, להוסיף 0.2% arabinose, 25 מ"ג / מ"ל chloramphenicol, ו 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין, ולגדל את התאים במשך 6 שעות נוספות, רועד ב 250 סל"ד.
    4. לאחר 6 שעות, שטפו את החיידקים 4x במרווח של 30 דקות, עם מדיה טרייה של MgM (pH 5.6) (טבלה 1) ללא ncAA. בשלבי הכביסה, יש להשתמש ב-972 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. צנטריפוגו את החיידקים, השהו מחדש במאגר PBS 1x, ודגרו במשך שעה אחת ב -4 מעלות צלזיוס בחושך כדי להסיר עודפי ncAAs. לאחר שעה, צנטריפוגו את החיידקים בטמפרטורה של 3,000 × גרם, 4°C למשך 15 דקות ואחסנו לשימוש נוסף.
    6. עבור ניסוי בקרה, חזור על אותו ניסוי על ידי ביטוי חלבונים נושאי ncAA בהיעדר ncAA.
  3. תיוג פלואורסצנטי במבחנה של חלבונים נושאי ncAA בסלמונלה טיפימוריום
    1. השהיה מחדש של תאי סלמונלה המבטאים SseJ-F10TCO-HA בהיעדר או נוכחות של TCO*A (משלב 3.2) ב-1x PBS. כוונן את OD600 ל- 4 ב- PBS. לדגור על התאים עם 20 מיקרומטר Janelia Fluor 646-tetrazine (JF646-Tz) או 20 μM BDP-Fl-tetrazine (5 mM תמיסות מלאי DMSO) ב 37 ° C בחושך ולנער במשך 1-2 שעות ב 250 סל"ד.
    2. יש לשטוף את התאים 3-4x עם PBS המכיל 5% DMSO ו-0.2% F-127 פלורוני, להשהות מחדש ב-PBS המכיל 5% DMSO, ולדגור למשך הלילה ב-4°C בחושך. שטפו שוב פעמיים עם 1x PBS. בשלבי הכביסה, יש להשתמש ב-972 × גרם, למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. דמיינו את התאים מיד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או קבעו אותם עם 1.5% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    4. שטפו את התאים הקבועים 2x עם PBS ולבסוף ב 50 mM NH4Cl ב PBS במשך 15 דקות כדי להסיר עודף PFA. השהה מחדש את התאים ב- PBS ואחסן ב- 4 ° C למשך לא יותר מ 3-4 ימים. דמיינו את החיידקים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כמתואר בסעיף 6.

4. אפיון ביוכימי של חלבונים נושאי ncAA

  1. ליזה של תאים
    1. השהה מחדש את התאים מסעיף 3.1 במאגר ליזיס (טבלה 1) ודגר בטמפרטורת החדר במשך יותר מ-30 דקות. מצננים את התערובת על קרח במשך 15 דקות.
      הערה: שמור על היחס בין מאגר הליזה למשקל התא ביחס של 1:10.
    2. סוניק את התאים המרחפים מחדש בעודם על קרח. פולס במשך 30 שניות בהגדרה 7 לפחות 6x, במרווחים של דקה, באמצעות סוניק (ראה טבלת חומרים).
    3. סובב את הליזט התא ב 20,500 × גרם, 4 ° C במשך 15 דקות (שמירה על 4 ° C הוא קריטי). מעבירים את הסופרנאטנט לצינור טרי ומשליכים את הכדורית.
  2. ניתוח SDS-PAGE
    1. הכינו צבע טעינה 5x SDS (טבלה 1). הוסף 5 μL של מאגר טעינת ג'ל SDS ל- 13 μL של ליזט תאים. נטרל את החלבונים עם מאגר דגימה של נתרן דודציל סולפט (SDS) בצינור של 2 מ"ל ב-95°C למשך 10 דקות, צנטריפוגה את התערובת ב-2,000 × גרם למשך 50 שניות, והעמיסה על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS 12%.
    2. הרכיבו את קלטת הג'ל, הניחו אותה במנגנון אלקטרופורזה ג'ל וחברו את מכשיר האלקטרופורזה לספק כוח חשמלי. יוצקים את מאגר הריצה, טוענים את סמני המשקל המולקולרי ודגימות החלבון, ומפעילים את הג'ל במתח של 100 וולט, עד שהברומופנול מגיע לתחתית ג'ל הפתרון.
      הערה: התחל את הניתוח מיד, מכיוון שליזטים המאוחסנים ב -20 ° C נוטים לאבד איכות לאחר כל מחזור הקפאה-הפשרה.
    3. מכתימים את הג'ל בכתם חלבון כחול Coomassie.

5. תיוג ביו-אורתוגונלי של אפקט סלמונלה מופרש SseJ-F10TCO-HA בתאי HeLa

  1. תרבית ותחזוקת תאי HeLa בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 ו-95% לחות במדיום עיט מעובד (DMEM) בעל גלוקוז גבוה (4.5 גרם לליטר), בתוספת FBS של 10% (v/v) בנוסף לפניצילין-סטרפטומיצין (1x).
  2. תרבית חיידקים יום אחד לפני ההדבקה. יש לחסן מושבה אחת של סלמונלה 14028 המכילה pEVOL-PylRS-AF ו-pWSK29-sseJ 10TAG ב-5 מ"ל של מרק LB סטנדרטי המכיל אנטיביוטיקה למשך הלילה ב-37°C, תוך טלטול ב-250 סל"ד.
  3. זרע תאי HeLa 1 יום לפני ההדבקה. קח בקבוק תרבית רקמה (T-75) המכיל תאי HeLa ב ~ 80% מפגש, כפי שנקבע על ידי בדיקה מיקרוסקופית של צפיפות התא. לשטוף את התאים עם PBS חם. נתק את התאים עם 3 מ"ל חם 0.25% טריפסין/EDTA למשך 5 דקות ב-37°C, 5% CO2.
    1. להרוות את טריפסין באמצעות 2 מ"ל של DMEM (+ 10% FBS). להעביר את כל התוכן של הבקבוק לתוך צינור 15 מ"ל לאחר השעיה מחדש של התאים. סובבו את התאים במהירות של 1,000 × למשך 5 דקות. הוציאו את הסופרנאטנט מהשפופר. יש להשהות מחדש את כדורית תאי HeLa במצע גידול שחומם מראש.
    2. השתמש בהמוציטומטר כדי לבחון את התרחיף ולספור את התאים הנוכחים. הכינו מלאי תאים מדולל ב 1 × 105 תאים / מ"ל. זרע 0.5 × 105 תאי HeLa לכל באר ב 500 μL של DMEM + 10% FBS מדיום צמיחה בשקופית תא שמונה בארות. שמור את תא החלקה באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2, 95% לחות במשך 24 שעות.
  4. זיהום חיידקי
    1. תת-תרבית סלמונלה 14028s המכילה pEVOL-PylRS-AF ו-pWSK29-sseJ 10TAG, על ידי דילול 100 מיקרוליטר של תרבית חיידקים בלילה (משלב 5.2) ל-3 מ"ל של LB בינוני (דילול 1:30) המכיל 35 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול ו-100 מק"ג/מ"ל אמפיצילין, ולאחר מכן דגירה ב-37°C עם טלטול ב-250 סל"ד למשך 5-7 שעות.
      הערה: במהלך שלב זה, התרביות מגיעות לשלב המעריכי המאוחר, והחיידקים פולשניים מאוד.
    2. הכן 100 mM TCO*A פתרון מלאי ומדיה מלאה (טבלה 1).
    3. כדי ליזום את זיהום תאי HeLa, הוציאו את תאי HeLa מהאינקובטור ושטפו את התאים עם DPBS שחומם מראש לפני הוספת 500 μL של DMEM טרי (+10% FBS) לכל באר. הניחו את החלקת התא בחזרה באינקובטורCO 2 עד לתחילת הזיהום.
    4. לאחר 5-7 שעות של דגירה, לדלל את תרבית הסלמונלה ל OD600 = 0.2 ב 1 מ"ל של מדיום גידול DMEM (~ 3 × 108 cfu/mL). הוסף את הכמויות הדרושות של חיסון הסלמונלה בכל באר של שקופית התא כך שריבוי הזיהום (MOI) הוא 100.
    5. לדגור על התאים הנגועים באינקובטור CO2 למשך 30 דקות. שטפו את התאים 3x עם DPBS שחומם מראש כדי להסיר סלמונלה חוץ-תאית. הגדר נקודת זמן זו ל- 0 שעות לאחר ההדבקה. הוסף 500 μL של מדיום שלם (טבלה 1) המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין למשך שעה אחת. לאחר 1 שעה, לשטוף את התאים 3x עם DPBS. הוסף 500 μL של המדיום השלם (משלב 5.4.2; טבלה 1) בתוספת 0.2% ארבינוז, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין לכל באר של שקופית התא.
    6. בניסוי ביקורת, בצע זיהומים דומים של תאי HeLa ללא TCO*A.
    7. לדגור על שקופית התא במשך 10 שעות באינקובטור CO2 .
  5. לחץ על תיוג מבוסס כימיה בתאים חיים
    1. המשך לתייג את התאים הנגועים בחיידקים. חממו מראש את המדיום המלא ללא TCO*A (טבלה 1).
    2. לאחר 10 שעות לאחר ההדבקה, החלף את המדיום המלא בתווך שלם טרי ללא TCO*A ושטוף את תאי HeLa 4x במרווח של 30 דקות כל אחד עם DPBS שחומם מראש, ולאחר מכן מדיום שלם טרי (ללא TCO*A).
    3. הכן תמיסת מלאי dye-tetrazine 0.5 mM ב- DMSO.
      הערה: לתיוג משפיעי סלמונלה המופרשים בתאי המאכסן, מוצגים שני פרוטוקולים. עבור פרוטוקול 1, הכינו את תערובת הצבע על ידי דילול מלאי JF646-Tz ב-1x PBS המכיל 1% קזאין נתרן מלח מחלב בקר, כך שתמיסת העבודה הסופית היא 2 מיקרומטר. לפרוטוקול 2, הכינו מדיום מלא וחם (ללא FBS ו-TCO*A) והוסיפו 2μM JF646-Tz. הפכו את תערובת הצבע לטרייה עבור כל סבב תיוג. עבדו בחושך במידת האפשר (עמעמו את האורות במכסה המנוע ו/או בחדר).
    4. לאחר 12 שעות לאחר ההדבקה, לשאוף את התווך מן התאים. שטפו את התא עם DPBS שחומם מראש 2x או 3x. בקבוצה אחת של בארות, הוסף 500 μL של תערובת תמיסת הצבע המתוארת בפרוטוקול 1, ובקבוצה אחרת של בארות של אותה שקופית תא, הוסף 500 μL של תערובת תמיסת הצבע המתוארת בפרוטוקול 2 המוזכר בשלב 5.5.3 ואת ההערה שאחריו. הניחו את החלקת התא בחזרה לתוך אינקובטור CO 2 למשך 1.5-2 שעות.
    5. לאחר 13.5-14 שעות לאחר ההדבקה, שטפו את תאי HeLa 2x עם DPBS שחומם מראש. הוסף 500 μL של DMEM טרי (בתוספת FBS). הניחו את המגלשה התאית בחזרה באינקובטור למשך 30 דקות. שטפו את התאים עם DPBS שחומם מראש ואחריו DMEM טרי 4x על פני מרווח של 30 דקות.
    6. ב 16 שעות לאחר ההדבקה, לתקן את תאי HeLa עם PFA על ידי הוספת 200 μL של 4% PFA בכל באר ודגרה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. יש לשאוף מה-PFA, לשטוף 3x עם PBS ולאחסן את התאים ב-PBS בטמפרטורה של 4°C בחושך.
      הערה: PFA הוא כימיקל רעיל ביותר. יש להימנע משאיפה, כמו גם ממגע עור ועין. יש ללבוש ציוד מגן בעת הטיפול. כדי למנוע מהדגימה המסומנת להיחשף לאור, כבו את האור במכסה המנוע של תרבית התא.
  6. Immunostaining של חלבונים המתויגים HA
    1. יש לשאוף מה-PBS ולשטוף פעם אחת בתמיסת חסימה (טבלה 1).
    2. דגרו על תאי HeLa קבועים עם תמיסת נוגדנים ראשונית מבוססת PBS (טבלה 1) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך. השתמש בנוגדן ראשוני נגד HA של ארנב כדי להכתים SseJ המופרש (דילול 1:500).
    3. לאחר שעה, שטפו בעדינות את התאים 2x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween-20/1x PBS. במהלך השטיפות עם תמיסת Tween/PBS, יש לדגור על התאים 3x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween20/1x PBS למשך 5 דקות.
    4. לדלל נוגדן משני חמור נגד ארנב 555 1:500 בתמיסת נוגדנים משנית ולדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
    5. לאחר שעה אחת, שטפו בעדינות את התאים 2x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween-20/1x PBS ודגרו 2x עם 0.5 מ"ל של 0.1% Tween20/1x PBS למשך 5 דקות.
    6. לשטוף את התאים 3x עם 0.5 מ"ל של 1x PBS ולאחסן אותם ב 4 ° C בחושך.
      הערה: תאים קבועים ניתן לאחסן במשך כמה שבועות PBS ב 4 ° C. Immunostaining צריך להתבצע ברגע האחרון.

6. הדמיה קונפוקלית

  1. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי, כגון דיסק מסתובב (SD) או מיקרוסקופ STED.
    1. התאם את הגדרות רכישת התמונה, כגון מצב סריקה (XYZ), מהירות סריקה (400 הרץ), רזולוציה (512 x 512), הגדלה (100x) וערימת Z.
    2. השתמש במסנני העירור/פליטה הנכונים עבור DAPI, BDP-Tz וטטרזין JF646.
      הערה: עבור פרוטוקול זה, הדמיה קונפוקלית בוצעה על מערכת מיקרוסקופ STED המצוידת בלייזר אור לבן פועם, המאפשר בחירה של עירור בטווח של 470-670 ננומטר ולייזר דיודה UV 405 ננומטר לעירור ב 405 ננומטר, 488 ננומטר, ו 647 ננומטר. טווחי הפליטה המתאימים הוגדרו באמצעות מפצל אלומה אקוסטית-אופטית מובנה בשילוב עם זיהוי ספקטרלי מבוסס מנסרה של המערכת הקונפוקלית בריבוי פסים.
    3. השג את התמונות באמצעות מטרה של טבילת שמן 100×/1.4.

7. הדמיה ברזולוציית על (dSTORM)

  1. הפעל את המיקרוסקופ 3 שעות לפני ההדמיה כדי לאפשר שיווי משקל תרמי (סביר יותר שסחף יתרחש אם ההדמיה מתחילה לפני כן). קררו את המצלמה לטמפרטורה של -70°C.
  2. בינתיים, הכינו מאגר הדמיה חדש של GLOX-BME (טבלה 1).
  3. הביאו את התאים למיקרוסקופ. הניחו את תא ההדמיה על במת המיקרוסקופ במחזיק הדגימה. במחזיק, ודא שהדגימה שטוחה ומאובטחת. שנה את התווך בבאר עם 0.4 מ"ל של חיץ הדמיה GLOX-BME טרי.
  4. הגדר את קו הלייזר הנכון ואת ערכות הסינון. הפחת את עוצמת הלייזר ל~ 1 mW כדי לזהות תא HeLa מעניין. כוונן את מישור המוקד ואת זווית קרן הלייזר תוך הארת הדגימה בצפיפות לייזר נמוכה של 647 ננומטר (במקרה זה, מוצעת זווית משופעת תלולה [HILO], מכיוון ש- HILO מעלה את האות לרקע [SBR]). כוונן את זווית ההארה של HILO.
    הערה: בפרוטוקול זה, הדמיה ברזולוציית על של SseJ נרכשה בערוץ Alexa Fluor 647 באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך (ראה טבלת חומרים), המצויד במטרה TIRF (יעד טבילת שמן 100x Apo TIRF, NA 1.49). פלואורסצנטיות זוהתה באמצעות מצלמת EMCCD, אשר נשלטה באמצעות μManager.
  5. הגדר את רווח קדם-המגבר ל- 3 והפעל את העברת המסגרות ב- μManager. הגדר EM-gain ל - 200 לרגישות גבוהה יותר במדידות dSTORM, כפי שתואר בדוח קודם35.
  6. לפני הדמיה dSTORM, צלם תמונה מוגבלת עקיפה ייחוס של מבנה המטרה. העבר את הפלואורופורים למצב כהה על ידי הפעלת הלייזר לעוצמתו המרבית.
    הערה: מולקולות בודדות ומהבהבות במהירות של פלואורופורים JF646 נצפו כאשר פלואורופורים JF646 השתנו למצב כהה בעיקר על ידי הארה רציפה של אור עירור 647 ננומטר, כפי שתואר קודם לכן36.
  7. התאימו את עוצמת הלייזר לרמה מתאימה בה מופרדים אירועי מצמוץ במרחב ובזמן, כוונו את זמן החשיפה ל-30 מילישניות והתחילו ברכישה. לרכוש 10,000-30,000 מסגרות.
    הערה: יש לבצע שינויים בחוזק הלייזר כדי למטב את המצמוץ. שקול להגביר את עוצמת הלייזר אם זוהו אירועים רבים מדי (חלקיקים מהבהבים חופפים). האורך האידיאלי תלוי באיכות המדגם, אך ~ 10,000 מסגרות צריכות להציג תכונות ברורות.

8. שחזור תמונה של dSTORM

  1. השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח תמונה.
    הערה: ThunderSTORM, אחת מתוכניות רבות לשחזור תמונות בקוד פתוח הזמינות, מתוארת בקצרה להלן.
  2. פתח את ImageJ וייבא את הנתונים הגולמיים. פתח את תוסף ThunderSTORM והגדר את הגדרת המצלמה המתאימה להתקן.
  3. עבור אל הפעל ניתוח והגדר את ההגדרות המתאימות, כגון סינון תמונות (הפרש של מסננים ממוצעים), שיטות לוקליזציה (מקסימום מקומי) ולוקליזציה תת-פיקסלים של מולקולות (PSF גאוסיאנית משולבת). לחץ על אישור כדי להתחיל בשחזור תמונה.
    הערה: במידת הצורך, הוראות מפורטות להגדרת הפרמטרים ב- ThunderSTORM כבר תוארו37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נייר פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת GCE לתיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר ולהדמיה של אפקטורים המופרשים מסלמונלה, כפי שמתואר באיור 1. המבנה הכימי של קבוצת ה-ncAA הנושאת טרנס-ציקלואוקטן ביו-אורתוגונלי (TCO) והצבע הפלואורסצנטי מוצגים באיור 1A. תיוג SseJ הושג על-ידי שילוב גנטי של ncAAs ביו-אורתוגונליים בקודון עצירה ענברי (ראו איור 1B) באמצעות זוגות אמינואציל-tRNA סינתטאז/tRNA אורתוגונליים באמצעות טכנולוגיית GCE. טיפול באפקטורים בעלי תווית TCO עם טטרזין המכיל פלואורופור (JF646-Tz או BDP-Tz) סיפק אסטרטגיית תיוג חלבונים חלופית שאפשרה תצפית על אפקטורים המופרשים בסלמונלה שעות רבות לאחר ההדבקה של המאכסן (איור 1B,C). התחלנו בזיהוי שאריות חומצות אמינו אפשריות ובחרנו מיקום 10 של SseJ להכללה ncAA בהתבסס על נגישות פני השטח והידע הקיים של שאריות פונקציונליות SseJ. נתונים מבניים קודמים ותחזיות חשיפה לפני השטח יכולים לסייע בבחירת מיקומים ספציפיים.

מיקומו של קודון הענבר בתוך הגן המקודד את נקודת העניין משפיע על יעילות שילוב TCO. כתוצאה מכך, סדרה של מוטנטים עם קודונים ענבר במיקומים שונים של הגן של POI צריך להיווצר ולנתח עבור יעילות אינטגרציה אופטימלית. בחירת מיקום קודון הענבר היא אמפירית. באופן כללי, השאריות שהשתנו צריכות להיות לא חיוניות לתפקוד POI, נטולות שינויים לאחר תרגום, ונגישות לבדיקות פלואורסצנטיות. הביטוי פלסמיד צריך להיות מספר עותק נמוך כך שהוא מחקה את מספר העותק המקורי של נקודת העניין. הקשר הקודון משפיע על מידת היעילות של ncAA המשולב על ידי מערכת סינטטאז אורתוגונלית tRNA/aminoacyl-tRNA. בעוד AAT-TAG-ACT הוא ההקשר המועדף של tRNA אורתוגונלי, המיקום של פנילאלנין-10 של sseJ שונה ל- TAG, הבטחת הקשר AAT-TAG-ACT המאפשר את השילוב היעיל ביותר של ncAA. ראשית, בדקנו אם המוטנטים היו פונקציונליים בחיידק E. coli באמצעות פלסמיד מספר העתק גבוה כדי לבטא sseJ. כפי שניתן לראות על-ידי SDS-PAGE, הביטוי המוטנטי של SseJ-F10TCO-HA היה תלוי בנוכחות של TCO*A וב-tRNA/aaRS האופטימלי המתאים (איור 2A). SseJ-F10FCO-HA סומן עם JF646-Tz באמצעות כימיית קליקים SPIEDAC ב- E. coli. התיוג הפלואורסצנטי הסלקטיבי של SseJ-F10TCO-HA ב-E. coli in vitro אושר על-ידי ניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2B). באמצעות GCE, TCO*A שולב באופן ספציפי באתר קודון ענבר ב- sseJ. ניסיונות לזהות ישירות שילוב גנומי מחוץ למטרה של ncAAs באמצעות מערכתtRNA Pyl/PylRS AF לא הניבו ראיות לקיומם. עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בפלואורסצנטיות בג'ל, כתם מערבי, חלבון היתוך פלואורסצנטי, תיוג פלואורסצנטי במבחנה ושיטות אחרות כדי להעריך את היעילות, הספציפיות, מידת השילוב מחוץ למטרה והרעילות של פלסמיד pEVOL, כפי שתועד במאמרים שדווחו בעבר שצוטטו כאן12,29.

ברגע שקבענו שה-TAG המודחק ב-sseJ הוא פונקציונלי, שיבטנו את sseJ-F10TCO-HA יחד עם המקדם המקורי שלו לתוך פלסמיד pWSK29 בעל מספר העתקה נמוך, מה שהבטיח מוטיב AAT-TAG-ACT לתיוג והדמיה פלואורסצנטיים. תיוג סלקטיבי במבחנה של SseJ-F10TCO-HA בתאי סלמונלה אושר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3). לאחר מכן הדבקנו תאי HeLa בזן סלמונלה פראי בתוספת p sseJ-HA או p sseJ 10TAG-HA, בהיעדר או נוכחות של TCO*A כדי לקבוע אם ניתן להפוך אתSseJהמשולב TCO לתאים מארחים. תאי HeLa נגועים תוקנו עם PFA והוכתם בנוגדן אנטי-HA 16 שעות לאחר ההדבקה כדי להדגיש את SIFs המעוטרים על ידי SseJ. כפי שניתן לראות באיור 4C, SseJ-F10TCO-HA הופרש ללא ספק, נוצרו SIFs תלויי SseJ, והם נראו דומים לאלה שנצפו בתאים נגועים מסוג בר (איור 4A). עם זאת, SIFs תלויי SseJ לא נצפו בהיעדר TCO*A (איור 4B). תצפיות אלה הראו כי הביטוי של sseJ-F10TCO-HA באמצעות GCE הציל SIFs תלויי SseJ. בנוסף, התוצאות גם הצביעו על כך ש- SseJ-F10TCO-HA היה גורם אלימות מתפקד במלואו לסלמונלה.

לאחר שווידאנו שה-SseJ שכותרתו GCE היה פונקציונלי ומופרש, השתמשנו בתגובת SPIEDAC כדי לתייג את SseJ-F10TCO-HA עם JF646-Tz בתאי HeLa. כדי לעשות זאת, הדבקנו תאי HeLa בסלמונלה מסוג פראי בתוספת p sseJ-F10TCO-HA, בנוכחות TCO*A. לאחר התיוג עם JF646-Tz באמצעות שני פרוטוקולים חלופיים המתוארים בסעיף 5 של הפרוטוקול, התאים נשטפו באופן נרחב כדי להסיר עודפי צבע, תוקנו עם PFA, והוכתמו במערכת החיסון עם נוגדן אנטי-HA כדי להמחיש את SseJ-F10TCO-HA המופרש. ה-SseJ-F10TCO-HA שהופרש לתוך הציטופלסמה של תאי HeLa סומן ב-JF646-Tz (איור 5A,B, אדום) ועבר לוקליזציה ברורה עם תג HA (ירוק). התצפית ששתי התוויות חפפו זו לזו (האחת צבע פלואורסצנטי, השנייה מסומנת על ידי צביעה חיסונית), מדגישה עוד יותר את הספציפיות של תיוג GCE.

כדי להבטיח שהאות הפלואורסצנטי שנצפה בתאי HeLa אלה היה ספציפי רק לגורם המופרש SseJ, הדבקנו תאים בסלמונלה מסוג פראי (נושאת psseJ-HA) בנוכחות TCO*A ו-pEVOL-PylRS-AF. נעשה שימוש בצבע קליק כדי לבחון אם יש תיוג רקע כלשהו בתאי HeLa. SseJ שוחרר לתוך הציטופלסמה של התא המארח, ללא אותות פלואורסצנטיים תוך-תאיים או לא ספציפיים (איור 5C), מה שמדגים שהאות הפלואורסצנטי היה ספציפי ל-SseJ. לאחר שנקבע כי ncAAs שולבו באופן ספציפי בקודון ענבר, וכי SseJ מופרש ניתן לדמיין בתא המארח באמצעות תגובת קליק, המטרה הבאה הייתה ליצור תמונה ברזולוציית על של SseJ מופרש בתאי HeLa (איור 6). באיור 6 אנו מדגימים את העוצמה של GCE ואת השימוש בצבע JF646 כדי ליצור תמונות ברזולוציית על ספציפיות לאתר של האפקט SseJ המופרש בסלמונלה בתאי HeLa.

Figure 1
איור 1: סכימה לתיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר של אפקטי SPI-2. (A) TCO*A ו-JF-646-tetrazine. (B) הסכימה מתארת שילוב של ncAA באפקט SPI-2. בתא החיידק מוצגים פלסמיד המכיל את הגן ל-POI משפיע (סגול) וזוג tRNA מדכא אורתוגונלי (אדום)/אמינואציל סינטטאז (ירוק). קודון מקומי מוחלף בקודון עצירה ענברי (TAG, אדום) ברצף הגן המשפיע במיקום מתירני. ncAA (עיגול אדום כהה) הוא פשוט הציג לתוך מדיום הצמיחה. לאחר מכן הוא נאסף על ידי התא ומגיע לציטוזול, שם הוא מקושר ל-tRNA האורתוגונלי על ידי aminoacyl-tRNAsynthetase(aaRS). tRNA acylated ncAA עם אנטיקודון CUA נכנס למנגנון הריבוזומלי כתוצאה מקודון ענבר משלים על mRNA אפקט (סגול), שילוב ncAA מחובר לתוך המאפקט. ה- ncAA נישא על ידי שרשרת הפוליפפטיד באורך מלא של אתר המשפיע, אשר לאחר מכן מתקפל ומתכנס לחלבון משפיע פונקציונלי. האפקט החדש שנוצר מועבר לתא המארח דרך T3SS. ניתן להשתמש בפלואורופור שסופק חיצונית כדי לסמן אפקט SPI-2 מופרש המשולב עם ncAA. (C) סכמת תגובת קליק ללא נחושת עם צבע טטרזין פלואורוגני. באמצעות תגובת הקליק של SPIEDAC, ncAA עם קבוצת אלקן מתוחה המשולבת בנקודת עניין (SseJ) מגיב עם צבע מצומד טטרזין (JF646-Tz). הצבע הפלואורוגני, המצומד לטטרזין JF646-Tz, הופך לפלואורסצנטי (אדום) רק לאחר תיוג מוצלח. קיצורים: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; ncAA = חומצת אמינו לא קנונית; T3SS = סוג שלוש מערכת הפרשה; SPI-2 = אי פתוגניות סלמונלה 2; POI = חלבון של עניין; SPIEDAC = ציקלואידית אלקטרונים הופכית מקודמת זן-ביקוש Diels-Alder. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: TCO*A משולב באופן ספציפי ב-SseJ-F10TCO-HA מבוטא ב-E. coli. (A) SDS-PAGE מוכתם בקומאסי מאשר את השילוב הסלקטיבי של TCO*A ב-SseJ-F10TCO-HA (מסומן בחץ אדום) in E. coli. (B) ביטוי של SseJ-F10TCO-HA ב- E. coli שנותח במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהיעדר (למעלה) או נוכחות (למטה) של 1 mM TCO*A. תאי E. coli המבטאים SseJ-F10TCO-HA בהיעדר או נוכחות של TCO*A מודגרים עם BDP-Fl-tetrazine ומצולמים עבור פלואורסצנטיות BDP (ירוק). פלואורסצנטיות SseJ (ירוק) נצפית רק בנוכחות תווית TCO*A המשולבת; שימו לב להיעדר פלואורסצנטיות רקע בחלונית העליונה. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. קיצורים: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = שדה בהיר; HA = חומצה היאלורונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: TCO*A משולב באופן ספציפי ב-SseJ-F10TCO-HA ומבוטא בסלמונלה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש לבחינת הביטוי של SseJ-F10TCO-HA בסלמונלה בהיעדר (למעלה) או נוכחות (למטה) של 1 mM TCO*A. סלמונלה המבטאת SseJ F10TCO-HA מטופלת ב- JF646-Tz ומצולמת עבור JF646 פלואורסצנטיות (מגנטה), בנוכחות או היעדר TCO*A. פלואורסצנטיות של SseJ (מגנטה) מזוהה רק כאשר TCO*A קיים. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. קיצורים: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = שדה בהיר; HA = חומצה היאלורונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: SseJ-J10TCO-HA המופרש מתפקד. (A) תאי HeLa נגועים בסלמונלה המכילה psseJ-HA למשך 16 שעות, קבועים ומוכתמים חיסון בנוגדנים נגד HA (אדום), LPS (ירוק) ו-DAPI (כחול). כצפוי, היווצרות של SIFs תלויי SseJ נצפתה בתאים נגועים. (B) בהיעדר TCO*A, קודון הענבר אינו מדוכא, ו-SIFs תלויי SseJ נעדרים בתאי HeLa נגועים. תאי HeLa נגועים בסלמונלה המבטאת SseJ-F10TCO-HA בהיעדר TCO*A למשך 16 שעות, קבועים ומוכתמים חיסון בנוגדנים נגד HA (אדום), LPS (ירוק) ו- DAPI (כחול). (C) SIFs תלויי SseJ נצפים בנוכחות TCO*A. תאי HeLa נגועים בסלמונלה המבטאים SseJ-F10TCO-HA בנוכחות 400 מיקרומטר TCO*A קבועים ומוכתמים חיסון עם נוגדן אנטי-HA SseJ (אדום), LPS (ירוק) ו- DAPI (כחול). SIFs תלויי SseJ נצפים בלוח השמאלי, מה שמצביע בבירור על כך ש- SseJ ניצל על ידי ביטוי של sseJ-F10TCO-HA באמצעות GCE. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: HA = חומצה היאלורונית; LPS = lipopolysaccharide; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TCO*A = טרנס-ציקלוק-2-en-L-ליזין; SIFs = חוטים הנגרמים מסלמונלה; GCE = הרחבת קוד גנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ספציפיות התיוג של SseJ עם צבע JF646-Tz. (A) תאי HeLa נגועים בסלמונלה המבטאת SseJ-F10TCO-HA בנוכחות 400 μM TCO*A. SSEJ-F10TCO-HA המופרש מתויג TCO מסומן ב-2 מיקרומטר JF646-Tz ב-1x PBS המכיל 1% קזאין נתרן מלח מחלב בקר, שנשטף באופן נרחב, קבוע ומוכתם בנוגדן אנטי-HA כדי להמחיש את ה-SseJ המופרש (ירוק). SseJ-F10TCO-HA מופרש ומסומן בצבע JF646-Tz (אדום, פאנל שמאלי). SseJ המסומן באמצעות GCE (אדום) ו- HA (ירוק) הם בבירור לוקליזציה משותפת (לוח ימני). (B) באמצעות פרוטוקול תיוג שונה במקצת, SseJ-F10TCO-HA המופרש עם תיוג TCO מסומן גם ב-2 μM JF646-Tz ב-DMEM בינוני מלא (ללא FBS), נשטף באופן נרחב וקבוע, ונתון לצביעת אנטי-HA אימונופלואורסצנטית. SseJ-F10TCO-HA המופרש מסומן בצבע JF646-Tz (אדום, פאנל שמאלי) ומותאם ל-HA (ירוק). (C) כדי לקבוע עוד יותר שהאות הפלואורסצנטי ייחודי ל-SseJ ואינו תוצר של חלבונים אחרים ששוחררו SPI-2, תאי HeLa נגועים בסלמונלה מסוג פראי הנושאת psseJ-HA ו-pEVOL-PylRS-AF, בנוכחות ncAA (TCO*A). לאחר 16 שעות לאחר ההדבקה, תאי HeLa נגועים מטופלים עם 2 μM JF646-Tz בתווך מלא (ללא FBS ו- TCO*A), והצבע העודף מוסר ביסודיות באמצעות מדיום גידול חדש. תאי HeLa קבועים PFA ונשטפים ביסודיות עם PBS לפני שהם מוכתמים חיסון עבור SseJ (ירוק). היעדר אות פלואורסצנטי ברקע נראה לעין בלוח השמאלי (JF646-Tz) מצביע על כך שכמעט ולא התרחש תיוג מחוץ למטרה בתוך התאים המארחים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. קיצורים: HA = חומצה היאלורונית; PBS = מלח חוצץ פוספט; FBS = נסיוב בקר עוברי; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TCO*A = טרנס-ציקלוק-2-en-L-ליזין; SIFs = חוטים הנגרמים מסלמונלה; GCE = הרחבת קוד גנטי; SPI-2 = אי פתוגניות סלמונלה 2; BF = שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: הדמיה ברזולוציית על של SseJ המסומן ב-GCE בתאי HeLa. תאי HeLa נגועים בסלמונלה המבטאת SseJ-F10TCO-HA בנוכחות 400 μM TCO*A. SSEJ-F10TCO-HA המופרש עם תיוג TCO מסומן ב-2 מיקרומטר JF646-Tz בתנאים פיזיולוגיים כמתואר בפרוטוקול, ולאחר מכן נשטף באופן נרחב. התמונות נרכשות באמצעות Nikon N-STORM. (A) תמונת שדה בהיר של תא HeLa תחת תצפית. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) תמונת שדה רחב מוגבלת עקיפה של SseJ מופרש המסומנת ב-TCO*A וב-JF-646. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C) תמונת dSTORM תואמת של SIFs מעוטרים ב- SseJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. כניסה C(i) מציגה תצוגה מוגדלת של SseJ סופר-פתור באזור התיבה. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. קיצורים: HA = חומצה היאלורונית; TCO*A = טרנס-ציקלוק-2-en-L-ליזין; SIFs = חוטים הנגרמים מסלמונלה; GCE = הרחבת קוד גנטי; WF = שדה רחב; BF = שדה בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1. פתרונות. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הגישה המתוארת כאן שימשה למעקב אחר המיקום המדויק של חלבוני אפקט המוזרקים לתא המארח על ידי החיידק T3SS לאחר ההדבקה. T3SSs משמשים פתוגנים תוך תאיים כגון סלמונלה, שיגלה וירסיניה, כדי להעביר רכיבים אלימים לתוך הפונדקאי. הפיתוח של טכנולוגיות הדמיה ברזולוציית על איפשר לדמיין גורמי אלימות ברזולוציה בלתי נתפסת בעבר 12,13,24. עם זאת, אילוצי התוויה מסוימים מנעו חקירה מעמיקה יותר, מכיוון שאיחוי חלבונים פוטואקטיביים חוסמים את נקבוביות T3SS ואינם מופרשים. בנוסף, קיבוץ ממצאים וניתוח שגוי יכולים לנבוע מהנטייה הטבועה של חלבון היתוך כלשהו להתקבץ או לצבור.

במקרים מסוימים, חלבון ההיתוך הוא גם בקע, כפי שראינו בעבר עם PAmCherry-SsaP12,13. על כל האילוצים הללו מתגברים GCE, המאפשר תיוג פלואורסצנטי ספציפי לאתר של נקודות עניין. זה גם מאפשר הדמיה של חלבונים שאינם בשפע12,13. אמנם ישנם מספר גורמים שיכולים להשפיע על היעילות של שילוב ncAA באמצעות מערכת סינתטאז tRNA אורתוגונלית / aminoacyl-tRNA, נראה כי הקשר קודון הוא המכריע ביותר. ה-tRNA האורתוגונלי משלב ncAA בצורה היעילה ביותר כאשר הקשר הקודון המועדף הוא AATTAGACT33. באיור 5 אנו יכולים להשוות את התיוג החד שנוצר כתוצאה מ-GCE ופלואורופור ספציפי לאתר (כמו גם היעדר רקע) בהשוואה לצביעת מערכת החיסון של תג HA.

כתוצאה מכך, חוקרים יוכלו לדמיין נקודות עניין בפתוגנים, חיידקים קומנסליים ופונדקאים אאוקריוטים באמצעות השיטה המתוארת כאן. בקיצור, ncAAs מקודדים גנטית מספקים גישה חלופית לתיוג חלבון אפקט כאשר שיטות קונבנציונליות נכשלות. עם זאת, מגבלה עיקרית אחת של שיטה זו היא התכונות הכימיות הטבועות בפלואורופור, כגון חדירות, פיזור ושימור של הממברנה, אשר יכולות להשפיע על יעילות הסימון הפלואורסצנטי. ncAAs פלואורסצנטיים הם אפשרות חלופית להימנע מתגובות לחיצה12, אולם ניתן להמחיש אותם רק באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. הקוראים מופנים לרשימה של צבעים חדירים / בלתי חדירים לקרום התא המצוטטים כאן 12,38,39,40,41.

לסיכום, תייגנו ודמיינו באופן ספציפי את אפקט הסלמונלה המופרש SseJ על ידי קידוד גנטי של ncAAs בשילוב עם פלואורופור פלואורוגני מבלי לפגוע בתפקוד הביולוגי שלו. התיוג של SseJ עם JF646-Tz היה ספציפי מאוד, וניתן להשתמש בהדמיה ברזולוציית על כדי להמחיש אפקטים מופרשים בתוך תאי המאכסן. לפיכך, תיוג פלואורסצנטי של אפקטורים חיידקיים באמצעות צבעים תואמי dSTORM והרחבת הקוד הגנטי איפשר לוקליזציה מרחבית תת-תאית של אפקטורים המופרשים חיידקים בתאים מארחים, ברזולוציה מתחת לגבול העקיפה. מכיוון שפלטפורמת תיוג זו תואמת למעקב אחר חלקיקים בודדים של הדמיה של תאים חיים, השיטה שלנו תאפשר לנתח חלבונים משפיעים של מערכת T3SS ברמות חסרות תקדים של רזולוציה זמנית ומרחבית, מה שישפר את ההבנה המולקולרית שלנו של פתוגנזה חיידקית.

בעוד שישנן מגבלות מסוימות, כגון יעילות שילוב ncAA ירודה והאילוצים הפוטופיזיים של הפלואורופור האורגני, הוכחנו כי גישה זו יכולה לסייע לחוקרים לצפות ולמקם אפקט מופרש בתוך תאי המאכסן, גם כאשר הוא נדיר12,13. אנו צופים כי התאמת הטכנולוגיה תפתח הזדמנויות חדשות ומלהיבות להדמיה ומחקר על חלבוני השפעה אחרים המיוצרים על ידי חיידקים במהלך זיהום. השיטה מותאמת גם בקלות עבור תיוג של וירוסים, מדגים את השירות הרחב שלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ מהשלוחה הרפואית של אוניברסיטת טקסס, גלווסטון, טקסס, ופרס טקסס סטאר ל- L.J.K. אנו מודים לפרופ' אדוארד למקה (המעבדה האירופית לביולוגיה מולקולרית, היידלברג, גרמניה) על פלסמיד pEVOL-PylRS-AF. התמונות באיור 1 נוצרו באמצעות BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Tags

ביולוגיה גיליון 192 סלמונלה חומצות אמינו לא קנוניות הרחבת קוד גנטי SseJ סופר-רזולוציה dSTORM
הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, M. K., Kenney, L. J.… More

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter