Summary
Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)
Abstract
Type drie secretiesystemen (T3SSs) stellen gramnegatieve bacteriën in staat om een batterij effectoreiwitten rechtstreeks in het cytosol van eukaryote gastheercellen te injecteren. Bij binnenkomst moduleren de geïnjecteerde effectoreiwitten coöperatief eukaryote signaalroutes en herprogrammeren ze cellulaire functies, waardoor bacteriële toegang en overleving mogelijk wordt. Het monitoren en lokaliseren van deze uitgescheiden effectoreiwitten in de context van infecties biedt een voetafdruk voor het definiëren van de dynamische interface van gastheer-pathogeen interacties. Het labelen en in beeld brengen van bacteriële eiwitten in gastheercellen zonder hun structuur / functie te verstoren, is echter technisch een uitdaging.
Het construeren van fluorescerende fusie-eiwitten lost dit probleem niet op, omdat de fusie-eiwitten het secretoire apparaat blokkeren en dus niet worden uitgescheiden. Om deze obstakels te overwinnen, hebben we onlangs een methode gebruikt voor locatiespecifieke fluorescerende etikettering van bacteriële uitgescheiden effectoren, evenals andere moeilijk te labelen eiwitten, met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE). Dit artikel biedt een compleet stap-voor-stap protocol om Salmonella uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van GCE site-specifiek, gevolgd door aanwijzingen voor het afbeelden van de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)
Recente bevindingen suggereren dat de opname van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) via GCE, gevolgd door bio-orthogonale etikettering met tetrazine-bevattende kleurstoffen, een levensvatbare techniek is voor selectieve etikettering en visualisatie van bacteriële uitgescheiden eiwitten en daaropvolgende beeldanalyse in de gastheer. Het doel van dit artikel is om een eenvoudig en duidelijk protocol te bieden dat kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het uitvoeren van superresolutiebeeldvorming met behulp van GCE om verschillende biologische processen in bacteriën en virussen te bestuderen, evenals gastheer-pathogeen interacties.
Introduction
Bacteriële infecties worden al lang beschouwd als een ernstig gevaar voor de menselijke gezondheid. Pathogenen gebruiken hoogontwikkelde, extreem krachtige en ingewikkelde afweersystemen, evenals een verscheidenheid aan bacteriële virulentiefactoren (aangeduid als effectoreiwitten) om immuunresponsen van de gastheer te ontwijken en infecties vast te stellen 1,2. De moleculaire mechanismen die aan deze systemen ten grondslag liggen en de rol van individuele effectoreiwitten zijn echter nog grotendeels onbekend vanwege het gebrek aan geschikte benaderingen voor het direct volgen van de cruciale eiwitcomponenten en effectoren in gastheercellen tijdens pathogenese.
Een typisch voorbeeld is Salmonella enterica serovar Typhimurium, dat acute gastro-enteritis veroorzaakt. Salmonella Typhimurium maakt gebruik van type drie secretiesystemen (T3SS) om een verscheidenheid aan effectoreiwitten rechtstreeks in gastheercellen te injecteren. Zodra Salmonella de gastheercel binnenkomt, bevindt het zich in een zuur membraangebonden compartiment, de Salmonella-bevattende vacuole (SCV)3,4 genoemd. De zure pH van de SCV activeert het Salmonella pathogeniciteitseiland 2 (SPI-2)-gecodeerde T3SS en transloceert een volley van 20 of meer effectoreiwitten over het vacuolaire membraan in het gastheercytosol 5,6,7,8. In de gastheer manipuleren deze complexe cocktails van effectoreiwitten coördinerend de signaleringsroutes van gastheercellen, wat resulteert in de vorming van zeer dynamische, complexe buisvormige membraanstructuren die zich vanuit de SCV uitstrekken langs microtubuli, Salmonella-geïnduceerde filamenten (SIFs) genoemd, die Salmonella in staat stellen te overleven en zich te repliceren in de gastheercellen9,10,11.
Methoden om bacteriële effectorlokalisaties te visualiseren, te volgen en te monitoren, en hun handel en interacties in gastheercellen te onderzoeken, bieden kritisch inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan bacteriële pathogenese. Het labelen en lokaliseren van Salmonella uitgescheiden T3SS effector eiwitten in gastheercellen is een technologische uitdaging gebleken12,13; Niettemin heeft de ontwikkeling van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten ons vermogen om eiwitten in levende systemen te bestuderen en te visualiseren getransformeerd. De grootte van fluorescerende eiwitten (~25-30 kDa)15 is echter vaak vergelijkbaar met of zelfs groter dan die van het betreffende eiwit (POI; bijv. 13,65 kDa voor SsaP, 37,4 kDa voor SifA). In feite blokkeert fluorescerende eiwitetikettering van effectoren vaak de secretie van de gelabelde effector en blokkeert de T3SS14.
Bovendien zijn fluorescerende eiwitten minder stabiel en zenden ze een laag aantal fotonen uit vóór het fotobleken, waardoor hun gebruik in superresolutiemicroscopische techniekenwordt beperkt 16,17,18, met name in fotoactivatielokalisatiemicroscopie (PALM), STORM en gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Hoewel de fotofysische eigenschappen van organische fluorescerende kleurstoffen superieur zijn aan die van fluorescerende eiwitten, vereisen methoden / technieken zoals CLIP / SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH / FlAsH 22,23 en HA-Tags 24,25 een extra eiwit- of peptideaanhangsel dat de structuurfunctie van het effectoreiwit van belang kan schaden door te interfereren met posttranslationele modificatie of handel. Een alternatieve methode die noodzakelijke eiwitmodificatie minimaliseert, omvat de opname van ncAAs in een POI tijdens translatie via GCE. De ncAAs zijn fluorescerend of kunnen fluorescerend worden gemaakt via klikchemie 12,13,26,27,28.
Met behulp van GCE kunnen ncAAs met kleine, functionele, bio-orthogonale groepen (zoals een azide, cyclopropeen of cyclooctynegroep) op bijna elke locatie in een doeleiwit worden geïntroduceerd. In deze strategie wordt een inheems codon verwisseld met een zeldzaam codon zoals een amber (TAG) stopcodon op een bepaalde positie in het gen van de POI. Het gemodificeerde eiwit wordt vervolgens tot expressie gebracht in cellen naast een orthogonaal aminoacyl-tRNA-synthetase/tRNA-paar. De actieve tRNA-synthetaseplaats is ontworpen om slechts één bepaalde ncAA te ontvangen, die vervolgens covalent wordt bevestigd aan het 3'-uiteinde van het tRNA dat het ambercodon herkent. De ncAA wordt eenvoudig in het groeimedium ingebracht, maar het moet door de cel worden opgenomen en het cytosol bereiken waar het aminoacyl-tRNA-synthetase () het kan koppelen aan het orthogonale tRNA; het wordt vervolgens op de opgegeven locatie in de POI opgenomen (zie figuur 1)12. GCE maakt dus locatiespecifieke opname mogelijk van een overvloed aan bio-orthogonale reactieve groepen zoals keton, azide, alkyn, cyclooctyne, transcycloocteen, tetrazine, norboneen, α, β-onverzadigde amide en bicyclo [6.1.0]-nonyne in een POI, waardoor mogelijk de beperkingen van conventionele eiwitetiketteringsmethodenworden overwonnen 12,26,27,28.
Recente opkomende trends in beeldvormingstechnieken met superresolutie hebben nieuwe wegen geopend om biologische structuren op moleculair niveau te onderzoeken. In het bijzonder is STORM, een op lokalisatie gebaseerde techniek met één molecuul, superresolutie, een waardevol hulpmiddel geworden om cellulaire structuren tot ~ 20-30 nm te visualiseren en is in staat om biologische processen één molecuul per keer te onderzoeken, waardoor de rollen van intracellulaire moleculen worden ontdekt die nog onbekend zijn in traditionele ensemble-gemiddelde studies13 . Single-molecule en superresolutietechnieken vereisen een kleine tag met heldere, fotostabiele organische fluoroforen voor de beste resolutie. We hebben onlangs aangetoond dat GCE kan worden gebruikt voor het opnemen van geschikte sondes voor beeldvorming met superresolutie12.
Twee van de beste keuzes voor eiwitetikettering in cellen zijn bicyclo [6.1.0] nonynelysine (BCN) en trans-cycloocteen-lysine (TCO; weergegeven in figuur 1), die genetisch gecodeerd kunnen zijn met behulp van een variant van het tRNA / synthetase-paar (hier tRNA Pyl / PylRS AF genoemd), waarbijPyl pyrrolysine vertegenwoordigt enAF een rationeel ontworpen dubbele mutant (Y306A, Y384F) afgeleid van Methanosarcina mazei die van nature codeert voor pyrrolysine12, 29,30,31. Door de spanningsbevorderde inverse elektronenvraag Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC) reactie, reageren deze aminozuren chemoselectief met tetrazine conjugaten (Figuur 1)12,30,31. Dergelijke cycloadditiereacties zijn uitzonderlijk snel en compatibel met levende cellen; Ze kunnen ook fluorogeen zijn, als een geschikte fluorofoor is gefunctionaliseerd met het tetrazinedeel12,26,32. Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd protocol voor het monitoren van de dynamiek van bacteriële effectoren die in gastheercellen worden afgeleverd met behulp van GCE, gevolgd door subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen met behulp van dSTORM. De resultaten geven aan dat opname van een ncAA via GCE, gevolgd door een klikreactie met fluorogene tetrazine-dragende kleurstoffen, een veelzijdige methode is voor selectieve etikettering, visualisatie van uitgescheiden eiwitten en daaropvolgende subcellulaire lokalisatie in de gastheer. Alle componenten en procedures die hier worden beschreven, kunnen echter worden aangepast of vervangen, zodat het GCE-systeem kan worden aangepast om andere biologische vragen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmide constructie
- Kloon het gen dat de POI tot expressie brengt in een expressieplasmide (bijv. pET28a-sseJ 10TAG) dat de POI tot expressie brengt in E. coli BL21 (DE3). Deze stap vergemakkelijkt bij het bepalen of de mutanten functioneel zijn.
- Voor de visualisatie van Salmonella uitgescheiden effectoren in gastheercellen, construeer een expressieplasmide (pWSK29-sseJ-HA) dat de doel-POI SseJ uitdrukt onder de controle van zijn inheemse promotor, zoals beschreven in eerdere rapporten 7,12,24. Vervang met behulp van plaatsgerichte mutagenese het codon van fenylalanine-10 door een amber codon (TAG) in SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), waarbij het AAT-TAG-ACT-motief 33,34 wordt gewaarborgd.
- Gebruik naast de bovenstaande plasmiden voor de genetische opname van trans-cyclooct-2-en-L-lysine (TCO*A) in een POI een ander expressieplasmide (pEVOL-PylRS-AF)31 dat het geëvolueerde tRNA/synthetasepaar (tRNAPyl/PylRS AF ) genen bevat die gecodeerd zijn in het plasmide pEVOL.
OPMERKING: Gedetailleerde beschrijvingen van het plasmide en de kloonprotocollen zijn beschreven in het vorige rapport30,31. - Gebruik in de handel verkrijgbare plasmidebereidingskits om hoogwaardig plasmide-DNA te verkrijgen. Voor gezuiverd DNA is de optimale 260/280-verhouding ~1,8. Controleer de DNA-zuiverheid met behulp van 1% agarosegel-elektroforese, indien nodig.
2. Bereiding van de bacteriecultuur
- Het verkrijgen van dubbele transformanten om te testen of de mutant functioneel is in E. coli
- Neem BL21 competente cellen uit -80 °C en ontdooi op ijs gedurende ongeveer 20-30 minuten.
- Meng 1-5 μL van elk plasmide (~50 ng pEVOL-PylRS-AF en pET28a-sseJ 10TAG) met 200 μL chemisch competente BL21-cellen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Meng de competente cellen en het plasmidemengsel voorzichtig; Incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Hitteschok van de microcentrifugebuis in een waterbad van 42 °C gedurende 45 s. Leg de buizen 2 minuten terug op ijs.
- Voeg 1 ml warm LB-medium toe aan de microcentrifugebuis en breng het mengsel snel over in een conische buis van 15 ml. Incubeer de cellen bij 37 °C in een schudder bij 250 tpm gedurende 1 uur. Plaats een deel of alle getransformeerde cellen op LB-agarplaten die geschikte antibiotica bevatten. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
OPMERKING: In dit protocol werden respectievelijk 35 μg/ml chlooramfenicol en 50 μg/ml kanamycine gebruikt voor het selecteren van pEVOL-PylRS-AF en pET28a-sseJ 10TAG. Evalueer in de transformatiestap de succesvolle transformatie met behulp van negatieve en positieve controles.
- Breng de mutant over naar Salmonella voor de visualisatie van Salmonella uitgescheiden effectoren in gastheercellen:
- Voeg 2-3 μL elk van pEVOL-PylRS-AF en pWSK29-sseJ 10TAG toe aan 40-60 μL elektrocompetente Salmonella Typhimurium stam 14028s in een gekoelde microcentrifugebuis. Meng het mengsel voorzichtig met een pipet.
- Breng het elektroporatiemengsel over in een gekoelde (0,2 cm elektrodespleet) cuvette; stel de elektroporatie-instellingen in op 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Plaats de cuvette in de elektroporatiekamer. Zorg ervoor dat de kamerelektrode stevig contact maakt met de micropulsercuvette.
- Houd de pulsknop ingedrukt totdat deze piept.
- Voeg onmiddellijk 1 ml warm LB-medium toe aan de cuvette. Breng de volledige inhoud over in een conische buis van 15 ml. Incubeer de cellen bij 37 °C met schudden bij 250 rpm gedurende 1 uur.
- Plak een deel of het geheel van het elektroporatiemengsel van Salmonella op een LB-agarplaat met geschikte antibiotica. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
OPMERKING: In dit protocol werden respectievelijk 35μg/ml chlooramfenicol en 100 μg/ml ampicilline gebruikt voor de selectie van pEVOL-PylRS-AFand pWSK29-sseJ 10TAG.
- Cultuurvoorbereiding
- Ent een enkele kolonie Salmonella of E. coli in 5 ml LB-medium met geschikte antibiotica. Groei 's nachts bij 37 °C, schudden bij 250 tpm.
3. Expressie en fluorescerende etikettering van ncAA-dragende eiwitten
- Expressie van ncAA-dragende eiwitten in E. coli
- Breng 100 μL primaire cultuur over in 5 ml LB-medium (1:50 verdunning) met 35 μg/ml chlooramfenicol en 50 μg/ml kanamycine, gevolgd door incubatie bij 37 °C met schudden bij 250 rpm tot OD600 0,4-0,6 bereikt.
- Bereid 1 mM TCO*A stockoplossing (10 ml; Tabel 1).
- Wanneer de culturen OD600 = 0,4-0,6 bereiken, vervangt u de LB-media door vers LB met 1 mM TCO * A, 35 μg / ml chlooramfenicol en 50 μg / ml kanamycine.
OPMERKING: Als alternatief kan TCO*Een voorraadoplossing worden bereid zoals beschreven in stap 5.4.2. - Induceer eiwitexpressie in aanwezigheid van 1 mM IPTG, 0,2% arabinose en schud 's nachts bij 34 °C, 250 tpm. Oogst de bacteriële cellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 11.000 × g. Verwijder het supernatant en vries de pellet in bij -20 °C tot verder gebruik.
- Voor een controle-experiment herhaalt u hetzelfde experiment, maar drukt u de ncAA-dragende eiwitten uit in afwezigheid van de ncAA. Voor in vitro fluorescerende etikettering van ncAA-dragende eiwitten in E. coli volgt u de gedetailleerde procedure beschreven in stap 3.3.
- Expressie van ncAA-dragende eiwitten in Salmonella
- Breng 100 μL primaire cultuur over in 5 ml LB-medium (1:50 verdunning) met 35 μg/ml chlooramfenicol en 100 μg/ml ampicilline, gevolgd door incubatie bij 37 °C met schudden bij 250 rpm tot OD600 0,6 bereikt.
- Bereid gemodificeerd N-minimaal medium (MgM, pH 5.6) zoals beschreven in tabel 1.
- Vervang het LB-medium door gemodificeerd N-minimal medium (MgM) aangevuld met 1 mM TCO*A (tabel 1). Kweek de bacteriën gedurende 30 minuten bij 34 °C. Voeg vervolgens 0,2% arabinose, 25 mg / ml chlooramfenicol en 100 mg / ml ampicilline toe en laat de cellen nog eens 6 uur groeien, schuddend bij 250 tpm.
- Na 6 uur was u de bacteriën 4x over een interval van 30 minuten, met verse MgM (pH 5,6) media (tabel 1) zonder ncAA. Gebruik in de wasstappen 972 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de bacteriën, resuspendien in 1x PBS-buffer en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C in het donker om overtollige ncAAs te verwijderen. Na 1 uur centrifugeert u de bacteriën bij 3.000 × g, 4 °C gedurende 15 minuten en bewaart u deze voor verder gebruik.
- Voor een controle-experiment herhaalt u hetzelfde experiment door ncAA-dragende eiwitten tot expressie te brengen in afwezigheid van ncAA.
- In vitro fluorescentie labeling van ncAA-dragende eiwitten in Salmonella Typhimurium
- Resuspendie Salmonella cellen die SseJ-F10TCO-HA tot expressie brengen bij afwezigheid of aanwezigheid van TCO*A (vanaf stap 3.2) in 1x PBS. Stel de OD600 in PBS in op 4. Incubeer de cellen met 20 μM Janelia Fluor 646-tetrazine (JF646-Tz) of 20 μM BDP-Fl-tetrazine (5 mM stockoplossingen in DMSO) bij 37 °C in het donker en schud gedurende 1-2 uur bij 250 tpm.
- Pellet de cellen, was 3-4x met PBS met 5% DMSO en 0,2% Pluronic F-127, resuspendien in PBS met 5% DMSO en incubeer 's nachts bij 4 °C in het donker. Was 2x opnieuw met 1x PBS. Gebruik in de wasstappen 972 × g, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Beeld de cellen onmiddellijk af met een confocale microscoop of fixeer ze met 1,5% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de vaste cellen 2x met PBS en tenslotte in 50 mM NH4Cl in PBS gedurende 15 min om overtollig PFA te verwijderen. Resuspendie van de cellen in PBS en bewaren bij 4 °C gedurende niet meer dan 3-4 dagen. Stel de bacteriën in beeld met behulp van confocale microscopie zoals beschreven in rubriek 6.
4. Biochemische karakterisering van ncAA-dragende eiwitten
- Cellyse
- Resuspendeer de cellen uit rubriek 3.1 in lysisbuffer (tabel 1) en incubeer gedurende meer dan 30 minuten bij kamertemperatuur. Laat het mengsel 15 minuten op ijs afkoelen.
OPMERKING: Houd de verhouding tussen lysisbuffer en celgewicht op 1:10. - Soniceer de geresuspendeerde cellen terwijl ze nog op ijs zijn. Puls gedurende 30 s bij instelling 7 ten minste 6x, met 1 minuut openingen, met behulp van een sonicator (zie de tabel met materialen).
- Draai het cellysaatlysaat af bij 20.500 × g, 4 °C gedurende 15 minuten (handhaving van 4 °C is van cruciaal belang). Breng het supernatant over in een verse buis en gooi de pellet weg.
- Resuspendeer de cellen uit rubriek 3.1 in lysisbuffer (tabel 1) en incubeer gedurende meer dan 30 minuten bij kamertemperatuur. Laat het mengsel 15 minuten op ijs afkoelen.
- SDS-PAGE analyse
- Bereid 5x SDS loading dye voor (tabel 1). Voeg 5 μL SDS-gellaadbuffer toe aan 13 μL cellysaat. Denatureer de eiwitten met natriumdodecylsulfaat (SDS) monsterbuffer in een buis van 2 ml bij 95 °C gedurende 10 minuten, centrifugeer het mengsel bij 2.000 × g gedurende 50 s en laad het op een 12% SDS polyacrylamidegel.
- Monteer de gelcassette, plaats deze in een gel-elektroforese-apparaat en sluit het elektroforese-apparaat aan op een elektrische voeding. Giet de lopende buffer, laad de moleculaire gewichtsmarkers en eiwitmonsters en laat de gel op 100 V lopen, totdat het broomfenol de bodem van de oplossende gel bereikt.
OPMERKING: Begin onmiddellijk met de analyse, omdat lysaten die bij -20 °C worden bewaard, de neiging hebben om na elke vries-dooicyclus kwaliteit te verliezen. - Bevlek de gel met Coomassie blue protein stain.
5. Bio-orthogonale etikettering van Salmonella uitgescheiden effector SseJ-F10TCO-HA in HeLa-cellen
- Kweek en onderhoud HeLa-cellen bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid in een hoog glucosegehalte (4,5 g / L) Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM), aangevuld met 10% (v / v) FBS naast Penicilline-Streptomycine (1x).
- Kweek bacteriën 1 dag voor infectie. Ent een enkele kolonie Salmonella 14028's met pEVOL-PylRS-AF en pWSK29-sseJ 10TAG in 5 ml antibioticahoudende standaard LB-bouillon gedurende een nacht bij 37 °C, schuddend bij 250 tpm.
- Zaad HeLa-cellen 1 dag voor infectie. Neem een weefselkweekkolf (T-75) met HeLa-cellen met ~ 80% confluentie, zoals bepaald door microscopisch onderzoek van de celdichtheid. Was de cellen met warme PBS. Maak de cellen los met 3 ml warm 0,25% trypsine/EDTA gedurende 5 minuten bij 37 °C, 5% CO2.
- Blus de trypsine met 2 ml DMEM (+ 10% FBS). Breng de volledige inhoud van de kolf over in een buis van 15 ml na het opnieuw suspendidateren van de cellen. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 1.000 × g naar beneden. Haal het supernatant uit de buis. Resuspendie van de HeLa-celkorrel in voorverwarmd groeimedium.
- Gebruik een hemocytometer om de suspensie te onderzoeken en de aanwezige cellen te tellen. Bereid een verdunde celvoorraad bij 1 × 105 cellen/ml. Zaad 0,5 × 105 HeLa-cellen per put in 500 μL DMEM + 10% FBS-groeimedium in een acht-putkamerschuif. Houd de kamerschuif in een incubator op 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid gedurende 24 uur.
- Bacteriële infectie
- Subcultuur Salmonella 14028s met pEVOL-PylRS-AF en pWSK29-sseJ 10TAG, door 100 μL nachtelijke bacteriecultuur (vanaf stap 5.2) te verdunnen tot 3 ml LB-medium (1:30 verdunning) met 35 μg/ml chlooramfenicol en 100 μg/ml ampicilline, gevolgd door incubatie bij 37 °C met schudden bij 250 tpm gedurende 5-7 uur.
OPMERKING: Tijdens deze fase bereiken de culturen de late exponentiële fase en zijn de bacteriën zeer invasief. - Bereid 100 mM TCO*A stockoplossing en complete media (tabel 1).
- Om de HeLa-celinfectie te initiëren, haalt u de HeLa-cellen uit de couveuse en wast u de cellen met voorverwarmde DPBS voordat u 500 μL verse DMEM (+10% FBS) aan elke put toevoegt. Plaats de kamerschuif terug in de CO 2-couveuse totdat de infectie begint.
- Verdun na 5-7 uur incubatie de Salmonella-cultuur tot OD600 = 0,2 in 1 ml DMEM-groeimedium (~3 × 108 kve/ml). Voeg de vereiste hoeveelheden van het Salmonella-entmateriaal toe in elk putje van de kamerschuif, zodat de veelheid van infectie (MOI) 100 is.
- Incubeer de geïnfecteerde cellen in een CO2-incubator gedurende 30 minuten. Was de cellen 3x met voorverwarmde DPBS om extracellulaire Salmonella te verwijderen. Stel dit tijdspunt in op 0 uur na infectie. Voeg gedurende 1 uur 500 μl volledig medium (tabel 1) met 100 μg/ml gentamicine toe. Was na 1 uur de cellen 3x met DPBS. Voeg 500 μL van het volledige medium toe (vanaf stap 5.4.2; Tabel 1) aangevuld met 0,2% arabinose, 10 μg/ml gentamicine op elk putje van de kamerschuif.
- Voer in een controle-experiment vergelijkbare infecties van HeLa-cellen uit zonder TCO * A.
- Incubeer de kamerschuif gedurende 10 uur in de CO 2-incubator.
- Subcultuur Salmonella 14028s met pEVOL-PylRS-AF en pWSK29-sseJ 10TAG, door 100 μL nachtelijke bacteriecultuur (vanaf stap 5.2) te verdunnen tot 3 ml LB-medium (1:30 verdunning) met 35 μg/ml chlooramfenicol en 100 μg/ml ampicilline, gevolgd door incubatie bij 37 °C met schudden bij 250 tpm gedurende 5-7 uur.
- Op chemie gebaseerde labeling in levende cellen
- Ga verder met het labelen van de met bacteriën geïnfecteerde cellen. Verwarm het volledige medium voor zonder TCO*A (tabel 1).
- Vervang na 10 h na infectie het volledige medium door vers compleet medium zonder TCO*A en was de HeLa-cellen 4x over een interval van 30 min elk met voorverwarmde DPBS, gevolgd door vers compleet medium (zonder TCO*A).
- Bereid een 0,5 mM kleurstof-tetrazine stamoplossing in DMSO.
OPMERKING: Voor het labelen van Salmonella uitgescheiden effectoren in gastheercellen worden twee protocollen gepresenteerd. Bereid voor protocol 1 het kleurstofmengsel door JF646-Tz-bouillon te verdunnen in 1x PBS met 1% caseïnenatriumzout uit rundermelk, zodat de uiteindelijke werkoplossing 2 μM is. Bereid voor protocol 2 warm compleet medium (zonder FBS en TCO*A) en voeg 2 μM JF646-Tz toe. Maak dit kleurstofmengsel vers voor elke etiketteringssessie. Werk indien mogelijk in het donker (dim de lichten in de kap en/of de kamer). - Na 12 uur na infectie, zuig het medium uit de cellen. Was de cel met voorverwarmde DPBS 2x of 3x. Voeg in een groep putjes 500 μL van het in protocol 1 beschreven mengsel van de kleurstofoplossing toe en voeg in een andere groep putjes van dezelfde kamerschuif 500 μL van het in protocol 2 beschreven mengsel van de kleurstofoplossing en de opmerking daarna toe. Plaats de kamerschuifjes gedurende 1,5-2 uur terug in de CO 2-incubator.
- Na 13,5-14 uur na infectie spoelt u de HeLa-cellen 2x met voorverwarmde DPBS. Voeg 500 μL verse DMEM (aangevuld met FBS) toe. Plaats de kamerschuif gedurende 30 minuten terug in de incubator. Was de cellen met voorverwarmde DPBS gevolgd door verse DMEM 4x over een interval van 30 min.
- Bevestig de HeLa-cellen 16 uur na infectie met PFA door 200 μL 4% PFA in elke put toe te voegen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker te broeden. Zuig de PFA af, spoel 3x af met PBS en bewaar de cellen in PBS bij 4 °C in het donker.
OPMERKING: PFA is een zeer giftige chemische stof. Vermijd inademing, evenals huid- en oogcontact. Draag beschermende uitrusting bij het hanteren. Om te voorkomen dat het gelabelde monster wordt blootgesteld aan licht, schakelt u het licht in de celkweekkap uit.
- Immunostaining van HA-gelabelde eiwitten
- Zuig de PBS af en spoel eenmaal af in de blokkeeroplossing (tabel 1).
- Incubeer de vaste HeLa-cellen met een op PBS gebaseerde primaire antilichaamoplossing (tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Gebruik een konijn anti-HA primair antilichaam om uitgescheiden SseJ te kleuren (1:500 verdunning).
- Was na 1 uur de cellen 2x voorzichtig met 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS. Incubeer tijdens de wasbeurten met Tween/PBS-oplossing de cellen 3x met 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS gedurende 5 minuten.
- Verdun secundair antilichaam ezel anti-konijn 555 1:500 in secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Was na 1 uur de cellen 2x voorzichtig met 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS en incuber 2x met 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS gedurende 5 minuten.
- Was de cellen 3x met 0,5 ml 1x PBS en bewaar ze bij 4 °C in het donker.
OPMERKING: Vaste cellen kunnen een paar weken worden bewaard in PBS bij 4 °C. Immunostaining moet op het laatste moment worden uitgevoerd.
6. Confocale beeldvorming
- Gebruik een confocale microscoop, zoals een draaiende schijf (SD) of een STED-microscoop.
- Pas de instellingen voor beeldacquisitie aan, zoals scanmodus (XYZ), scansnelheid (400 Hz), resolutie (512 x 512), vergroting (100x) en Z-stacking.
- Gebruik de juiste excitatie-/emissiefilters voor DAPI, BDP-Tz en JF646 tetrazine.
OPMERKING: Voor dit protocol werd confocale beeldvorming uitgevoerd op een STED-microscoopsysteem uitgerust met een gepulseerde witlichtlaser, waardoor de selectie van excitatie in het bereik van 470-670 nm en een UV 405 nm-diodelaser voor excitatie bij 405 nm, 488 nm en 647 nm mogelijk was. De juiste emissiebereiken werden opgezet met behulp van de ingebouwde acousto-optische bundelsplitser in combinatie met een op prisma's gebaseerde afstembare multiband spectrale detectie van het confocale systeem. - Verkrijg de beelden met behulp van een 100×/1.4 olie-onderdompelingsobjectief.
7. Super-resolutie (dSTORM) beeldvorming
- Zet de microscoop 3 uur voor de beeldvorming aan om thermisch evenwicht mogelijk te maken (drift is waarschijnlijker als de beeldvorming hiervoor begint). Koel de camera af tot -70 °C.
- Bereid ondertussen een nieuwe GLOX-BME-beeldvormingsbuffer voor (tabel 1).
- Breng de cellen naar de microscoop. Plaats de beeldvormingskamer op het microscoopstadium in de monsterhouder. Zorg ervoor dat het monster in de houder vlak en veilig is. Verander het medium in de put met 0,4 ml van de vers gemaakte GLOX-BME beeldvormingsbuffer.
- Stel de juiste laserlijn en filtersets in. Verlaag het laservermogen tot ~ 1 mW om een HeLa-cel van belang te identificeren. Pas het brandpuntsvlak en de laserstraalhoek aan terwijl u het monster verlicht met lage laserdichtheden van 647 nm (in dit geval wordt een steil hellende hoek [HILO] voorgesteld, omdat HILO het signaal-naar-achtergrond verhoogt [SBR]). Pas de HILO-verlichtingshoek aan.
OPMERKING: In dit protocol werd superresolutiebeeldvorming van SseJ verkregen in het Alexa Fluor 647-kanaal met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop (zie de materiaaltabel), uitgerust met een TIRF-objectief (100x Apo TIRF-olie-onderdompelingsobjectief, NA 1.49). Fluorescentie werd gedetecteerd met een EMCCD-camera, die werd bestuurd via μManager. - Stel de versterking van de voorversterker in op 3 en activeer de frameoverdracht in μManager. Stel EM-gain in op 200 voor een hogere gevoeligheid in dSTORM-metingen, zoals beschreven in een eerder rapport35.
- Leg voorafgaand aan dSTORM-beeldvorming een referentie-diffractie-beperkte afbeelding van de doelstructuur vast. Schakel de fluoroforen naar de donkere toestand door de laser op zijn maximale vermogen in te schakelen.
OPMERKING: Individuele, snel knipperende moleculen van JF646-fluoroforen werden waargenomen toen JF646-fluoroforen werden getransformeerd naar een overwegend donkere toestand door continue verlichting van 647 nm excitatielicht, zoals eerder beschreven36. - Stel de lasersterkte in op een geschikt niveau waar knipperende gebeurtenissen worden gescheiden in ruimte en tijd, stel de belichtingstijd in op 30 ms en begin met de acquisitie. Schaf 10.000-30.000 frames aan.
OPMERKING: Wijzigingen in de lasersterkte moeten worden aangebracht om het knipperen te optimaliseren. Overweeg de laserintensiteit te verhogen als er te veel gebeurtenissen (knipperende deeltjes die elkaar overlappen) worden gedetecteerd. De ideale lengte hangt af van de kwaliteit van het monster, maar ~ 10.000 frames moeten waarneembare kenmerken vertonen.
8. Beeldreconstructie van dSTORM
- Gebruik geschikte software voor beeldanalyse.
OPMERKING: ThunderSTORM, een van de vele open-source beeldreconstructieprogramma's die beschikbaar zijn, wordt hieronder kort beschreven. - Open ImageJ en importeer de onbewerkte gegevens. Open de ThunderSTORM-plug-in en configureer de camera-instelling die overeenkomt met het apparaat.
- Ga naar Analyse uitvoeren en stel de juiste instellingen in, zoals beeldfiltering (verschil in middelingsfilters), lokalisatiemethoden (lokaal maximum) en subpixellokalisatie van moleculen (geïntegreerde Gaussische PSF). Klik op OK om de reconstructie van de afbeelding te starten.
OPMERKING: Indien nodig zijn er al gedetailleerde instructies beschreven voor het instellen van de parameters in ThunderSTORM37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocolartikel beschrijft een GCE-gebaseerde methode voor locatiespecifieke fluorescerende etikettering en visualisatie van Salmonella-uitgescheiden effectoren, zoals weergegeven in figuur 1. De chemische structuur van de ncAA dragende trans-cycloocteen bioorthogonale groep (TCO) en de fluorescerende kleurstof zijn weergegeven in figuur 1A. SseJ-labeling werd bereikt door genetische incorporatie van bioorthogonale ncAAs bij een amber stopcodon (zie figuur 1B) met behulp van een orthogonale aminoacyl-tRNA-synthetase / tRNA-paren via GCE-technologie. Behandeling van TCO-gelabelde effectoren met het tetrazine dat een fluorofoor (JF646-Tz of BDP-Tz) bevatte, leverde een alternatieve eiwitetiketteringsstrategie op die de observatie van getransloceerde Salmonella-uitgescheiden effectoren vele uren na infectie van de gastheer mogelijk maakte (figuur 1B, C). We begonnen met het identificeren van mogelijke aminozuurresiduen en selecteerden positie 10 van SseJ voor ncAA-inclusie op basis van oppervlaktetoegankelijkheid en bestaande kennis van SseJ-functionele residuen. Eerdere structurele gegevens en oppervlakteblootstellingsprojecties kunnen helpen bij de selectie van specifieke locaties.
De plaatsing van het amberkleurige codon in het gen dat codeert voor de POI beïnvloedt de werkzaamheid van TCO-incorporatie. Als gevolg hiervan moet een reeks mutanten met amberkleurige codons op verschillende posities van het gen van de POI worden gemaakt en geanalyseerd voor optimale integratie-efficiëntie. De selectie van de positie van het ambercodon is empirisch. Over het algemeen moeten de gewijzigde residuen niet-essentieel zijn voor de POI-functie, verstoken van posttranslationele modificaties en toegankelijk voor fluorescerende sondes. De expressie plasmide moet een laag kopienummer zijn, zodat het het oorspronkelijke kopienummer van de POI nabootst. De codoncontext beïnvloedt hoe effectief een ncAA wordt opgenomen door een orthogonaal tRNA / aminoacyl-tRNA-synthetasesysteem. Hoewel AAT-TAG-ACT de voorkeurscontext van het orthogonale tRNA is, werd de positie van fenylalanine-10 van sseJ gewijzigd in TAG, waardoor de AAT-TAG-ACT-context werd gewaarborgd voor het mogelijk maken van de meest effectieve integratie van de ncAA. Eerst testten we of de mutanten functioneel waren in E. coli met behulp van een plasmide met een hoog kopienummer om sseJ tot expressie te brengen. Zoals blijkt uit SDS-PAGE, was de expressie van SseJ-F10TCO-HA-mutanten afhankelijk van de aanwezigheid van TCO*A en het overeenkomstige optimale tRNA/(figuur 2A). SseJ-F10FCO-HA werd gelabeld met JF646-Tz met behulp van SPIEDAC-klikchemie in E. coli. De selectieve fluorescerende etikettering van SseJ-F10TCO-HA in E. coli in vitro werd bevestigd door fluorescentiemicroscopieanalyse (figuur 2B). Met behulp van GCE werd TCO*A dus locatiespecifiek opgenomen in een amber codon in sseJ. Pogingen om genomische off-target integratie van ncAAs direct te identificeren met behulp van tRNAPyl/PylRS AF-systeem leverden geen bewijs op voor hun bestaan. We raden echter aan om in-gel fluorescentie, Western blot, fluorescerend fusie-eiwit, in vitro fluorescentie-etikettering en andere methoden te gebruiken om de efficiëntie, specificiteit, mate van off-target opname en toxiciteit van het pEVOL-plasmide te beoordelen, zoals gedocumenteerd in eerder gerapporteerde artikelen die hierinworden geciteerd 12,29.
Nadat we hadden vastgesteld dat de onderdrukte TAG in sseJ functioneel was, kloonden we sseJ-F10TCO-HA samen met zijn native promotor in het plasmide met laag kopieernummer pWSK29, waardoor een AAT-TAG-ACT-motief voor fluorescerende etikettering en visualisatie werd gegarandeerd. In vitro selectieve etikettering van SseJ-F10TCO-HA in Salmonella-cellen werd bevestigd met behulp van fluorescentiemicroscopie (figuur 3). Vervolgens infecteerden we HeLa-cellen met de wild-type Salmonella-stam aangevuld met p sseJ-HA of psseJ10TAG-HA, in afwezigheid of aanwezigheid van TCO * A om te bepalen of de TCO-geïncorporeerdeSseJ kon worden getransloceerd in gastheercellen. Geïnfecteerde HeLa-cellen werden gefixeerd met PFA en immunogekleurd met anti-HA-antilichaam 16 uur na infectie om de SIFs versierd door SseJ te benadrukken. Zoals te zien is in figuur 4C, werd SseJ-F10TCO-HA duidelijk uitgescheiden, werden SseJ-afhankelijke SIF's gevormd en leken ze op die waargenomen in wild-type geïnfecteerde cellen (figuur 4A). SseJ-afhankelijke SIF's werden echter niet waargenomen in afwezigheid van TCO*A (figuur 4B). Deze waarnemingen toonden aan dat de expressie van sseJ-F10TCO-HA met behulp van GCE SseJ-afhankelijke SIF's redde. Bovendien gaven de resultaten ook aan dat SseJ-F10TCO-HA een volledig functionele virulentiefactor was voor Salmonella.
Nadat we hadden bevestigd dat de GCE-gelabelde SseJ functioneel en uitgescheiden was, gebruikten we de SPIEDAC-reactie om SseJ-F10TCO-HA te labelen met JF646-Tz in HeLa-cellen. Om dit te doen, infecteerden we HeLa-cellen met wild-type Salmonella aangevuld met p sseJ-F10TCO-HA, in aanwezigheid van TCO * A. Na labeling met JF646-Tz met behulp van twee alternatieve protocollen beschreven in protocolsectie 5, werden cellen uitgebreid gewassen om overtollige kleurstof te verwijderen, gefixeerd met PFA en immunogekleurd met een anti-HA-antilichaam om de uitgescheiden SseJ-F10TCO-HA te visualiseren. De SseJ-F10TCO-HA uitgescheiden in het cytoplasma van HeLa-cellen werd gelabeld met JF646-Tz (figuur 5A, B, rood) en duidelijk gelokaliseerd met de HA-tag (groen). De observatie dat de twee labels elkaar overlapten (de ene een fluorescerende kleurstof, de andere gelabeld door immunostaining), benadrukt verder de specificiteit van GCE-etikettering.
Om ervoor te zorgen dat het fluorescentiesignaal dat in die HeLa-cellen werd waargenomen alleen specifiek was voor de uitgescheiden effector SseJ, infecteerden we cellen met wild-type Salmonella (dragend psseJ-HA) in aanwezigheid van TCO * A en pEVOL-PylRS-AF. Een klikkleurstof werd gebruikt om te observeren of er achtergrondlabels in de HeLa-cellen waren. SseJ werd vrijgegeven in het cytoplasma van de gastheercel, zonder intracellulaire of niet-specifieke fluorescerende signalen (figuur 5C), wat aantoont dat het fluorescentiesignaal specifiek was voor SseJ. Na te hebben vastgesteld dat ncAAs specifiek waren opgenomen in een amberkleurig codon, en dat uitgescheiden SseJ via de klikreactie in de gastheercel kon worden gevisualiseerd, was het volgende doel om een superresolutiebeeld van uitgescheiden SseJ in HeLa-cellen te maken (figuur 6). In figuur 6 demonstreren we de kracht van GCE en het gebruik van de JF646-kleurstof om locatiespecifieke superresolutiebeelden van de Salmonella-uitgescheiden effector SseJ in HeLa-cellen te genereren.
Figuur 1: Schema voor locatiespecifieke fluorescerende etikettering van SPI-2-effectoren. A) TCO*A en JF-646-tetrazine. (B) Het schema toont de integratie van een ncAA in een SPI-2-effector. In de bacteriële cel wordt een plasmide ingebracht met daarin het gen voor een effector POI (paars) en een orthogonaal suppressor tRNA (rood)/aminoacylsynthetase (groen). Een inheems codon wordt verwisseld met een amberkleurig (TAG, rood) stopcodon in de effectorgensequentie op een permissieve locatie. De ncAA (donkerrode cirkel) wordt eenvoudig in het groeimedium ingebracht. Het wordt vervolgens opgepikt door de cel en bereikt het cytosol, waar het wordt gekoppeld aan het orthogonale tRNA door het aminoacyl-tRNAsynthetase (). Het ncAA-geacyleerde tRNA met een CUA-anticodon komt de ribosomale machinerie binnen als gevolg van het complementaire amberkleurige codon op het effector mRNA (paars), waarbij de aangehechte ncAA in de effector wordt opgenomen. De ncAA wordt gedragen door de volledige polypeptideketen van de effectorplaats, die vervolgens vouwt en assembleert tot een functioneel effectoreiwit. De nieuw geproduceerde effector wordt via de T3SS in de gastheercel getransloceerd. Een extern geleverde fluorofoor kan worden gebruikt om een uitgescheiden SPI-2-effector te labelen die is geïntegreerd met ncAA. (C) Kopervrij klikreactieschema met een fluorogene tetrazinekleurstof. Via de SPIEDAC-klikreactie reageert een ncAA met een gespannen alkeengroep opgenomen in een POI (SseJ) met een tetrazine-gekoppelde kleurstof (JF646-Tz). De fluorogene, tetrazine-gekoppelde kleurstof JF646-Tz wordt pas fluorescerend (rood) na succesvolle etikettering. Afkortingen: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; ncAA = niet-canoniek aminozuur; T3SS = type drie secretiesysteem; SPI-2 = Salmonella pathogeniteit eiland 2; POI = eiwit van belang; SPIEDAC = spanningsgepromoveerde inverse elektronenvraag Diels-Alder cycloadditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:TCO*A is locatiespecifiek opgenomen in SseJ-F10TCO-HA, uitgedrukt in E. coli. (A) Met Coomassie gekleurd SDS-PAGE bevestigt de selectieve opname van TCO*A in SseJ-F10TCO-HA (aangegeven met een rode pijl) in E. coli. B) Expressie van SseJ-F10TCO-HA in E. coli geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie bij afwezigheid (boven) of aanwezigheid (onder) van 1 mM TCO*A. E. colicellen die SseJ-F10TCO-HA tot expressie brengen in afwezigheid of aanwezigheid van TCO*A worden geïncubeerd met BDP-Fl-tetrazine en afgebeeld op BDP-fluorescentie (groen). SseJ-fluorescentie (groen) wordt alleen waargenomen in aanwezigheid van het ingebouwde TCO*A-label; Let op de afwezigheid van achtergrondfluorescentie in het bovenpaneel. Schaalbalk = 2 μm. Afkortingen: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = helderveld; HA = hyaluronzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: TCO*A is locatiespecifiek opgenomen in SseJ-F10TCO-HA, uitgedrukt in Salmonella. Fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de expressie van SseJ-F10TCO-HA in Salmonella te onderzoeken in afwezigheid (boven) of aanwezigheid (onder) van 1 mM TCO*A. Salmonella die SseJ F10TCO-HA tot expressie brengt, wordt behandeld met JF646-Tz en afgebeeld op JF646-fluorescentie (magenta), in aanwezigheid of afwezigheid van TCO*A. Fluorescentie van SseJ (magenta) wordt alleen gedetecteerd wanneer TCO*A aanwezig is. Schaalbalk = 2 μm. Afkortingen: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = helderveld; HA = hyaluronzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Uitgescheiden SseJ-J10TCO-HA is functioneel. (A) HeLa-cellen zijn geïnfecteerd met Salmonella die gedurende 16 uur psseJ-HA herbergt, gefixeerd en immunogekleurd met anti-HA-antilichaam (rood), LPS (groen) en DAPI (blauw). Zoals verwacht wordt de vorming van SseJ-afhankelijke SIF's waargenomen in geïnfecteerde cellen. (B) Bij afwezigheid van TCO*A wordt het amberkleurige codon niet onderdrukt en zijn SseJ-afhankelijke SIF's afwezig in geïnfecteerde HeLa-cellen. HeLa-cellen zijn geïnfecteerd met Salmonella die SseJ-F10TCO-HA tot expressie brengt in afwezigheid van TCO * A gedurende 16 uur, gefixeerd en immunogekleurd met anti-HA-antilichaam (rood), LPS (groen) en DAPI (blauw). (C) SseJ-afhankelijke SIF's worden waargenomen in aanwezigheid van TCO*A. Geïnfecteerde HeLa-cellen met Salmonella die SseJ-F10TCO-HA tot expressie brengen in aanwezigheid van 400 μM TCO*A zijn gefixeerd en immunogekleurd met anti-HA-antilichaam SseJ (rood), LPS (groen) en DAPI (blauw). SseJ-afhankelijke SIF's worden waargenomen in het linkerpaneel, wat duidelijk aangeeft dat SseJ werd gered door de expressie van sseJ-F10TCO-HA met behulp van GCE. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: HA = hyaluronzuur; LPS = lipopolysaccharide; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; SIFs = salmonella-geïnduceerde filamenten; GCE = genetische code uitbreiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Etiketteringsspecificiteit van SseJ met JF646-Tz-kleurstof. (A) HeLa-cellen zijn geïnfecteerd met Salmonella die SseJ-F10TCO-HA tot expressie brengt in aanwezigheid van 400 μM TCO*A. TCO-gelabeld uitgescheiden SseJ-F10TCO-HA is gelabeld met 2 μM JF646-Tz in 1x PBS met 1% caseïnenatriumzout uit rundermelk, uitgebreid gewassen, gefixeerd en immunogekleurd met anti-HA-antilichaam om de uitgescheiden SseJ (groen) te visualiseren. SseJ-F10TCO-HA wordt uitgescheiden en gelabeld met JF646-Tz-kleurstof (rood, linkerpaneel). SseJ gelabeld via GCE (rood) en HA (groen) zijn duidelijk gelokaliseerd (rechterpaneel). (B) Met behulp van een iets ander etiketteringsprotocol wordt TCO-gelabeld uitgescheiden SseJ-F10TCO-HA ook gelabeld met 2 μM JF646-Tz in volledig medium DMEM (zonder FBS), uitgebreid gewassen en gefixeerd, en onderworpen aan anti-HA immunofluorescentiekleuring. Uitgescheiden SseJ-F10TCO-HA is gelabeld met JF646-Tz-kleurstof (rood, linkerpaneel) en gelokaliseerd met HA (groen). (C) Om verder vast te stellen dat het fluorescentiesignaal uniek is voor SseJ en niet een product is van andere SPI-2 vrijgegeven eiwitten, zijn HeLa-cellen geïnfecteerd met wild-type Salmonella met psseJ-HA en pEVOL-PylRS-AF, in aanwezigheid van ncAA (TCO *A). 16 h na infectie worden geïnfecteerde HeLa-cellen behandeld met 2 μM JF646-Tz in volledig medium (zonder FBS en TCO*A) en wordt de overtollige kleurstof grondig verwijderd met behulp van nieuw groeimedium. HeLa-cellen zijn PFA-gefixeerd en grondig gewassen met PBS voordat ze immunogekleurd worden voor SseJ (groen). Het ontbreken van een zichtbaar achtergrondfluorescentiesignaal in het linkerpaneel (JF646-Tz) geeft aan dat er bijna geen off-target labeling plaatsvond in de gastheercellen. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: HA = hyaluronzuur; PBS = fosfaat gebufferde zoutoplossing; FBS = foetaal runderserum; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; SIFs = salmonella-geïnduceerde filamenten; GCE = uitbreiding van de genetische code; SPI-2 = Salmonella pathogeniteit eiland 2; BF = helderveld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Superresolutiebeeldvorming van GCE-gelabelde SseJ in HeLa-cellen. HeLa-cellen zijn geïnfecteerd met Salmonella die SseJ-F10TCO-HA tot expressie brengt in aanwezigheid van 400 μM TCO*A. TCO-gelabeld uitgescheiden SseJ-F10TCO-HA wordt gelabeld met 2 μM JF646-Tz onder fysiologische omstandigheden zoals beschreven in het protocol en vervolgens uitgebreid gewassen. Beelden worden verkregen met Nikon N-STORM. (A) Brightfield-afbeelding van een HeLa-cel onder observatie. Schaalbalk = 10 μm. (B) Diffractie-beperkt, breedveldbeeld van uitgescheiden SseJ gelabeld met TCO*A en JF-646. Schaalbalk = 10 μm. (C) Overeenkomend dSTORM-beeld van de met SseJ versierde SIF's. Schaalbalk = 10 μm. C(i) Inzet toont een vergrote weergave van superopgeloste SseJ in het gedooste gebied. Schaalbalk = 1 μm. Afkortingen: HA = hyaluronzuur; TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; SIFs = salmonella-geïnduceerde filamenten; GCE = uitbreiding van de genetische code; WF = breedveld; BF = helderveld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Oplossingen. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hierin beschreven aanpak werd gebruikt om de precieze locatie te volgen van effectoreiwitten die na infectie door de bacteriële T3SS in de gastheercel werden geïnjecteerd. T3SS'en worden gebruikt door intracellulaire pathogenen zoals Salmonella, Shigella en Yersinia om virulentiecomponenten in de gastheer te transporteren. De ontwikkeling van superresolutiebeeldvormingstechnologieën heeft het mogelijk gemaakt om virulentiefactoren te visualiseren met een voorheen onvoorstelbare resolutie12,13,24. Bepaalde etiketteringsbeperkingen verhinderden echter een diepgaander onderzoek, omdat foto-activeerbare eiwitfusies de T3SS-porie blokkeren en niet worden uitgescheiden. Bovendien kunnen clusteringartefacten en foutieve analyse het gevolg zijn van de inherente neiging van een fusie-eiwit om te clusteren of te aggregeren.
In sommige gevallen wordt het fusie-eiwit ook gesplitst, zoals we eerder hebben waargenomen met PAmCherry-SsaP12,13. Al deze beperkingen worden overwonnen door GCE, dat locatiespecifieke fluorescerende etikettering van POI's mogelijk maakt. Het maakt ook de visualisatie mogelijk van eiwitten die niet overvloedig zijn12,13. Hoewel er een aantal factoren zijn die de efficiëntie van ncAA-opname kunnen beïnvloeden met behulp van een orthogonaal tRNA / aminoacyl-tRNA-synthetasesysteem, lijkt het erop dat de codoncontext het meest cruciaal is. Het orthogonale tRNA bevat een ncAA het meest efficiënt wanneer de voorkeurscodoncontext AATTAGACT33 is. In figuur 5 kunnen we de scherpe etikettering als gevolg van GCE en een locatiespecifieke fluorofoor (evenals de afwezigheid van achtergrond) vergelijken met immunostaining van een HA-tag.
Als gevolg hiervan zullen onderzoekers in staat zijn om POI's in pathogenen, commensale bacteriën en eukaryote gastheren te visualiseren met behulp van de hier beschreven methode. Kortom, genetisch gecodeerde ncAAs bieden een alternatieve benadering van effectoreiwitetikettering wanneer conventionele methoden falen. Een belangrijke beperking van deze methode is echter de inherente chemische eigenschappen van de fluorofoor, zoals membraandoorlaatbaarheid, distributie en retentie, die de efficiëntie van fluorescerende etikettering kunnen beïnvloeden. Fluorescerende ncAAs zijn een alternatieve optie om klikreacties te voorkomen12, maar deze kunnen alleen worden gevisualiseerd met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Lezers worden verwezen naar een lijst van celmembraandoorlatende / ondoordringbare kleurstoffen die hierin worden aangehaald 12,38,39,40,41.
Tot slot hebben we salmonella uitgescheiden effector SseJ ter plaatse gelabeld en gevisualiseerd door genetisch te coderen voor ncAAs in combinatie met een fluorogene fluorofoor zonder de biologische functie ervan aan te tasten. Het labelen van SseJ met JF646-Tz was zeer specifiek en beeldvorming met superresolutie kan verder worden gebruikt om uitgescheiden effectoren in gastheercellen te visualiseren. Fluorescerende etikettering van bacteriële effectoren met behulp van dSTORM-compatibele kleurstoffen en genetische code-uitbreiding maakte dus de subcellulaire ruimtelijke lokalisatie van bacteriële uitgescheiden effectoren in gastheercellen mogelijk, met een resolutie onder de diffractielimiet. Omdat dit etiketteringsplatform compatibel is met live-cell imaging single particle tracking, zal onze methode het mogelijk maken om effectoreiwitten van het T3SS-systeem te analyseren met ongekende niveaus van temporele en ruimtelijke resolutie, wat ons moleculaire begrip van bacteriële pathogenese zal verbeteren.
Hoewel er bepaalde beperkingen zijn, zoals een slechte ncAA-opname-efficiëntie en de fotofysische beperkingen van de organische fluorofoor, hebben we aangetoond dat deze aanpak onderzoekers kan helpen bij het observeren en lokaliseren van een uitgescheiden effector in gastheercellen, zelfs als het schaars is12,13. We verwachten dat aanpassing van de technologie nieuwe en opwindende mogelijkheden zal bieden voor beeldvorming en onderzoek naar andere effectoreiwitten die door bacteriën worden geproduceerd tijdens infectie. De methode is ook gemakkelijk aan te passen voor het labelen van virussen, wat het brede nut ervan aantoont.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door start-upfondsen van de University of Texas Medical branch, Galveston, TX, en een Texas STAR-prijs voor L.J.K. Wij danken Prof. Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Duitsland) voor plasmide pEVOL-PylRS-AF. Afbeeldingen in figuur 1 zijn gemaakt met BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
References
- Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
- LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
- Galan, J. E., Waksman, G.
- Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
- Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
- Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
- Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
- Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
- Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
- Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
- Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
- Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
- Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
- Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
- Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
- Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
- Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
- Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
- Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
- Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
- Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
- Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
- Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
- Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
- Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
- Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
- Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
- Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
- Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
- Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
- Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).
